Os autores gostariam de agradecer e reconhecer o Conselho de Pesquisa Médica para o financiamento desta pesquisa - MRC-FAP código concessão G1000788-98812.

Fabrication 1.Scaffold e Esterilização <ol><li> Dissolve-PCL em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol para dar um 10% w concentração / v. Tal como descrito em Bosworth et al, 9 electrospin solução polimérica (parâmetros: 20 kV, 1 ml / h, 20 cm). E recolher fibras alinhadas na extremidade de um mandril rotativo (600 rpm). Com um bisturi remover a fita de fibra recolhido e, em seguida, cortado em comprimentos mais curtos - 3 cm (para calhas e vasos rotativos) e 4 cm (para inserções de cultura de células) comprimentos. </li><li> Usando fórceps finos submergir tiras individuais em água destilada e remover. </li><li> Segurando as duas extremidades entre o polegar eo indicador; torcer manualmente a banda até que se assemelha a discussão. </li><li> Resumidamente submergir este andaime do tipo fio em água destilada e colocar no cartão limpo, não fibrosas para secar. </li><li> Depois de seco, realiza individualmente em tubos de microcentrífuga limpo e adicionar 1 ml de 50% v / v de etanol em água destilada. Fechar as tampas e deixe por 24 hr. Nota: Execute as seguintes etapas em fluxo laminar: </li><li> Colocar em tubos de microcentrífuga de uma câmara de fluxo laminar e aspirar a solução de v / v de 50%. Substituir com 1 ml de 70% v / v de etanol em água destilada, tampas de fechar e deixar durante 24 horas. </li><li> Repetir para 90% e 100% v / v de etanol em água destilada (1 ml de volume). </li><li> Lavar andaimes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), 24 h por lavagem (2 x 1 ml). </li><li> Remover PBS e substitua com 1 ml de meio de cultura de células. Nota: Os andaimes estão prontos para uso pós-24 hr. </li></ol> 2. Determinar Area Andaime superfície e número de células <ol><li> Usando um microscópio de luz e o software de imagem, medir o diâmetro do fio electrospun ao longo do seu comprimento para determinar um valor significativo. </li><li> Assuma que o fio de ser uma haste cilíndrica e aproximar a área de superfície utilizando: </li><li> Onde A = área de superfície, r = raio e h = comprimento Nota: A área de superfície foi calculada como sendo de 18.902, 800 mm 2. Além disso, deve notar-se que a área de superfície real será superior a este cálculo, o fio é composto por centenas de fibras finas, o que irá aumentar a área de superfície. Consequentemente, um número maior de células deve ser capaz de anexar ao cadafalso. No entanto, isto não afecta a uma comparação directa entre os grupos de teste a ser feito. </li><li> Determine o número máximo de células que poderia anexar à superfície andaime expostos por: Nota: Usando um microscópio de luz e o software de imagem, o diâmetro de células estaminais mesenquimais humanas foi determinada como sendo de 20 um (assumindo que as células são redondas), portanto, neste caso, o número de células = 60.200. </li></ol> 3. Andaime Set-up - Cultura Celular inserções (Figura 1A) <ol><li> Sob fluxo laminar, aberto estéreis as inserções de 6 poços de cultura de células e separar os anéis com dentes mais curtos a partir dos corpos em anel mais largo. </li><li> Pegue o anel com dentes apontando para cima. Armar umados quatro centímetros andaimes sobre o centro do anel de ter certeza que ele se sobrepõe em ambos os lados. Tirar o corpo e a posição dos anéis sobre o anel dentado e andaime e empurrar para baixo para garantir que o andaime fica em posição e encontra-se através do centro da inserção de cultura de célula. </li><li> Coloque a inserção de cultura de células com o andaime no poço de um de 6 poços, baixo placa de ligação. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de cultura para o andaime. </li></ol> 4. Andaime Set-up - Trough (Figura 1B) <ol><li> Sob fluxo laminar, local de poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) calhas individuais em placas de petri e adicionam-se 10 ml de meio de cultura para a calha. </li><li> Usando fórceps armar um dos três centímetros andaimes para a calha, assegurando-se o seu comprimento situa-se paralelamente ao longo da calha de borda. </li></ol> 5. Andaime Set-up - Bioreactor Vessel (Figura 1C) <ol><li> Sob fluxo laminar, dispensar 10 ml de PBS estéril através do bioreactor de navioprincipal porto e deixe por 10 min. </li><li> Retire a PBS e substituir com 8 ml meios de cultura. </li><li> Usando pinças, inserir um dos suportes 3 centímetros para dentro do recipiente através da porta principal. </li><li> Fechar a porta principal. </li></ol> Contando 6. celular <ol><li> As células estaminais mesenquimais humanas de cultura (hMSC) derivadas de medula óssea de acordo com o protocolo do fabricante até 4 passagens, antes da colheita. </li><li> Aspirar a mídia a partir de um 75 centímetros 2 frasco contendo hMSCs derivadas da medula óssea (passagem 4, 80% de confluência). </li><li> Lavam-se as células com 10 ml de PBS estéril e aspirado. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina e incubar o balão a 37 ° C, 5% de CO2 até as células terem desalojado da superfície do frasco. </li><li> Adicionar 7 ml de meio de cultura para inactivar a enzima e transferir esse volume total (10 ml) para um tubo de centrífuga. </li><li> Ressuspender desta suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes para dispersar de forma homogénea no interior da célulasmeios de comunicação e aglomerados celulares limite (10 ml de pipeta). </li><li> Remover 20 pi de suspensão de células e transferir para um hemocitómetro. </li><li> Coloque o hemocitï¿½etro sob um microscópio e imagem luz no objetivo x10. </li><li> Concentre-se as linhas de grade e contar o número de células nos 4 x 4 quadrados em cada canto da rede e que se inserem no quadrado e aqueles que atravessam a mão direita ou linha de limite inferior. Contagem para cada conjunto de 4 x 4 quadrados (quatro contagens por grade). </li><li> Repita a ressuspensão e celular contagem três vezes (passos 6,6-6,9). </li><li> Calcula-se a média da contagem de células e determinação do volume de material necessário para a ressuspensão de células (concentração de células 60.200 em 200 ul). Por exemplo, determinar a contagem média de células do hemacitómetro e depois determinar o número médio total de células a partir dos três contagens separadas. Multiplicar este por 1 x 10 4 para indicar o número de células por ml e, em seguida, multiplica-se por o volume total de suspensão de células para dar anúmero tal de células. Utilize a seguinte equação para determinar o volume de mídia necessária para a ressuspensão: </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 241 xg durante 5 min. </li></ol> Sementeira 7. celular <ol><li> Aspirar a mídia do tubo centrifugado deixando o pellet celular e substituir com o volume de mídia calculado. </li><li> Ressuspender as células e os media para uma misturar mesmo. </li><li> Usando uma pipeta Gilson P200, dispensar lentamente 200 ul de suspensão celular em cada andaime rodando a ponta da pipeta ao longo do comprimento do andaime e abaixo da superfície do líquido de suporte. Deixe em repouso por 20 min. </li><li> Para as embarcações de biorreatores, dispensar 200 mL de suspensão de células através da porta principal. Parte-se do meio de cultura de 2 ml remanescente através das portas de seringa para dar um volume total de 10 ml. </li></ol> 8. Experimental Iniciar <ol><li> Transfira os vasos de biorreatores para o biorreator RCCS-4DQ e definir a rodar a 9 rpm. </li><li> TransFer as placas bem com inserções de cultura de células e os cavados para o agitador de placas, e por rodar a 30 rpm. </li><li> Transferem-se as placas bem com inserções de cultura de células e as calhas para a prateleira de uma célula incubadora fixada em 37 ° C, 5% de CO 2 (cultura estática). </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Preparar soluções - tampão de lise, 1x tampão TE, padrões de ADN e de solução de trabalho DNA celular - conforme as instruções do fabricante. </li><li> Após 4 horas, remover as amostras da incubadora e colocar sob fluxo laminar. </li><li> Retire as frações de mídia de todas as amostras e coloque em tubos de centrífuga marcados separadamente. Centrifugar os tubos 241 xg. Remover o sobrenadante e adicionar 3 ml de tampão de lise. Ressuspender a solução para quebrar-se o sedimento de células. </li><li> Utilizando uma pinça remover os andaimes e coloque em tubos de centrífuga contendo 3 ml de tampão de lise (para os andaimes no interior dos vasos de biorreatores, remova o andaime antes de aspirar o media). Para andaimes realizadas na inserções de cultura de células, em primeiro lugar libertar o andaime cortando o andaime perto da borda da inserção usando um bisturi. </li><li> Adicionar 3 ml de tampão de lise a cada recipiente de andaime e raspe a superfície (vigorosamente para agitar os recipientes reactores biológicos). Remover o tampão de lise e colocar em tubos de centrífuga rotulado separadamente. </li><li> Vortex de cada tubo de centrifugação durante cerca de 1 min para assegurar a agitação suficiente das células e o tampão e para estimular a lise da membrana celular. </li><li> Em um preto placa de 96 poços, adicione 100 ml de tampão de lise para cada fração amostral - andaime, mídia e bem (duplicar). </li><li> No escuro, adicionar 100 uL de solução de ADN celular de todos os poços contendo tampão de lise, e misturar suavemente. </li><li> Incluem os poços com tampão de lise contendo nenhuma solução de ADN e ADN de células para proporcionar um controlo negativa e positiva para o poço de placa. </li><li> Utilizando um leitor de placas de fluorescência, mede-se a absorvância do poços usando excitação a 485 nm e 520 nm de emissão. </li><li> Comparar os dados com a curva padrão gerada a partir dos padrões de ADN conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 10. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) Fixação <ol><li> Execute as seguintes etapas sob fluxo laminar: Após 4 horas, remover todos os scaffolds de seus recipientes e lugar dentro de uma nova placa de 6 poços (poços separados). </li><li> Lavar os andaimes duas vezes com PBS. </li><li> Execute as seguintes etapas no banco aberto: Para cada poço, adicione 2 ml de 1,5% v / v em PBS para garantir a cobertura completa do andaime. </li><li> Deixar a placa para um mínimo de 30 min a 4 ° C durante a fixação das células. </li><li> Remover a solução fixadora e lavam os andaimes duas vezes com PBS. </li><li> Desidratar os andaimes com concentrações crescentes de etanol em água destilada começando com 50% v / v, seguido por 70% v / v e 90% v / v. Para cada concentração, mergulhe totalmente os andaimes em solution (2 ml) e deixar durante 3 min. Descartar a solução e repita. </li><li> Desidratar em etanol a 100% por submergir completamente os suportes na solução (2 ml) e deixando durante 5 min. Descartar a solução e repita. </li><li> Quimicamente secar os scaffolds usando hexametildisilazano (HMDS) dentro de um exaustor. Mergulhe os andaimes em HMDS (2 ml) e deixe por 5 min. Retire os HMDS e repita. </li><li> Remover os HMDS e permitir que os andaimes para secar. Monte os andaimes sobre tocos SEM comercialmente disponíveis (neste caso topos de aço inoxidável com abas adesivas de carbono). </li><li> Para facilitar a visualização dentro do SEM, revestem-se as amostras usando um aplicador de ouro por borrifamento de 2 min para garantir uma cobertura fina e uniforme. </li><li> Colocar as amostras dentro do SEM e visualizar os scaffolds de células-semeado usando um feixe de elétrons 5 KeV. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Matrizes de fibra electrospun fabricados a partir de biopolímeros são regularmente utilizados para apoiar a fixação das células e proliferação de biomateriais e / ou aplicações de engenharia de tecidos 11,12. Nestes casos, as matrizes são muitas vezes folhas finas de fibras que facilmente cobrir toda a base de uma placa de cultura de células e, assim, estão em contacto total com células semeadas que melhora a fixação das células. No entanto, se o cadafalso biomaterial não cobrir totalmente a base da placa bem, há uma grande chance de que uma grande proporção das células semeadas não vai ficar em contato com o cadafalso e, finalmente, não será capaz de anexar. Este estudo investigou vários métodos diferentes para a sementeira de células para andaimes que não cobrem a base da placa com cavidades, a fim de determinar uma técnica optimizada que pode ser recomendado para experiências futuras baseados em células. Cinco diferentes set-ups foram investigados (Figura 1): ScaffoLDS (fio electrospun), realizada utilizando inserções de cultura de células dentro de placas de baixo bem ligação e ou mantidos sob condições estáticas ou agitado em 30 rpm; andaimes colocados dentro calhas PTFE estreitas e detidos estática ou abaladas em 30 rpm; e andaimes alojado dentro de vasos de biorreatores rotativas às 9 rpm. Determinar o número de células que tinham aderido aos fios electrospun por ensaio DNA demonstrou um baixo percentual de fixação para todos os semeando set-ups (Figura 2); e isto foi confirmado a partir de micrografias de varredura por electrões (SEM) (Figura 3). Fixação das células maior - 30% ou ~ 18.060 células -foi observado para os fios que foram realizadas dentro de inserções de cultura de células e sujeitos a movimento contínuo. Curiosamente, menor a fixação das células (15%) foi obtida para os fios mantidos por inserções de cultura de células, mas mantidos sob condições estáticas, o que sugere que a inclusão de movimento radial tem um efeito positivo sobre a manter as células em contacto com o andaime. No entanto,deve notar-se que circulando contínua de fluxo dos meios de comunicação pode ser responsável por aglomerados de células observadas a partir das imagens de SEM. O agitador de placas foi definido em sua configuração mais baixa - 30 rpm - o que poderia ser uma limitação para este set-up. Usando um movimento radial mais lenta pode ajudar a prevenir ou reduzir a aglomeração de células e também pode melhorar a fixação das células como células experimentará menos força. Experimentos futuros devem se concentrar em otimizar a velocidade do agitador ideal para uma melhor fixação das células. Incorporando movimento para fios realizadas dentro das calhas não resultou em uma tendência semelhante, com ambos os cenários produzindo 18% de fixação (~ 10.836 células); embora isto possa ser devido à flutuação parcial dos andaimes no interior das calhas (observada durante calhas colocadas no agitador de placas) por não terem sido ancoradas à base. Flutuante parcial do andaime vai impedir quaisquer células que se afundaram para o fundo da calha a partir de terem entrado em contacto com o material e aderente. Para tseu especial set-up, o cocho foi alojado dentro de um prato de petri e um volume total de 10 ml de media acrescentou. As pequenas dimensões da calha significa que a maior parte dos meios de comunicação está presente no interior da placa de petri e se houver qualquer movimento, as células podem afastar-se a partir da calha para a placa de petri e permanecer completamente fora do alcance do andaime. Para superar estas limitações, as experiências devem incluir um passo extra no protocolo, através do qual as extremidades dos andaimes são fixadas à base das calhas utilizando agulhas estéreis-finas, como este deve evitar a sua flutuação e movimento (particularmente para andaimes expostos a movimento radial), o que, em última análise deve levar a um aumento do número de células inerentes ao cadafalso. 16% de células tinham ligado aos fios presentes no interior dos vasos rotativos. Apesar de ser uma técnica bem estabelecida para a cultura 3D, os problemas que surgem com a remoção de andaimes do porto principal dos vasos, o que pode ter resultado em ATTAC vagamentecélulas HED sendo perdida. Os navios que pode ser totalmente aberto eliminaria este problema; estes estão disponíveis para aquisição, mas são consideravelmente mais caros do que os recipientes descartáveis ​​utilizados neste estudo. Este estudo demonstra os problemas atuais com a semeadura andaimes que não cobrem toda a base de placas de cultura de células normais. Semeando um número de celular conhecido resultou em menos de um terço de fixação para o cadafalso, apesar de a área de superfície do andaime permitindo a todas as células para aderir. Isto pode ter consequências prejudiciais em outros ensaios baseados em células, que pode avaliar o comportamento biocompatibilidade e célula-célula-célula de material / e interacções com a escora, tal como um potencial futuro dispositivo médico. As limitações do estudo podem incluir o ponto de momento de 4 h - apesar de ser suficientemente longo para garantir a sementeira inicial de células (células foram mostrados para prender firmemente a substratos dentro de trinta minutos 13,14,15), pode ser razoável emterrogam posteriores pontos temporais fornecimento de células não proliferam durante um espaço de tempo mais longo como este, de outra forma distorcer o número de células de partida. A redução do volume do meio, neste caso, 10 ml, poderiam também melhorar o contacto entre as células e andaime e, finalmente, aumentar a aderência celular. Futuros estudos devem considerar também a viabilidade celular como o processo de semeadura de células pode causar danos às células e / ou morte celular 16. Ensaios de ADN celular não diferenciar entre células viáveis ​​e não viáveis, como a / ensaio mortos tal ao vivo, por exemplo, gostaria de destacar o nível de viabilidade. Esta investigação aumenta a consciência para o número real de células que se ligam ao cadafalso apesar semeando uma quantidade conhecida. Para os estudos que se baseiam no número inicial de células, é muito importante que os pesquisadores sabem exatamente quantas daquela figura de fato aderir ao substrato de interesse.

Os andaimes são rotineiramente sendo desenvolvidos e pesquisados ​​para aplicações de biomateriais e engenharia de tecidos. Como tal, eles são vulgarmente semeadas com células e o seu comportamento in vitro, caracterizadas através de ensaios que determinam a proliferação celular e o número de células, por exemplo. Para experiências como essas, é imperativo que o número de células inicial é conhecida e pesquisadores freqüentemente a máxima concentração de semeadura, em termos de número de células por ml ou cm 2. Enquanto isto é uma boa prática, especialmente para fins de aumento de escala, que não tem em conta o número real de células que aderem à superfície de andaime (que também é dependente das propriedades adesivas da superfície do biomaterial 1). Isto é especialmente verdadeiro para os andaimes que não cobrem toda a base da célula de cultura bem como placa de células poderiam cair fora da construção e, devido à natureza muitas vezes estática do experimento, pode nunca mais voltar em contacto com o material de interesto. Fios de fibra electrospun são um bom exemplo de um andaime que não cobre a base da cavidade (Figura 1A). Neste caso, os baixos placas de poços de ligação que não foram tratados à superfície deve ser usada para evitar que as células de se ligarem à superfície da placa e, consequentemente, distorcem os resultados de qualquer ensaio bem fundamentada. Poços são facilmente utilizados para semeadura de células para andaimes, mas eles não são o único método disponível. Sistemas de cultura de células do Rotary, um tipo de biorreator desenvolvido pela Divisão de Ciências da Vida da NASA no final de 1980, da mesma forma pode ser usado para semear andaimes dentro de um ambiente tridimensional (3D) com microgravidade simulada. Este tipo de biorreator continua a ser uma escolha popular entre os pesquisadores em todo o mundo e tem sido incorporada nos estudos para a sinalização celular 2,3, as células estaminais e engenharia de tecidos de 4,5 6,7. O que faz com que o bioreactor rotativo preferível placas de poços é a manutençãode um ambiente 3D, o que ajuda a evitar que as células diferenciadas de dedifferentiating, como é frequentemente o caso quando cultivadas dentro de condições 2D convencionais 8. Este artigo investiga técnicas diferentes para sementeira de células estaminais mesenquimais humanas em electrospun poli (ε-caprolactona) como fios de fibra fabricada em Bosworth et al., 9, a fim de maximizar o número inicial de células ligadas a estes esqueletos dentro de um período de 4 h. Para a cultura 2D, os fios foram solidamente mantidos dentro de poços ou feitos sob medida de poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) calhas e mantidos em condições estáticas, ou agitado em 30 rpm. Para a cultura 3D, fios e células foram realizadas dentro dos vasos de biorreatores rotativas às 9 rpm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>in-house supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1117271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70013016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-12974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture media</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-28010B</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement mix</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-39810</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimyotic mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59417C</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks (T75)</td>
			<td>Becton Dickinson Ltd</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding 6-well plates</td>
			<td>Costar Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well CellCrowns</td>
			<td>Scaffdex</td>
			<td>C00003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish 50 ml deep</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE troughs</td>
			<td>in-house production</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker plate</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SSM1</td>
			<td>Mini Orbital Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>Digital Bio</td>
			<td>DHC-F01</td>
			<td>Disposable C-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>352096, 429901</td>
			<td>15 ml and 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotafix 32 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 ml</td>
			<td>Shield Medicare Ltd</td>
			<td>3039820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>40305, 47310, 40125</td>
			<td>5, 10 and 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td>
			<td>P2 - P1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>SLS</td>
			<td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro test tube 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoGreen Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>Assay set-up in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate-reader</td>
			<td>BGM Labtech</td>
			<td>FLUOstar Optima</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %</td>
			<td>TAAB Laboratories</td>
			<td>G002</td>
			<td>Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>999-97-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium stubs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon tabs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold sputter coater</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>S150B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom World</td>
			<td>Phenom Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

A investigação sobre biomateriais e engenharia de tecidos, muitas vezes inclui investigações in vitro baseados em células, que exigem conhecimento inicial do número de células de partida. Enquanto os pesquisadores comumente referenciar a sua densidade de semeadura isso não indica necessariamente o número real de células que aderiram ao material em questão. Este é particularmente o caso dos materiais, ou andaimes, que não cobrem a base de placas de cultura de células padrão. Este estudo investiga a ligação inicial de células-tronco mesenquimais humanas semeados em um número conhecido em poli electrospun (ε-caprolactona) de fios após 4 horas em cultura. Fios electrospun foram realizadas dentro de vários set-ups diferentes, incluindo os navios de biorreatores rotativas às 9 rpm, inserções de cultura de células posicionadas em baixas poços de ligação e de politetrafluoretileno (PTFE) calhas colocadas dentro de caixas de Petri. Os dois últimos foram submetidos a condições tanto estáticas ou posicionado num agitador de placas (30 ° C, 5% de CO 2, o local de células semeadas foram determinados pelo ensaio de ADN da célula. Os andaimes foram removidos dos respectivos recipientes e colocados em tampão de lise. A fracção meio foi removido e centrifugado de forma semelhante - o sobrenadante descartado e o sedimento dividida com tampão de lise. O tampão de lise foi adicionada a cada recipiente, ou bem, e raspadas para libertar quaisquer células que possam estar presentes. O ensaio de DNA de células determinada a percentagem de células presentes no andaime, mídia e frações bem. A adesão celular foi baixa para todos os arranjos experimentais, com maior apego (30%) para os fios realizadas na inserções de cultura de células e sujeitas a agitação movimento. Este estudo levanta a consciência para o número real de células inerentes aos andaimes, independentemente da densidade de semeadura de células indicada.

Estes resultados indicam a localização das células seguintes quatro horas após a sementeira para cada conjunto experimental investigado. A Figura 2A demonstra a percentagem de células que têm ligado à superfície do andaime durante este tempo. Um factor de conversão de 8,5 pg / célula foi usada para converter o teor de ADN medido em número de células e, assim, determinar a percentagem de células 10. Para todos os semeadura set-ups investigado, o percentual de fixação das células é relativamente baixa, com maior aderência celular (30%) para andaimes realizadas na inserções de cultura de células e agitando a 30 rpm (Insert Shaker). Mais baixa aderência (15%) foi realizada por andaimes dentro das inserções de cultura de células e mantidos sob condições estáticas (Inserir estáticas). Um grande número de células estavam presentes dentro da fracção de media (Figura 2B), mais notavelmente para inserções de cultura de células mantidas dentro de placas de ligação (baixos) Inserir estáticas e vasos rotativos sendo 50% e 51%respectivamente. Andaimes realizada nos cochos demonstraram um elevado número de células presentes no interior do próprio titular - 48% das células para Trough Shaker e 50% para Trough estático. Microscopia eletrônica de varredura permitiram uma avaliação visual dos scaffolds de células-semeado (Figura 3). Imagens representativas em destaque uma presença limitada de células na superfície fibroso, independentemente de semear set-up. No entanto, um maior número de células e aglomerados celulares estavam presentes nos andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e agitados a 30 rpm (Inserir Shaker). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Figura 1. arranjos experimentais, onde electrospun Yarn é realizada dentro; (A) inserções de cultura de células e baixo bem placa de ligação; (B) poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) cocho e placa de Petri; e (C) navio biorreator. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Figura 2. localização das células 4 horas pós-semeadura Onto PCL electrospun Yarns utilizando diferentes Sementeira set-ups. (A) Demonstra a percentagem de células que se ligaram ao andaime PCL (média ± desvio padrão); (B) evidencia a percentagem de propagação de célula local nas três fracções - meios de comunicação, e assim andaime (n = 4, apresentado como dados Os valores médios). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. O representante Eletrônica de Varredura micrografias para PCL electrospun Yarns com mesenquimais humanas células-tronco, 4 horas após a semeadura inicial utilizando diferentes arranjos experimentais. (Todas as imagens na ampliação 1000X, barra de escala = 130 m.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K visualizações.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Bioengenharia

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun fibrosa Andaimes de Poli (glicerol-dodecanedioate) para Engenharia Neural tecidos de rato as células estaminais embrionárias

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used techniques for the development of in vivo cancer models have considerable limitations. Therefore, in this study, we aim to implement cell sheet technology to develop an in vivo cancer model. Hepatocellular carcinoma (HCC) is successfully developed in nude rats using cell sheets created from HCC cell line cells. The cancer cell sheets are generated through intracellular adhesion and the formation of a stratified structure, controlled by the extracellular matrix. This allows for the HCC sheet transplantation into the liver and the creation of a tumor-bearing animal model within a month. In addition, the role of mesenchymal stem cells (MSC) in the development of this cancer model is investigated. In addition to the HCC cell line sheet, another two cell sheets are created: a sheet of HCC cells and bone marrow MSCs (BMMSCs) and a sheet of HCC cells and umbilical cord MSCs (UCMSCs). Sheets that have a combination of both HCC cells and MSCs are also capable of producing a tumor-bearing animal. However, the addition of MSCs reduces the size of the formed tumor, and this adverse effect on tumor development varies depending on the used MSCs' source. This indicates that a cell sheet made of certain MSC subtypes could be utilized in tumor management and control.

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Here, we present a protocol to develop an in vivo cancer model using cell sheet technology. Such a model could be very useful for the evaluation of anticancer therapeutics.

Explorando o potencial das células-tronco mesenquimais folha sobre o desenvolvimento do Carcinoma hepatocelular na Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...