1 Configuração de Estéril Campo <ol><li> Don traje adequado incluindo boné e máscara. Use óculos de proteção quando na sala de processamento. </li><li> Prepare a área de processamento. Quando se utiliza um local de tratamento, manter o funcionamento contínuo do ventilador para criar uma pressão positiva no quarto. </li><li> Reúna todos os suprimentos. Verifique as datas de validade, integridade da embalagem, e indicador de esterilização. </li><li> Lavar as mãos e vestir luvas não esterilizadas. </li><li> Abra os kits estéreis para estabelecer um campo estéril. Ao utilizar uma sala de processamento, colocar os kits em cima da mesa e assepticamente abrir os wraps. Não utilizar os exteriores 1 ½ polegadas do envoltório como parte do campo estéril como este segmento é considerado não esterilizado. </li><li> Utilizando uma técnica asséptica, aberto e soltar itens estéreis sobre campo estéril, a menos que já fazem parte do pacote premade. </li><li> Mover microscópio de modo que seja acima do campo estéril, ligar fonte de luz de microscópio, e ajustar oculares como necessário. </li><li> OBTtecido da córnea ain a ser desmontado (em meio de preservação) e coloque ao lado da área de processamento estéril preparado. Solte a tampa da câmara de visionamento e deixe descansar em cima de ver a base da câmara sem fios envolvidos. Descarte as luvas não esterilizadas. </li><li> Abra um par de luvas estéreis e bata esterilizada com uma toalha. </li><li> Realize paramentação. Revesti-vos de avental estéril, em seguida, luvas estéreis. </li><li> Caixas de instrumento aberto para que todos os suprimentos são acessíveis. Abrir humidade cortina impermeável para criar a área de trabalho. </li><li> Anexar agulha para uma seringa de 5 cc. Utilizando uma tesoura cirúrgica, preparar a agulha G 30, por colocação de uma curva a 1 mm do bisel, e outra curva a 1 mm da base (de modo a formar uma forma de &quot;S&quot;). </li><li> Montar a seringa de vidro para o corante azul de tripano, colocando o êmbolo para dentro da seringa e o dedo de aperto do êmbolo. Anexar cânula. </li><li> Fixe a cânula ao frasco de solução salina balanceada (BSS). </li><li> Separe o soco trephine do bloco de vácuoe reserve. O centro do bloco de vácuo no interior do campo de visão do microscópio. </li><li> Traga o bloco de vácuo em foco, ajustando as configurações de microscópio. </li></ol> 2 Processo de Preparação tecido do doador <ol><li> Levante a tampa da câmara de visualização utilizando quadrado folha como uma barreira. Com a mão oposta e usando uma pinça, segure suavemente córnea, esclera rim para remover córnea. Recoloque a tampa da câmara de visualização. </li><li> Completamente deprimir a seringa de sucção, em seguida, coloque o lado epitelial da córnea para baixo no bloco de vácuo e garantir que ele está centrado. (Figura 1) </li><li> Gentilmente menor Lugares para o bloco de vácuo com as mensagens de orientação. Envolver-se vácuo, liberando lentamente pistão da seringa de sucção. Remova o anel de estar e reserve. (Figura 2). </li><li> Realize uma trepanação parcial para marcar através da membrana de Descemet. </li><li> Ajuste o zoom e focagem do microscópio de modo que o tecido é bem visualizado. </li><li&gt; Inclinação do bloco de vácuo e usar uma lança colocada zaragatoa estéril no limbo para remover o excesso de meio. (Figura 3) </li><li> Coloque mancha suficiente no limbo para corar a borda da membrana de Descemet marcados. Permitir que a mancha de permanecer no endotélio de 60-90 seg. (Figura 4) </li><li> Remover manchas: <ol><li> Inclinação do bloco de vácuo para verter a mancha da córnea e na almofada de gaze. </li><li> Use as lanças cirúrgicas para remover o excesso de corante da área do limbo da córnea, tomando cuidado para não tocar no endotélio. (Figura 5) </li></ol></li><li> Use algumas gotas de BSS para enxaguar a córnea de solução de coloração, e lanças swab estéril para remover o excesso de BSS. (Figura 6) </li><li> Colocar 1-2 gotas de BSS no aro esclerótica para impedir o tecido de secagem. Repita conforme necessário durante todo o procedimento. </li><li> Realize dissecação parcial da membrana de Descemet: <ol><li> Começando onde a tubulação se conectars para o bloco de vácuo, com a pinça aberta, colocar uma ponta na extremidade da marca de pontuação e membrana e endotélio suavemente separado de Descemet longe do estroma. (Figura 7). </li><li> Membrana separado de Descemet e endotélio não superior a 1 mm da margem marcou e continuar a dissecção de 360 ​​° ao redor. (Figura 8). </li><li> Nota localização de quaisquer rasgos micro colocando um ponto no bloco de vácuo, com o marcador de pele. NOTA: Se a trefina não penetrar completamente através da membrana de Descemet, utilizar a borda chanfrada da agulha G 30 preparado para completar o marcador através da membrana de Descemet, quando necessário, seguida de uma segunda aplicação de coloração conforme a necessidade. Se adesividade da membrana de Descemet está impedindo o esvaziamento parcial, remova o endotélio fora da área trepanação, conforme necessário. </li></ol></li><li> Use uma pinça para remover quaisquer etiquetas endoteliais que se sobrepõem a marca de pontuação. </li> &lt;li&gt; Considere o local de micro lágrimas marcadas anteriormente e girar o bloco de vácuo para que o maior é às 6 horas. Isso vai se tornar a dobradiça da tampa. </li><li> Usando a pinça, segure membrana de Descemet em 12 horas. Suavemente separar a membrana de Descemet do estroma por raspagem para a dobradiça. Criar a dobradiça parando a separação 2 mm da marca de pontuação. NOTA: bordas periféricas de retalho vai começar a rolar durante a separação. (Figura 9). </li><li> Cuidadosamente, coloque a tampa de volta no lugar no estroma. Use BSS e swab lanças para unscroll o endotélio e devolvê-lo à sua posição original. (Figura 10A-C) </li><li> Remover líquido residual entre a membrana de Descemet eo estroma com lanças swab estéril de modo a aba fica na posição. (Figura 11) </li><li> Use lanças swab estéril para absorver o excesso de umidade da esclera perto da dobradiça. Use o marcador pele para desenhar uman arrowhead na esclera aro que aponta para o centro da articulação, remover o excesso de tinta usando uma lança zaragatoa estéril. (Figura 12) </li><li> Soltar vácuo pressionando o êmbolo da seringa ligado ao bloco de vácuo. Enquanto o vácuo é desengatada, fórceps para remover a córnea a partir do bloco de vácuo. </li><li> Levante a tampa da câmara de visualização utilizando quadrado folha como uma barreira. Coloque a córnea na câmara de visualização, lado endotelial, e substituir a tampa da câmara de visualização. </li><li> Repita os passos acima de procedimento com o companheiro de córnea, se for o caso. Use gaze para limpar o bloco de vácuo, antes de processar o segundo tecido. </li><li> Apertar a tampa (s) da câmara de visualização e remover o tecido da área de processamento. </li><li> Quebrar o campo estéril pela eliminação de itens de acordo com o Plano de Gerenciamento de Resíduos de Risco Biológico. Retire as luvas contaminadas e vestido. Lavar as mãos e vestir luvas não esterilizadas. </li><li> Realizar pós-corte de avaliação com lâmpada de fenda e microscopia especular da córnea (s)e registrar os resultados. </li></ol>

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Hassan Tausif e Dr. Navasuja Chandrasekaran tem nada a revelar. Drs. Mian, Shtein e Woodward são diretores médicos para o Michigan Banco de Olhos. Mr. Mavin, Sr. Tito, e Ms. Johnson são funcionários da Midwest Banco de Olhos.

A camada de células endoteliais desempenham um papel crítico na manutenção da transparência córnea através de desidratação. Doenças das células endoteliais pode resultar em deficiência visual significativo. DMEK visa substituir as células endoteliais doentes com um enxerto de doador constituído por membrana e camada de células endoteliais de Descemet. Preparação de tecido do dador com um DM intacta e contagem de células endoteliais adequada são críticos para a sobrevivência do tecido do enxerto. Rasgando de DM durante a preparação do tecido do doador pode resultar em perda de tecido e desperdício de tecido do doador. Aplicação generalizada de DMEK tem sido limitado pelos desafios na preparação do tecido do enxerto e dominar a técnica cirúrgica complexa. Com melhorias na instrumentação e disponibilidade de olho banco preparado tecidos pré-cortados, esse procedimento tem o potencial para se tornar o padrão de tratamento para doenças endoteliais corneanas. As técnicas atuais para a preparação do tecido doador incluem o usode uma bolha de ar para separar o DM do estroma para facilitar a remoção do tecido do enxerto de doador de córnea 10. SCUBA (córnea submersa utilizando fundos de distância) técnica de preparo do enxerto DMEK envolve a coleta do tecido do doador sob Optisol ou solução salina balanceada (BSS), minimizando a tensão superficial e as chances de rasgar 11. Ainda outra técnica na preparação do enxerto DMEK está deixando uma borda periférica do estroma produzindo um enxerto que é mais fácil para a alça e insira 12. O tecido do doador pode também ser preparado com um trépano personalizado para deixar dobradiças de MS intacta enquanto o levantamento do enxerto com BSS 13. A taxa global de sucesso com a nossa técnica para a preparação do enxerto DMEK foi limitado em comparação com técnicas publicadas anteriormente a 76%, o que pode refletir que estes foram os primeiros 50 tecidos sendo preparados por dois técnicos bancários olho 14,15. No entanto, os resultados não melhorou na segunda metade do pre tecidopared. Além disso, a nossa técnica não exige instrumentos especializados, tornando DMEK facilmente acessíveis, assim como mais rentável. A recuperação visual pode ser mais rápido e melhor com DMEK devido à falta da interface estroma 5. Estudos também têm demonstrado menos aberrações de alta ordem na superfície posterior da córnea que DSEK ou PKP 16. A incidência de rejeição do enxerto é significativamente menor com DMEK do que com outras técnicas de ceratoplastia 17. A densidade de células endoteliais após DMEK é comparável a Stripping Automated endotelial Keratoplasty de Descemet (DSAEK) 18. DMEK oferece uma cirurgia minimamente invasiva manter a integridade estrutural do olho e reduzir o risco de astigmatismo pós-operatório, as fugas de ferida pós-operatória e glaucoma ligada à utilização de esteróides tópico prolongado. Em resumo, DMEK permite a substituição do endotélio doente sem remover destinatário estroma corneano ou adicionaltecido. A técnica cirúrgica é um desafio, em parte devido à reprodutibilidade de preparação do tecido doador. Preparação banco de olhos para DMEK pode permitir uma melhor adaptação dos DMEK semelhante às técnicas de ceratoplastia endotelial anteriores.

Endotelial Keratoplasty (EK) substituiu rapidamente ceratoplastia penetrante (PKP), como o procedimento de escolha para o tratamento de doenças endoteliais representam mais de 50% de todos os transplantes realizados nos Estados Unidos em 2012 6. PKP é limitada pela reabilitação visual prolongado com alto astigmatismo e instabilidade de refração, perda da integridade globo e complicações relacionadas à sutura. Procedimentos EK primeira geração, incluindo profunda lamelar endotelial Keratoplasty (dlek) envolvidos dissecção Manual do estroma corneal com transplante de tecido doador espessura parcial. Estes procedimentos foram bem sucedidos em transplante de tecido endotelial doador, mantendo uma superfície da córnea intacta, mas eram tecnicamente desafiador e resultou na limitado melhor acuidade visual corrigida, devido a uma córnea irregular de interface lamelar 1. O procedimento EK atual de escolha é de Descemet Stripping endotelial Keratoplasty (DSEK), que oferece clar córneadade com recuperação mais rápida da visão, minimiza erros de refração pós-operatória e astigmatismo, e diminui o risco de deiscência da ferida traumática, mantendo a superfície da córnea 7. Este procedimento envolve a remoção da membrana de Descemet e endotélio doente e substituição por tecido doador de espessura parcial que compreende uma nova camada de células endoteliais. A córnea do doador é dissecado com um microcerátomo para preparar o tecido posterior serem transplantadas 8. Preparação do tecido do doador pelo olho bancos tem sido fundamental para o crescimento rápido e, sem dúvida, o sucesso deste procedimento. O aumento de 16 vezes perto em procedimentos DSEK nos Estados Unidos entre 2005 e 2012 corresponde a quase metade do tecido a ser preparada pelo olho bancos 6. Embora DSEK pode melhorar a acuidade visual de 20/40, ou melhor, a maioria dos pacientes não alcançam 20/20 visão devido a neblina interface de estroma e aumento de luzespalham a partir da adição de doador de tecido estromal 7. A técnica cirúrgica EK progrediu a membrana de Descemet ceratoplastia endotelial (DMEK) que envolve o transplante de membrana só doador de Descemet (DM) e endotélio. Este procedimento tem uma maior proporção de pacientes que alcançam 20/20 de visão, a recuperação visual mais rápida, e um menor risco de rejeição endotelial 9. No entanto, a preparação do tecido doador é mais difícil devido às dimensões do enxerto mais finas.

<table><tbody><tr><td>VisionBlue</td><td>D.O.R.C., Zuiland, The Netherlands</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barron vacuum punch</td><td>Katena, Denville, New Jersey</td><td>K20-2112</td><td></td></tr></tbody></table>

corneal donor tissue preparation for descemet's membrane endothelial keratoplasty

Membrana de Descemet ceratoplastia endotelial (DMEK) é uma forma de transplante de córnea, em que apenas uma camada única de células, o endotélio da córnea, juntamente com a sua membrana basal (membrana de Descemet) é introduzido no estroma posterior do recipiente 3. Ao contrário de Descemet Stripping Automated endotelial Keratoplasty (DSAEK), onde estroma adicional dos doadores é introduzida, sem interface antinatural estroma-to-estroma é criado. Como resultado, a anatomia natural da córnea é preservada, tanto quanto possível, permitindo o tempo de recuperação para melhorar a acuidade visual e 4. Endotelial Keratoplasty (EK) é o procedimento de escolha para o tratamento de disfunção endotelial. As vantagens de EK incluem a rápida recuperação da visão, a preservação da integridade do bulbo ocular e alteração refrativa mínimo devido ao uso de uma incisão pequena, periférica 1. DSAEK utiliza tecido do dador preparada com estroma de espessura parcial e endotélio. A rápida success e utilização deste procedimento pode ser atribuído à disponibilidade de olho banco preparado tecidos pré-cortados. Os benefícios da preparação olho banco de tecido do doador incluem a eliminação de necessidade de equipamento especializado na sala de operação e disponibilidade de back up tecido do doador em caso de perfuração do tecido durante a preparação. Além disso, a preparação de alto volume de tecido do doador por técnicos olho bancárias pode proporcionar a melhoria da qualidade do tecido do doador. DSAEK pode ter limitado melhor acuidade visual corrigida, devido à criação de uma interface do estroma entre o doador eo receptor da córnea. Eliminação desta interface com o transplante de membrana e endotélio único doador de Descemet em DMEK pode melhorar os resultados visuais e reduzir as complicações após EK 5. Semelhante ao DSAEK, o sucesso a longo prazo e aceitação de DMEK depende facilidade de disponibilidade de pré-cortados, olho-bank preparado tecido do doador. Aqui nós apresentamos uma abordagem passo a passo para a preparação do tecido doador, que pode reduzir alguns barriers oculares bancos enfrentam no fornecimento de enxertos DMEK.

Separação adequada do DM e endotélio de estroma é essencial na preparação de tecidos pré-cortados para DMEK. Cinquenta córneas de doadores com idade média de 65 ± 6 anos (variação 55-75), a morte para o tempo de processamento de 5,9 ± 2,3 dias (variação 1-10) e densidade de células endoteliais (ECD) de 2616 ± 321 células / mm 2 ( intervalo 2,049-3,247) foram usadas para avaliar a viabilidade e reprodutibilidade da técnica de preparação cirúrgica por dois técnicos banco de olhos. A taxa de sucesso foi de 72% nos primeiros 25 casos e aumentou para 80% no segundo semestre, com uma taxa de sucesso global de 76%. Ponto correlação bisserial (Rpb) foi utilizado para determinar correlação com fatores de tecidos pré-operatórios. A idade do doador (Rpb = 0,18), a morte para o tempo de processamento (Rpb = 0,07) e ECD (Rpb = -0,11) não se correlacionou com preparação bem sucedida de tecido. A preparação de pós-ECD (n = 37) de 2676 ± 284 (intervalo 2,041-3,205) não era significativamente diferente do de pré-preparação de DPI (p = 0,72). Insucessoresultados ful resultou de lágrimas DM (10%) e perda de células grave (14%). Estes casos também foram associados com dificuldade remontar tecido e da coloração incompleta da borda DM. Avaliação Eye-banco de resultados para o paciente fornece dados essenciais para o sucesso clínico e eventos adversos associados com DMEK que podem ajudar a melhorar a adaptação da técnica cirúrgica na prática e utilização de olho banco preparado tecido. Nove pré-cortar o tecido DMEK foram fornecidos para cinco cirurgiões para 9 pacientes. Um caso teve uma luxação em um dia e uma semana sem necessidade de rebubbling. A acuidade visual em um dia variou de 20/400 a percepção de luz e por uma semana melhorou para 20/103 (faixa 20 / 30-20 / 200). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig1highres.jpg" /> Figura 1 tecido de montagem. Tecido da córnea é montada e centrada no bloco de trepanar. ss = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig2highres.jpg" /> Figura 2 Tissue trepanar. Vácuo O anel está encaixado eo tecido da córnea é parcialmente trephined incluindo a membrana de Descemet. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig3highres.jpg" /> Figura 3. remoção dos meios de armazenamento. Meios de armazenamento em excesso é removido antes da aplicação manchar. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig4highres.jpg" /> Figura 4. aplicação azul tripano. Aplicar tripano mancha azul na superfície da membrana de Descemet com enchimento do poço, durante 60-90 segundos. <html> _upload / 51919 / 51919fig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5 a remoção da mancha. Lavar azul tripan com BSS. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig6highres.jpg" /> Figura 6 a remoção da mancha. Remoção completa da mancha. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig7highres.jpg" /> Figura 7 dissecção da membrana de Descemet. Amarrando fórceps são usados ​​para executar 360 ° dissecação parcial. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig8highres.jpg" /> Figura 8 remoção da membrana de Descemet. Comece a retirar a membrana de Descemet. <img alt="&lt;/ Html"><html> &quot;Figura 9&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51919 / 51919fig9highres.jpg&quot; /&gt; Figura 9 remoção da membrana de Descemet. Continue a tira de membrana de Descemet. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig10highres.jpg" /> Figura 10 membrana de Descemet Reposição. (A), a membrana de Descemet retorno para o leito estromal, (B) a aplicação de BSS para auxiliar no desenrolar da membrana de Descemet, e (C) se desenrola completa da membrana de Descemet à posição original. <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/51919/51919fig11highres.jpg" /> Figura 11 Solução Salina Equilibrada de remoção. Remoção de BSS adicional por baixo da aba. 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 51919 / 51919fig12highres.jpg &quot;/&gt; Figura 12 marca dobradiça. Identificação de dobradiça com marcador pele.

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Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Ceratoplastia endotelial é uma técnica cirúrgica em constante evolução como avanços resultam em transplante de enxertos mais finas com cada sucessão 1. Aqui apresentamos uma técnica de dissecção dos tecidos controlada manual para permitir uma separação segura e repetível do endotélio e membrana de Descemet do doador botões córneo para transplante 2.

Preparação tecido doador de córnea para Membrana de Descemet endotelial Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

corneal-donor-tissue-preparation-for-descemet-s-membrane-endothelial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

15.2K visualizações.  University of Michigan.  Ceratoplastia endotelial é uma técnica cirúrgica em constante evolução como avanços resultam em transplante de enxertos mais finas com cada sucessão 1. Aqui apresentamos uma técnica de dissecção dos tecidos controlada manual para permitir uma separação segura e repetível do endotélio e membrana de Descemet do doador botões córneo para transplante 2. 

Vídeo: Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Biologia do Desenvolvimento

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the retrieval of ocular tissues, especially cornea, by cutting it separate from the ocular globe. Evisceration is the process of removing the internal organs referred here as retina. The ocular globe consists of the cornea, the sclera, the vitreous body, the lens, the iris, the retina, the choroid, muscles etc (Suppl. Figure 1). When a patient is suffering from corneal damage, the cornea needs to be removed and a healthy one must be transplanted by keratoplastic surgeries. Genetic disorders or defects in retinal function can compromise vision. Human ocular globes can be used for various surgical procedures such as eye banking, transplantation of human cornea or sclera and research on ocular tissues. However, there is little information available on human corneal and retinal excision, probably due to the limited accessibility to human tissues. Most of the studies describing similar procedures are performed on animal models. Research scientists rely on the availability of properly dissected and well-conserved ocular tissues in order to extend the knowledge on human eye development, homeostasis and function. As we receive high amount of ocular globes out of which approximately 40% (Table 1) of them are used for research purposes, we are able to perform huge amount of experiments on these tissues, defining techniques to excise and preserve them regularly.
The cornea is an avascular tissue which enables the transmission of light onto the retina and for this purpose should always maintain a good degree of transparency. Within the cornea, the limbus region, which is a reservoir of the stem cells, helps the reconstruction of epithelial cells and restricts the overgrowth of the conjunctiva maintaining corneal transparency and clarity. The size and thickness of the cornea are critical for clear vision, as changes in either of them could lead to distracted, unclear vision. The cornea comprises of 5 layers; a) epithelium, b) Bowman's layer, c) stroma, d) Descemet's membrane and e) endothelium. All layers should function properly to ensure clear vision4,5,6. The choroid is the intermediate tunic between the sclera and retina, bounded on the interior by the Bruch's membrane and is responsible for blood flow in the eye. The choroid also helps to regulate the temperature and supplies nourishment to the outer layers of the retina5,6. The retina is a layer of nervous tissue that covers the back of the ocular globe (Suppl. Figure 1) and consists of two parts: a photoreceptive part and a non-receptive part. The retina helps to receive the light from the cornea and lens and converts it into the chemical energy eventually transmitted to the brain with help of the optic nerve5,6.
The aim of this paper is to provide a protocol for the dissection of corneal and retinal tissues from human ocular globes. Avoiding cross-contamination with adjacent tissues and preserving RNA integrity is of fundamental importance as such tissues are indispensable for research purposes aimed at (i) characterizing the transcriptome of the ocular tissues, (ii) isolating stem cells for regenerative medicine projects, and (iii) evaluating histological differences between tissues from normal/affected subjects. In this paper we describe the technique we currently use to remove the cornea, the choroid and retinal tissues from an ocular globe. Here we provide a detailed protocol for the dissection of the human ocular globe and the excision of corneal and retinal tissues. The accompanying video will help researchers to learn an appropriate technique for the retrieval of precious human tissues which are difficult to find regularly.

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

The paper describes a simplified technique to excise corneal and to eviscerate retinal tissues from the ocular globe of human cadaveric donors. The technique described here will help to excise good quality tissues to be used for transplantation, surgical or research purposes without damaging other tissues of the ocular globe.

Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Medicina

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Preparação do tecido da córnea Doadores de ceratoplastia endotelial

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as Aniridia or Steven Johnson Syndrome as well as by external factors such as chemical burns or radiation. Current treatments are (i) the use of corneal grafts and (ii) the use of stem cell expanded in the laboratory and delivered on carriers (e.g., amniotic membrane); these treatments are relatively successful but unfortunately they can fail after 3-5 years. There is a need to design and manufacture new corneal biomaterial devices able to mimic in detail the physiological environment where stem cells reside in the cornea. Limbal stem cells are located in the limbus (circular area between cornea and sclera) in specific niches known as the Palisades of Vogt. In this work we have developed a new platform technology which combines two cutting-edge manufacturing techniques (microstereolithography and electrospinning) for the fabrication of corneal membranes that mimic to a certain extent the limbus. Our membranes contain artificial micropockets which aim to provide cells with protection as the Palisades of Vogt do in the eye.

We report a technique for the fabrication of micropockets within electrospun membranes in which to study cell behavior. Specifically, we describe a combination of microstereolithography and electrospinning for the production of PLGA (Poly(lactide-co-glycolide)) corneal biomaterial devices equipped with microfeatures.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Bioengenharia

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

An &#8220;All-laser&#8221; Endothelial Transplant

The &#8220;all laser&#8221; assisted endothelial keratoplasty is a procedure that is performed with a femtosecond laser used to cut the donor tissue at an intended depth, and a near infrared diode laser to weld the corneal tissue. The proposed technique enables to reach the three main goals in endothelial keratoplasty: a precise control in the thickness of the donor tissue; its easy insertion in the recipient bed and a reduced risk of donor lenticule dislocation. The donor cornea thickness is measured in the surgery room with optical coherence tomography (OCT), in order to correctly design the donor tissue dimensions. A femtosecond laser is used to cut the donor cornea. The recipient eye is prepared by manual stripping of the descemetic membrane. The donor endothelium is inserted into a Busin-injector, the peripheral inner side is stained with a proper chromophore (a water solution of Indocyanine Green) and then it is pulled in the anterior chamber. The transplanted tissue is placed in the final and correct location and then diode laser welding is induced from outside the eyeball. The procedure has been performed on more than 15 patients evidencing an improvement in surgery performances, with a good recovery of visual acuity and a reduced donor lenticule dislocation event.

An all laser procedure is proposed in the endothelial transplant. The surgical technique is based on the use of a femtosecond laser to prepare the donor tissue. Laser welding technique is then used to secure the donor endothelium in the correct position.

Um &quot;All-a laser&quot; Endotelial Transplant

The &#8220;all laser&#8221; assisted endothelial keratoplasty is a procedure that is performed with a femtosecond laser used to cut the donor tissue at an ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts

The quality of donor corneal stroma, which makes up about 90% of total corneal thickness, is likely to be one of the main, if not the major, limiting factor(s) for success of deep anterior lamellar and penetrating keratoplasty. These are surgical procedures that involve replacing part or all of the diseased corneal layers, respectively, by donated tissue, the graft, taken from a recently deceased individual. However, means to evaluate stromal quality of corneal grafts in eye banks are limited and lack the capability of high-resolution quantitative assessment of disease indicators. Full-field optical coherence microscopy (FF-OCM), permitting high-resolution 3D imaging of fresh or fixed ex vivo biological tissue samples, is a non-invasive technique well suited for donor cornea assessment. Here we describe a method for the qualitative and quantitative analysis of corneal stroma using FF-OCM. The protocol has been successfully applied to normal donor corneas and pathological corneal buttons, and can be used to identify healthy and pathologic features on both the macroscopic and microscopic level, thereby facilitating the detection of stromal disorders that could compromise the outcome of keratoplasty. By improving the graft quality control, this protocol has the potential to result in better selection (and rejection) of donor tissues and hence decreased graft failure.

We describe use of full-field optical coherence microscopy as a method for high quality assessment of corneal donor stroma. This protocol can be used to identify features indicative of health or disease, and is aimed at improving the screening and selection of donor tissues, and hence the results of keratoplasty.

Microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea

The quality of donor corneal stroma, which makes up about 90% of total corneal thickness, is likely to be one of the main, if not the major, limiting ...

Imunologia e Infecção

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Preparação tecido doador de córnea para Membrana de Descemet endotelial Keratoplasty

Resumo

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