The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

1. Isolamento de Xenopus Os oócitos e Microinjecção de ARNc <ol><li> Obter oócitos de Xenopus laevis fêmea adulta. Anestesiar os animais em 0,2% MS222, e ressecção de lóbulos do ovário, através de uma pequena incisão abdominal. </li><li> Isolar oócitos dos lóbulos ovarianos por digestão enzimática a 19 ° C durante 3-4 horas com 600-700 U / ml de colagenase de tipo 2 a partir de Clostridium histolyticum dissolvidos em solução livre de cálcio OR2 (receita na Tabela 1). </li><li> Para a selecção, colocar os oócitos desfoliculados em uma placa de Petri com um microscópio binocular de um alto teor de sódio contendo uma solução (ND96: Receita na Tabela 1). </li><li> Selecione estágio V-VI oócitos e colocá-los em outra placa de Petri com uma pipeta Pasteur. NOTA: Blunt Pasteur pipeta por chamas para evitar ferimentos oócito. </li><li> Injectar oócitos com cRNA (por exemplo, 0,2 ng por αβγENaC subunidade). Dissolver cRNAs em água livre de RNase. NOTA: Totalvolume injetado em cada ovócito é de 46 nl. </li><li> Loja oócitos injectados a 19 ° C numa solução de baixo teor de sódio para evitar o carregamento de sódio dos oócitos (ND9: Receita na Tabela 1). Complementar a solução com penicilina 100 U / ml de sódio e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina para prevenir crescimento bacteriano. Tratar com cuidado os ovócitos para limitar a quantidade de oócitos danificadas ou mortas e mantê-los em pequenos grupos individuais em uma poços de 12 bem-prato cheio de solução de banho durante os dois dias após a injecção cRNA. </li></ol> 2. Realizar dois eletrodos Experimentos Voltage-clamp <ol><li> Medir a oócitos de dois dias após a injecção. </li><li> Encher uma seringa de um sistema de perfusão alimentada por gravidade com uma solução ND96 e outra seringa com solução ND96 contendo amiloride (2 uM). Monte seringas 50 centímetros acima da câmara de banho oócito. NOTA: A concentração de inibidor a amilorida ENaC foi escolhido ser 20 vezes maior do que a IC 50 </sub&gt; (100 nM). </li><li> Ligue uma fonte de luz fria halógena de 150 W e ajustá-lo a 10 cm acima da câmara de banho oócito permitindo boa visualização com o microscópio binocular. Em seguida, ligar sucção e ajustar o tubo de sucção no final da câmara do banho de oócito. Localize sucção tubo oposto ao superfusão tubos &#39;adaptador de entrar no banho oócito. NOTA: A potência de aspiração deve ser suficiente para suportar o fluxo contínuo da solução superfusing o oócito. </li><li> Ajuste a velocidade de superfusão de cada solução de 3-5 ml / min, utilizando o dispositivo de controlo de fluxo iv gravidade. Ligar os tubos de superfusão com um adaptador à câmara de banho de oócito. </li><li> Puxe capilares de vidro com um puxador de micropipeta para obter diâmetros de ponta &lt;1 mícron. Em seguida, preencha capilares para ~ 1/4 com 3 M KCl. NOTA: Certifique-se de que a parte clorada do fio de prata do suporte do eletrodo é imerso em solução de KCl. Verifique se há bolhas de ar na ponta do capilar. As bolhas de ar prejudica o measusentadoria, aumentando a resistência capacitância parasita. </li><li> Insira os capilares para os titulares dos eléctrodos da corrente e do eletrodo de tensão e colocá-los em solução (2 mM) ND96 contendo amilorida usando os micro-manipuladores. </li></ol> 3. Medição das correntes Whole-cell Amiloride sensíveis <ol><li> Zero o potencial de eletrodo do eletrodo de tensão (V m) eo eletrodo de corrente (V e), ajustando a V m e V e compensar botões NOTA:. A resistência deve ser de 1-2 mohms para o eletrodo para medir V e 0,5 m -1 mohms para o eletrodo de injeção de corrente. </li><li> Coloque o oócito na câmara do banho em estreita proximidade com o eléctrodo de detecção de tensão. NOTA: Não danifique o oócito durante qualquer uma dessas etapas de transferência. Usar uma pipeta de Pasteur, para transferir o oócito. Para evitar danificar o oócito as bordas da pipeta deve ser anulado pela chama. </li><li> Empalar oocitos suavemente com ambas microeletrodos. </li><li> Definir o potencial de retenção no amplificador para -60 mV e ligar o gravador gráfico. Ligue o amilorida (2 mM) contendo solução. NOTA: A corrente deve ser de cerca de 0 ± 0,5 mA. Correntes de fuga maiores indicam um empalamento gotejante. Portanto, esses óvulos devem ser rejeitados. Além disso, as correntes de fuga medida na presença de amilorida (2 ^ M) deve ser semelhante em αβγ-WT oócitos expressando daqueles medidos em αβγ mutante ENaC expressando oócitos. Isto indica que as mutações não afectam a amilorida-sensibilidade do canal. </li><li> Inicie a gravação. Se necessário, ajustar o ganho. </li><li> Após a corrente medida atinge um patamar estável, alterar a solução livre de amilorida. NOTA: os desvios de corrente descendente nos traços atuais correspondem a correntes de entrada, ou seja, o movimento de carga positiva (Na +) do lado extracelular para dentro da célula. </li><li> After um patamar de corrente for atingido (após ~ 60 seg), mude o superfusão de volta para a solução contendo amilorida. Depois de a corrente do oócito atinge a corrente de linha de base inicial, desligue a braçadeira de tensão e gentilmente retirar os eletrodos. </li><li> Para permitir que a nova selagem da membrana de plasma nos locais da empalação, colocar o oócito em um poço de uma placa de 96 poços, contendo 100-150 mL de solução ND96 protease livre. </li><li> Após 5 min, a transferência do oócito de uma protease contendo uma solução ou uma solução de controlo sem protease para um tempo de incubação de 30 min. NOTA: O tempo de incubação depende da protease e o canal estudado. </li><li> Após a etapa de incubação repetir a medição de corrente (ver 3.2 e seguintes). Nota: é possível medir&gt; 90% dos oócitos após incubação em solução de protease. </li></ol> 4. Biotinilação Ensaio <ol><li> Selecione e descartar oócitos defeituosos sob o microscópio binocular. NOTA: Utilize injetared oócitos, a partir do mesmo lote para as medições de corrente e para as experiências de biotinilação. </li><li> Manter biotina à TA durante pelo menos 20 min antes da sua utilização no ensaio. </li><li> Preparar as soluções: ND96 e ND96 contendo a protease apropriada. Prepare pipetas Pasteur, rotulando-os e por flamejante brevemente as suas dicas para evitar lesões dos oócitos. NOTA: Aqui, a protease quimotripsina 2 ug / ml em ND96 é usado. Trate cada grupo com uma pipeta separado para evitar a contaminação cruzada das soluções. </li><li> Encher cada poço de uma placa de 6 poços com 2,5 ml de controlo ou ND96 ND96 contendo uma protease à TA. Em seguida, o depósito de 30 oócitos por poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. NOTA: Para os processos subsequentes, é importante para manter as amostras em gelo em todos os momentos. Todos os passos de centrifugação a são realizados a 4 ° C. </li><li> Encher cada poço de uma nova placa de 6 poços com 2,5 ml de ND96 (cada grupo tem três poços para os passos de lavagem) e pesar a biotina. NOTA: 2,5 mg biotina per bem (1 mg / ml) é necessário. Dissolve-se a biotina no buffer de biotinilação (ou seja, 25 mg de biotina (para 10 grupos) em 25 ml de tampão de biotinilação (receita na Tabela 1). </li><li> Transferir cada grupo de oócitos de um poço cheio com ND96 2,5 ml. Transferência de ovócitos sequencialmente em dois poços adicionais ND96 para lavar qualquer protease restante. Incubar os oócitos durante 5 min em ND96. </li><li> Transferir os ovócitos para um 2,5 ml de solução de biotina contendo bem e incubar com agitação suave (&quot;shaker&quot;) durante 15 min. NOTA: Minimizar o ND96 transferida com pipeta para evitar a diluição da solução de biotina. </li><li> Transferir cada grupo de oócitos dentro de um poço que continha 2,5 ml de tampão de paragem (receita na Tabela 1) para parar a reacção de biotinilação. Em seguida, transferir cada grupo de oócitos em um segundo poço contendo também 2,5 ml de tampão de têmpera e incubar durante 5 min com agitação suave. </li><li> Remover oócitos danificadas ou mortas. Nota:Escolha o mesmo número de oócitos por grupo para o seguinte procedimento. </li><li> Transferir cada grupo de oócitos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de plástico. NOTA: Minimizar a quantidade de tampão de têmpera que são transferidos. </li><li> Subsequentemente, lisar os oócitos, passando-os através de uma agulha de 27 G em 1 ml de tampão de lise (receita ver Quadro 1) suplementado com inibidores de protease. </li><li> Centrifugar os lisados ​​durante 10 minutos a 1500 x g. </li><li> Sobrenadante aspirado e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,5% de Triton-X-100 e 0,5% de NP40. Desprezar o pelete remanescente. NOTA: O sobrenadante contendo proteínas de membrana de plasma biotinilada e as proteínas intracelulares não biotinilados. </li><li> Incubar os tubos de microcentrífuga durante 20 minutos em gelo. Repetidamente vórtice dos tubos durante este período para dissolver completamente as proteínas em NP40 e Triton-X-100. </li><li> Centrifugar 100 ml de pérolas de agarose por grupo de oócitos durante 3 min a 1500 x g. Após oremover o sobrenadante a partir de centrifugação a solução de grânulos e lavar três vezes com tampão de lise para equilibrar as contas com tampão. </li><li> Pipetar 100 l de as esferas lavadas em cada tubo de microcentrífuga contendo o detergente para a solução de proteína preparada de 4.13 para permitir a ligação das proteínas biotinilados às esferas. </li><li> Incubar os tubos de microcentrífuga com sobrecarga de rotação O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugar os tubos de microcentrífuga de 3 min a 1500 x g. Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo. NOTA: proteínas intracelulares não são marcados com biotina. O sobrenadante pode ser armazenada a -20 ° C. Não aspirar as contas. </li></ol> 5. Detecção de Fragmentos de ENaC clivagem na superfície celular por Western Blot Análise <ol><li> Lavar as pérolas três vezes com tampão de lise e adicionar 100 ul de tampão de amostra de SDS-PAGE 2x. NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou imediatamente preparados para análise de transferência de western. </li><li> Ferva splos de 5 min a 95 ° C e em seguida, coloque os tubos no gelo. </li><li> Centrifugue as amostras durante 3 minutos a 20000 xg e pipeta-se o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação. NOTA: Este sobrenadante contém as proteínas de membrana de plasma biotinilados a partir da superfície celular do ovócito. </li><li> Analise 30 ul desta sobrenadante por western blot para investigar os fragmentos de clivagem na superfície da célula. </li><li> Separam-se as proteínas biotiniladas por SDS-PAGE (electroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida) utilizando um gel apropriado (8%, 10%, 12%, dependendo do peso molecular dos fragmentos de clivagem investigados). </li><li> Transferir as proteínas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) por membranas de transferência semi-seco. </li><li> Sondar a membrana com um anticorpo específico contra γENaC humano dirigido contra um epitopo no terminal C (ver a Figura 3 e 13). </li><li> Use de rábano de cabra marcado com peroxidase de anticorpo anti-coelho como anti secundáriocorpo. </li><li> Detectar sinais quimioluminescentes. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Neste manuscrito uma abordagem metodológica que foi aplicado com sucesso para estudar os mecanismos subjacentes a ativação de ENaC por proteases é descrito 8,13. O sistema de expressão laevis oócito Xenopus bem estabelecida foi usado para funcionalmente expressa ENaC. Função ENaC foi avaliada com a técnica de dois eletrodos de tensão-clamp convencional. A mutagénese dirigida foi utilizada para identificar os locais de clivagem da protease funcionalmente relevantes. Biotinilação experiências realizadas em paralelo com as medições electrofisiológicas tornou possível correlacionar o aparecimento de ENaC clivagem produtos na superfície da célula, com a activação proteolítica de corrente. Uma correlação entre o curso de tempo da activação actual e o aparecimento de fragmentos de clivagem proteolitica na superfície da célula suporta o conceito de activação do canal proteolítica. Dois eléctrodos de gravação voltagem-grampo requerem a empalação de um oocyte com dois microeletrodos. Este procedimento é geralmente realizado apenas uma vez em um ovócito individual. No entanto, foi possível remover os microeléctrodos após uma gravação de corrente inicial de células inteiras sem dano aparente ao oócito. Com efeito, a membrana de plasma nos locais da impalements parece selar dentro de poucos minutos. Assim, após a conclusão de uma medição de tensão-grampo primeiro de dois eléctrodos, é possível transferir o ovócito da câmara de fluxo experimental da configuração de tensão-grampo de dois eléctrodos para um tubo de microcentrífuga ou um poço de uma placa de 96 poços preenchidos com um pequeno volume de solução de teste ou de controlo. Em seguida, o mesmo oócito pode ser transferido de volta para a câmara de fluxo e pode ser empalado novamente para executar uma segunda medição de tensão-grampo de dois eléctrodos. Notavelmente, as correntes mediadas por ENaC não variar muito entre a primeira e segunda medição, quando o oócito foi mantido em solução de controlo. Em contraste, a incubação do oócito em uma protease contendo sollução após a primeira medição, resultou num aumento da corrente de ENaC mediada na segunda medição (Figura 2). Este achado indica a ativação do canal proteolítica. Realizando duas medições de correntes separadas em um único oócito, oferece a vantagem de que o oócito pode ser exposta a proteases ou outros agentes farmacológicos entre as duas medições para um comprimento variável de tempo, num pequeno volume de solução de teste. Isto é importante quando se utiliza agentes que são caros e / ou disponível em grandes quantidades, por exemplo, preparações de protease purificadas. A disponibilidade limitada de agentes pode tornar impossível (ou inviável) para usá-los em contínuas de dois eletrodos gravações tensão-clamp por causa dos grandes volumes de solução de teste necessário para superfusing continuamente os oócitos com vazões de vários mililitros por minuto. Por outro lado, de dois eléctrodos de medição de tensão contínua de braçadeira estão limitados pelo fenó conhecidomeno de resumo canal espontânea também descrito para ENaC 15. Em contraste, a exposição oócitos para testar soluções entre duas medições separadas de até uma hora ou mais geralmente não constitui um problema (ver Figura 4A). Finalmente, duas medidas seqüenciais realizados na mesma oócito permitir observações pareadas de efeitos de drogas. Isto tem uma vantagem sobre as medições desemparelhados de dois grupos distintos de oócitos (-tratados e tratados com protease do veículo), uma vez que reduz o problema da alta variabilidade entre oócitos, normalmente observadas na expressão de canal iónico. Com pares de observação e a possibilidade de normalizar os dados para a primeira medição, são necessários menos oócitos por grupo experimental para demonstrar um efeito significativo de um agente farmacológico. A normalização dos dados também faz com que seja fácil de sintetizar os dados a partir de diferentes lotes de oócitos com diferentes níveis de expressão de canais de iões e, consequentemente, diferentes correntes de linha de base (Figura 2D). Obviamente, as experiências de controlo são necessários para esta abordagem para demonstrar que a actividade de canal iónico de interesse permanece estável em oócitos de controlo tratado com veículo a partir da primeira para a segunda medição (ver Figura 2). Para demonstrar que a activação proteolítica corrente correlaciona com o aparecimento de produtos de clivagem de ENaC na superfície da célula, uma abordagem biotinilação originalmente descrita por Harris et al. Nove pode ser utilizada. Este procedimento (como detalhado na secção de protocolo e mostrado na Figura 4) foi adaptado para demonstrar que a exposição de canais de proteases e subsequente activação de correntes mediadas por ENaC é paralelo com o aparecimento em função do tempo de fragmentos de clivagem. O método de biotinilação também permite a análise de um aumento ou diminuição global das proteínas de membrana na superfície da célula. Assim, este método é adequado para investigar o efeito de proteases e outras farmaagentes farmacológicas sobre a inserção do canal na membrana plasmática ou sobre a recuperação do canal. Além disso, a análise Western blot das proteínas da membrana de plasma biotiniladas permite a detecção de fragmentos de proteína (por exemplo, fragmentos proteolíticos ENaC) ou alterações no padrão de glicosilação, que pode ser funcionalmente relevantes. Em conclusão, a combinação de métodos utilizados para investigar o efeito estimulador de proteases sobre correntes de células completas ENaC-mediadas e para demonstrar uma correlação com a ocorrência de clivagem ENaC produtos na superfície da célula pode ser útil para uma ampla gama de aplicações. Em particular, esses métodos podem ser adequados para tratar de questões semelhantes no que respeita à regulação de outros canais iônicos, transportadores ou receptores transmembrana (por exemplo, receptores ativados por protease pars).

As proteases são enzimas que estão envolvidas em várias respostas fisiológicas que vão desde a degradação proteolítica bem conhecida de proteínas, no contexto da digestão, a cascata de protease altamente sofisticados envolvidas em vias de sinalização complexas reguladora. As proteases são classificados em sete grupos de acordo com o seu sítio ativo catalítico: aspartato, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, metalo, serina, treonina e proteases. Proteases diferentes locais alvo de clivagem distintas que não são sempre fáceis de prever a partir da estrutura primária de uma proteína. O banco de dados MEROPS ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> ) fornece informações detalhadas sobre uma ampla gama de proteases e seus sítios de clivagem preferenciais. Locais de clivagem funcionalmente relevantes podem ser identificados utilizando a mutagénese dirigida ao local. Está bem estabelecido que o processamento proteolítico de ENaC é um importante mecanismo de activação do thé especial 1,2 canal iônico. Curiosamente, não há evidências de que a função do canal de iões de 1a-detecção de ácido correspondente (ASIC1a) pode também ser modificada por proteases 3-5. Actualmente, continua a ser uma questão em aberto se canal proteolítica clivagem desempenha um papel fisiológico importante na regulação da atividade de outros canais iônicos ou transportadores. No entanto, está bem estabelecido que a clivagem proteolítica activa um grupo de receptores acoplados a proteínas, os receptores activados por proteases (PARs) 6. Várias proteases de serina (por exemplo, proteases de activação do canal (CAP1-3), quimotripsina, tripsina, furina, plasmina, elastase de neutrófilos, e calicreína) têm mostrado activar proteoliticamente ENaC 2. Além de proteases de serina, proteases de outros grupos podem estar envolvidos na activação proteolítica ENaC. De facto, dados recentes mostram que a metaloproteinase meprin-β 7 e a protease de cisteína Catepsina S-8 também pode activaçãote ENaC. No entanto, os (pato-proteases) fisiologicamente relevantes para a ativação ENaC continuam a ser determinado e pode variar de tecido para tecido. As proteases são conhecidas por clivar preferencialmente nos locais específicos na sequência de aminoácidos. Por exemplo, a quimotripsina de serina-protease mostra um padrão de clivagem específico de clivagem após o amino-ácido aromático resíduos de fenilalanina e tirosina. Em contraste, a protease tripsina serina preferencialmente cliva após a resíduos de lisina ou arginina de base. Utilizando construções γENaC humana mutantes gerados por mutagénese dirigida ao local, locais de clivagem funcionalmente relevantes em ENaC heterologamente expressos no sistema de expressão do oócito pode ser identificado 8-13. Por injecção de ARNc para as três subunidades de ENaC (αβγ) em oócitos isolados, ENaC pode ser funcionalmente expressa nestas células e a actividade de canais presentes na membrana do plasma pode ser medida pelautilizando a técnica de dois eletrodos de tensão-clamp. Ao utilizar o diurético amilorida, um inibidor específico de ENaC, o ENaC mediada componente da corrente de célula inteira sensível à amilorida (ΔI ami) pode ser separado a partir de correntes de fuga não específicos ou a partir de correntes conduzidas por outros canais iónicos. Assim, os valores ΔI ami reflectem a actividade global do ENaC e pode ser determinada subtraindo as correntes de células completas medidos na presença de amiloride a partir das correntes de células completas correspondentes gravadas na ausência de amilorida. Para testar se uma protease tem um efeito estimulador sobre ENaC, ΔI ami é medida duas vezes no mesmo oócito, isto é, antes e depois da incubação do oócito em uma solução contendo protease. Um aumento de ΔI ami da primeira para a segunda medição indica a activação proteolítica ENaC. Quimotripsina ou tripsina são conhecidos por estimular maximamente ENaC no sistema de expressão de oócitos 2,14 e pode ser usado para confirm que a activação proteolítica ENaC é detectável em um determinado lote de oócitos. Em paralelo com as medições de corrente de células completas, uma abordagem biotinilação 9 foi utilizado para investigar se o aumento de ΔI ami detectadas após exposição dos oócitos para proteases se correlaciona com o aparecimento de fragmentos de clivagem ENaC na superfície da célula. As proteínas na superfície da célula são marcados com biotina e pode ser separado a partir de proteínas intracelulares de ligação das proteínas biotiniladas a esferas de agarose neutravidina-rotulados. As proteínas biotiniladas podem ser analisados ​​por western blot. fragmentos de clivagem γENaC na superfície da célula pode ser detectada utilizando um anticorpo específico dirigido contra um epitopo no terminal C do γENaC. Para identificar o local de clivagem funcionalmente relevante (s), previu locais de clivagem pode ser mutado utilizando mutagénese dirigida ao local. Canais de tipo selvagem e mutantes são comparadas em experiências paralelas utilizando oócitos dos slote ame. Com esta abordagem metodológica foi demonstrado pela primeira vez que a activação proteolítica de correntes de células completas ENaC mediadas correlaciona-se com o aparecimento em função do tempo de ENaC fragmentos de clivagem na superfície da célula. Estes resultados sugerem uma relação causal entre a clivagem canal ea ativação do canal. Além disso, utilizando a mutagénese dirigida ao local de locais de clivagem putativos em combinação com a técnica de dois eléctrodos de voltagem-grampo, locais de clivagem funcionalmente relevantes para a plasmina, quimotripsina e 13 de catepsina S-8 foram identificados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Para investigar se a plasmina protease de serina pode activar as correntes mediadas por ENaC, ΔI ami de oócitos ENaC expressam individuais foi determinado antes e depois de 30 minutos de incubação dos oócitos em isenta de proteases (controlo) (Figura 2A) ou solução contendo plasmina (figura 2B) utilizando a técnica de dois eléctrodos de tensão-grampo (ver Figura 1). A exposição a plasmina aumento ΔI ami em cada ovócito medido. Em contraste, nas experiências de controlo, 30 minutos de incubação do ENaC expressam oócitos em solução isenta de protease tinha um efeito negligenciável (Figura 2 C, D). Assim, usando este método de uma estimulação de corrente ENaC mediada por plasmina pode ser detectada. Para estudar os efeitos da mutação de locais de clivagem putativos sobre a activação de correntes mediadas por ENaC, bem como em cima do canal de clivagem, o efeito de quimotripsina em WT-ENaC foi comparada com a dasum mutante com ENaC prostasina mutado e locais de clivagem de plasmina (γ RKRK178AAAA; K189A). O curso de tempo da activação do canal por quimotripsina, assim como o aparecimento de produtos de clivagem de ENaC na superfície celular foi investigada por meio de diferentes tempos de incubação da protease (Figura 4A). Demonstrou-se que os atrasos e canal mutantes reduz a ativação do atual ENaC mediada por quimotripsina. Isto é acompanhado por um aparecimento retardado de um fragmento de clivagem inferior molecular γENaC peso de 67 kDa correspondente à subunidade totalmente clivado. Fragmentos de clivagem foram detectadas utilizando um anticorpo γENaC dirigido contra um epitopo no terminal C (Figura 3). Esta abordagem metodológica demonstra que o curso de tempo da activação proteolítica de correntes mediadas por ENaC correlaciona-se com a aparência de um produto de clivagem de 67 kDa γENaC na superfície celular (Figura 4 B, C). Isso apóia o conceito de umanexo de causalidade entre a clivagem proteolítica canal ea ativação do canal 13. Além disso, através da combinação de medições de corrente e a detecção de fragmentos γENaC na superfície da célula que se demonstrou que os locais de clivagem mutantes são funcionalmente relevantes para a activação proteolítica de canal. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Processo de determinação do efeito estimulante de uma protease em ENaC heterologamente expressos em oócitos de Xenopus laevis. Actividade ENaC é estimada através da medição da corrente de componente de célula inteira sensível à amilorida ΔI ami. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Plasmin estimula moedas ENaC mediadasts em oócitos expressando ENaC. (AD) oócitos expressando ENaC humana foram incubadas durante 30 min em solução isenta de proteases (controlo) ou na solução contendo plasmina (10 ug / ml). Para determinar ΔI ami antes (-) e depois (+) de incubação, os oócitos foram presa a um potencial de retenção de -60 mV (A, B) Quatro representativos de células inteiras a partir de vestígios de corrente um lote de oócitos.. Amiloride (ami) estava presente na solução de banho para inibir especificamente ENaC como indicado por barras pretas. (C) Os pontos de dados obtidos a partir de um ovócito individuais são ligados por uma linha (D). Sumário de experiências similares, como mostrado em C. As colunas representam efeito estimulador em relação ΔI ami calculado como a relação de ΔI ami medida após uma incubação de 30 minutos (ΔI ami 30 min) para o ΔI ami inicial (ΔI ami inicial), medida antes da incubação. Os números dentro das colunas indicam onúmero de oócitos individuais medidos. N indica o número de lotes diferentes de oócitos. (Este valor foi modificado de [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Modelo das subunidades que mostra os locais de clivagem para a activação proteolítica γENaC e o local de ligação do anticorpo usado. Clivagem proteolítica pela furina convertase Golgi-associado é importante para a maturação do ENaC na via biossintética antes do canal atinge a membrana plasmática. Após a clivagem por furina um fragmento de 76 kDa pode ser detectada na superfície da célula através de uma abordagem de biotinilação e um anticorpo contra um epitopo no terminal C da subunidade γ. O passo final crucial na proteolítica PTactivação aC provavelmente ocorre na membrana do plasma onde γENaC é clivada por proteases extracelulares (por exemplo, plasmina ou quimotripsina) em uma região distai para o local de furina, resultando num fragmento de clivagem de 67 kDa. (Este valor foi modificado de [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> Figura 4:. Mutação tanto a plasmina (K189) e o local de clivagem de prostasina (RKRK178) atrasa a activação de correntes de ENaC-mediadas e o aparecimento de um produto de clivagem de 67 kDa de γ da subunidade do canal de oócitos que expressam WT (símbolos abertos) e γ RKRK178AAAA; K189A ENaC canal mutante (símbolos a cheio) foram incubadas durante 30 min em solução isenta de proteases (controlo) ou de 5, 30, ou 60 minutos em uma solução contendo quimotripsina (2 ug / ml). (A) Para determinar ΔI ami antes e depois da incubação, os oócitos foram presa a um potencial de retenção de -60 mV. Os círculos representam a proporção de ΔI ami medida após 5, 30, ou 60 minutos de incubação (ΔI ami min) para o ΔI ami inicial (ΔI ami inicial), medida antes da incubação. Cada ponto de dados representa a média ΔI ami medida em 22-24 oócitos individuais de quatro lotes diferentes. (BD) em paralelo para a detecção de ΔI ami, expressão de γENaC biotinilado na superfície celular foi analisada por SDS-PAGE. γENaC foi detectado com um anticorpo contra um epitopo no terminal C de γENaC humano. Western blots representativos de um lote de oócitos são mostrados. (CE) A análise densitométrica das três transferências Western semelhantes aos mostrados em B ou D. Para cada pista, as signals detectados na região de 76 kD (colunas a branco) e 67 kD (colunas cinzentas) foram determinadas e normalizadas para a soma do sinal total detectada. N indica o número de lotes diferentes de oócitos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments at JoVE.c

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Activação proteolítica do canal de sódio epitelial (ENaC) heterologamente expressos em oócitos de Xenopus laevis pode ser demonstrada através da combinação de medições de corrente com uma abordagem de biotinilação para investigar o aparecimento de produtos de clivagem do canal de iões na superfície da célula. Locais de clivagem funcionalmente importantes podem ser identificados através de mutagénese dirigida ao local.

Demonstração de Proteolytic ativação do canal de sódio epitelial (ENAC) combinando Medidas atuais com Detecção de clivagem Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K visualizações.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  Activação proteolítica do canal de sódio epitelial (ENaC) heterologamente expressos em oócitos de Xenopus laevis pode ser demonstrada através da combinação de medições de corrente com uma abordagem de biotinilação para investigar o aparecimento de produtos de clivagem do canal de iões na superfície da célula. Locais de clivagem funcionalmente importantes podem ser identificados através de mutagénese dirigida ao local. 

Vídeo: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Demonstração de Allodynia Cutânea Em associação com dor pélvica crônica

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Biologia

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Demonstração de Proteolytic ativação do canal de sódio epitelial (ENAC) combinando Medidas atuais com Detecção de clivagem Fragments

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