O pCG001 plasmídeo expressando Ubp1 foi gentilmente cedido por Rohan Baker na Curtin João Escola de Pesquisa Médica. Este trabalho foi financiado pela March of Dimes Bolsa de Investigação 1-FY2011, March of Dimes O&#39;Connor Iniciado Basil Prêmio de Pesquisa Acadêmico # 5-FY20 e NSF concessão de CARREIRA 0.746.796.

1. Fluxo de Trabalho de Engenharia tensão <ol><li> Inserir as sequências de codificação (a) uma sequência de localização da membrana, (b) uma proteína fluorescente amadurecimento rápido e (c) uma sequência de reconhecimento de protease N-terminal e para a armação com uma proteína de interesse (por exemplo, um factor de transcrição). Utilizou-se a membrana alvo Tsr-Venus repórter 2 e fundiu-o para a sequência de reconhecimento da protease de Ubiquitina (Ub) para contar o número de moléculas expressas bacteriófagos λ proteína repressora CI. Detalhes sobre como se construídas a proteína de fusão Tsr-Venus-Ub-CI, em substituição do tipo selvagem CI região codificante e que incorpora o arquétipo na E. cromossoma coli utilizando λ recombinação Red 3, estão descritos em detalhe na ref. 1. </li><li> Verifique se todas as modificações por seqüenciamento. </li><li> Transformar um plasmídeo que codifica uma protease específica para a sequência de reconhecimento usado acima para uma estirpe que expressa o repórter fluorescente e proteína de interesseem fusão traducional. Utilizou-se a protease Ubp1, que cliva imediatamente a seguir ao resíduo C-terminal da ubiquitina 4. </li></ol> 2. As células de cultura e preparar a amostra <ol><li> Escolha um E. coli colónia de interesse a partir de uma placa de agar de fresco listado em 1 ml M9 meio mínimo suplementado com 5 1X ácidos aminados do MAM e antibióticos apropriados. Incubar num agitador à temperatura desejada por tempo suficiente para alcançar OD 600&gt; 1.0 (densidade óptica a 600 nm). </li><li> Dilui-se a cultura em um meio M9 ml fresco com os antibióticos apropriados para a = 0,02 OD 600. Incubar num agitador à temperatura apropriada. Densidade celular inicial pode ser aumentada, se necessário para a baixa temperatura de crescimento. </li><li> Quando o OD 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C, com uma cultura inicial de células de DO600 = 0,02, isso vai levar 3-4 horas), iniciar a preparação do gel de agarose a almofada (passo 3). </li><li> As células estão prontas para imagiologia quando OD <sub&gt; 600 = 0,3-0,4. </li><li> Transferir 1 ml da cultura incubada num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de centrifugação a 10000 xg durante 1 minuto numa microcentrífuga de bancada. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco M9 e ressuspender o pellet cuidadosamente. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Repita o passo 1,6 e 1,7. Descartar o sobrenadante. </li><li> Delicadamente ressuspender em 1 ml M9 mídia. As células podem ser directamente utilizados para imagiologia de microscópio ou 10 diluída - a 100 vezes para assegurar densidades celulares baixas para imagiologia timelapse. Note-se que as densidades celulares baixas são importantes para a imagiologia timelapse estendida. A câmara de imagem (passo 4) é vedada durante a experiência. Devido ao crescimento exponencial de células, as concentrações de células iniciais elevadas podem reduzir significativamente o oxigénio no interior da câmara após crescimento prolongado na almofada de gel, reduzindo a maturação da proteína fluorescente e que afectam o crescimento das células. </li></ol> 3. Preparar a solução de agarose <ol><li> Pesar 10-20 mgbaixo ponto de fusão à temperatura de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar adequado volume médio mínimo M9 sem antibióticos para fazer uma solução de 3% de agarose. </li><li> Aquece-se a solução de agarose durante 30 min a 70 ° C para derreter, invertendo o tubo para assegurar que a solução é completamente fundida e homogénea. A almofada de gel pode ser vertido neste ponto (passo 4), ou a temperatura pode ser reduzida para 50 ° C e mantida durante várias horas para uso posterior. </li></ol> 4. Prepare Pad Gel na Câmara <ol><li> Cerca de 50 min antes da imagiologia, lavar uma corrediça Microaqueduct com água. </li><li> Lavar uma cobertura de vidro limpas (usando um método rigoroso de limpeza como o descrito no ponto 6) e Microaqueduct lâmina com água estéril e seco por sopragem com ar comprimido. </li><li> Coloque a junta de borracha na corrediça Microaqueduct modo que cubra as entradas e saídas do lado da lâmina de vidro Microaqueduct (este pode ser modificado para aplicações emque a mídia é perfundido através da amostra). Aplicar 50 ul de solução de agarose (passo 3) para o centro da lâmina Microaqueduct. </li><li> Topo da solução de agarose com a tampa de vidro limpo, seco. </li><li> Deixar a solução de agarose mantida à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Enquanto isso, a preparar uma amostra de células (passo 2). </li><li> Retire cuidadosamente o vidro de cobertura da parte superior da almofada de gel. Adicionar 1,0 uL de cultura de células lavadas a parte superior da almofada de gel. Espere por ~ 2 min para a cultura a ser absorvido pela almofada de gel. É importante não esperar tanto tempo que os overdries almofada de gel, mas tempo suficiente para que as células estão devidamente aderiu à almofada de gel. O tempo ideal de espera vai variar com a temperatura e umidade. </li><li> Enquanto espera, secar outra tampa de vidro previamente limpas. </li><li> Cobrir a amostra com a tampa de vidro novo assegurando que a tampa de vidro deslizante e Microaqueduct estão bem alinhados. </li><li> Montar a temperatura da câmara de crescimento controlado seguindo as instruções do fabricante.Pode agora ser usado para imagens com microscópio (passo 5). </li></ol> 5. Imagem e Aquisição de Filmes Timelapse <ol><li> Ligar o laser e microscópio seguindo as instruções do fabricante (por exemplo, o laser pode precisar aquecido para ~ 0,5 h antes da experiência). </li><li> Bloquear a câmara montada na fase de inserção no microscópio. Definir a temperatura da câmara de crescimento e o aquecedor objectivo, a 37 ° C ou a temperatura de crescimento desejado outro. </li><li> Se imaging acima da temperatura ambiente, o foco ou almofada de gel, normalmente deriva significativamente para ~ 15 min após a mudança de temperatura inicial. Na prática, usar este tempo para encontrar regiões de interesse e modificar os scripts de imagem como necessário para uma experiência. </li><li> Encontrar as células no microscópio e armazenar a posição de cada célula após centrando-o dentro de uma região de imagem pré-definidos e alinhados. Mais do que uma célula pode ser trabalhada em cada janela de tempo de aquisição de imagem. Para timelapse imagens sobre mquaisquer gerações, assegurar que as células são inicialmente separadas imaged de outras células por pelo menos algumas centenas de ^ M, de modo que outras colónias não irá entrar na região de imagem durante o crescimento. </li><li> Ajustar a intensidade da excitação com laser, de modo que quase toda a Fotobranqueador moléculas fluorescentes dentro de 6 posições (Figura 5). </li><li> Usando um script de imagem automatizado / jornal, adquirir dados timelapse utilizando o algoritmo descrito no fluxo de trabalho experimental na Figura 3. </li></ol>

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Nós não temos divulgações.

O método CoTrAC pode ser generalizado para medir a produção de outras proteínas em que N-ou C-terminais convencionais fusões de proteínas fluorescentes podem comprometer a actividade da proteína. A estratégia CoTrAC tem três vantagens únicas sobre os métodos correntes. Em primeiro lugar, co-traducional fusão assegura que uma molécula do repórter fluorescente é produzido para cada molécula da proteína de interesse, permitindo a contagem precisa da produção de proteína em tempo real. Em segundo lugar, o repórter membrana-alvo Tsr-Vénus permite a detecção de uma única molécula de repórteres fluorescentes, permitindo a detecção de proteínas expressas em níveis muito baixos. Em terceiro lugar e mais importante, a clivagem co-traducional do repórter fluorescente permite que a proteína de interesse para reter a sua sequência quase de tipo selvagem e funcionar normalmente, utilizando ubiquitina como uma sequência de reconhecimento de protease em E. coli, as proteínas alvo apenas diferem das suas sequências de péptidos de tipo selvagem, em que o primeiro terminal-N N &lt;/ Em&gt;-formil-metionina é alterada para metionina. Ao utilizar o método CoTrAC, É importante ter em mente que o método CoTrAC mede o número de moléculas de proteínas produzidas em cada janela de tempo de 5 min, a qual é distinta da medição do número de moléculas de proteína por célula presentes (isto é, o proteína de concentração). A maior parte de uma única célula de fluorescência da expressão do gene da proteína ensaios concentração medida, que é o resultado do equilíbrio de proteína e degradação. Portanto, a taxa de degradação da proteína de interesse deve ser considerada cuidadosamente, se a medição da concentração é usada para inferir a informação sobre a produção de proteína. Além disso, a concentração de proteína é sujeita a flutuações causadas por partição da proteína entre duas células filhas na divisão celular, as quais podem ser significativas para baixo nível de expressão de proteínas e erradamente interpretados como resultando dinâmica da produção de proteína. O método pode ser modi CoTrACcados para medir a concentração de proteína por não fotobranqueamento moléculas repórter recém-produzidos, mas isso deve ser feito com controlo extra. Deve-se verificar que as velocidades de degradação do repórter fluorescente e a proteína de interesse são semelhantes, e que eles são ambos de forma semelhante dividida em duas células filhas sobre a divisão celular, de modo a que a concentração do repórter fluorescente que reflecte da proteína de interesse. Notamos que, enquanto a CoTrAC não altera a sequência da proteína, a adição do gene repórter altera a sequência de mRNA. Portanto, transcrição e de tradução dinâmica e / ou taxas de degradação de mRNA transcrito pode ser perturbado. Se o método de CoTrAC é usado para observar a produção de proteína no contexto de tipo selvagem, é importante para comparar os níveis de expressão da proteína alvo tanto na sua sequência de tipo selvagem e com o tag de fusão CoTrAC fluorescente (por exemplo, na ref. Uma comparamos CI expressão na nossa construção CoTrACt para que em um lisogénio tipo selvagem). Abaixo discutimos considerações necessárias para a generalização do método CoTrAC. Primeiro, discutimos a possibilidade de utilizar outras seqüências de Tsr-Vênus-Ub. Os requisitos gerais são os seguintes: (1) o repórter devem estar localizados a alguma posição no interior da célula, de modo que ela não se difunde rapidamente (com Tsr, repórteres estão nos pólos de células 1). Isto é necessário para uma única molécula de detecção de uma molécula de proteína fluorescente como o sinal a partir de uma molécula de proteína rápida difusão fluorescente normalmente não detectável acima do fundo autofluorescente de uma célula, (2), a proteína fluorescente deve ser suficientemente brilhante para ser detectada no uma única molécula de nível e deve amadurecer (tornar-se fluorescente) com rapidez suficiente para a aplicação desejada (Vénus é a proteína mais rápido até à data de vencimento fluorescente 7), (3), a proteína fluorescente deve ser Foto-descoloração após a detecção de modo que as proteínas fluorescentes pode ser recém dedetectado em pontos de tempo posteriores (proteínas fluorescentes que são excessivamente resistente a fotobranqueamento são indesejáveis, como a exposição ao laser excessivo pode causar artefactos de fototoxicidade), (4), a sequência de reconhecimento da protease não pode deixar quaisquer ácidos residuais aminoácidos na proteína de interesse, que perturba a sua funcionalidade (Ubp1 se unir imediatamente após o resíduo Ub carboxi-terminal, não deixando resíduos extra em tudo). Em segundo lugar, deve-se verificar que o repórter seja expresso correctamente e clivada. A clivagem proteolítica que separa o repórter da proteína de interesse deve ser eficiente, a eficiência de clivagem pode ser medida utilizando Western blot contra o repórter, a proteína de interesse, ou ambas (os anticorpos estão comercialmente disponíveis para muitas proteínas fluorescentes, tais como o anticorpo anti-GFP JL- 8 de Clontech, que liga Vênus em Western blot). Deve-se assegurar que nenhuma proteína de fusão não clivada é detectada em blots contra os lisados ​​de células que expressam a fusãoproteína em níveis superiores aos previstos em experimentos CoTrAC. Além disso, o repórter e da proteína de interesse devem ser produzidos numa relação de 1:1 após a clivagem. Isto pode ser verificado através da medição das intensidades das bandas clivadas no repórter e anti-proteína-de-interesse Western blots normalizados pela intensidade das bandas não clivadas em estirpes carentes protease. Se repórter e da proteína de interesse está presente em uma proporção de 1:1 após a clivagem, a seguir: Note-se que uma vez que a concentração de proteína Ocidental blots medida, a razão resultante irá desviar-se de 1:1 se o repórter e da proteína de interesse exibem taxas de degradação diferentes, após a clivagem. Em terceiro lugar, deve-se verificar que a proteína de interesse exibe a sua funcionalidade esperada após clivagem. A presença do repórter grande construção de fusão e / ou de localização para a membrana celular é esperado para inactivar a maioria dos factores de transcrição (a λ repressor CI foi completely inactivo sem Ubp1 expressão nas nossas experiências 1). Transformação do plasmídeo expressando-protease deve activar a proteína de interesse por proteína a libertar a marca de fusão traducional volumoso. Este fenómeno dá origem a outras possíveis aplicações CoTrAC. Clivagem no terminal carboxi por Ub Ubp1 tem sido usado para expor não canónicas amino-terminal de aminoácidos para elucidar a regra de N-final da degradação da proteína bacteriana 9. Se a fusão de um grande repórter associado à membrana inactiva um factor de transcrição (ou outra proteína tal como uma enzima), a sua actividade pode ser rapidamente recuperados por expressão da protease de indução. CoTrAC poderia ser usado para rapidamente &quot;ligar&quot; uma piscina preexistente de factores de transcrição através da remoção / adição de um inibidor / co-activador ou de outra forma de iniciar a expressão da protease ou a actividade. Finalmente, a expressão do repórter fluorescente podem perturbar a fisiologia celular e deve ser assegurado que as propriedades tais como a célulao tempo de ciclo são afectadas; na experiência descrita na ref. 1, utilizou-se a proteína Tsr como uma sequência de localização da membrana, porque Tsr já é uma proteína de membrana altamente expresso e um pequeno aumento na expressão Tsr não se esperava que afectam o comportamento das células. Quarto, quando uma sequência repórter diferente do especificamente discutido Tsr-Venus-Ub é usado, o protocolo de imagem correspondente deveria também ser modificadas conforme necessário. Por exemplo, proteínas fluorescentes diferentes exigirá protocolos de iluminação diferentes para atingir um bom equilíbrio entre a detecção eficaz de moléculas de proteínas fluorescentes, fototoxicidade da exposição à radiação laser e fotobranqueamento. Idealmente, excitação laser devem estar no pico de absorvância da proteína fluorescente escolhido; fora de pico de excitação requer maiores intensidades de excitação (e portanto mais elevada a fototoxicidade e autofluorescência fundo) para obter a emissão mesma proteína fluorescente e características fotobranqueamento. Além disso, ofrequência de imagem pode ser modificada para ser mais lenta ou mais rápida do que 5 minutos, dependendo da tolerância das células para a fototoxicidade de exposição ao laser. Em nossos experimentos, 12 E. separado colônias coli foram fotografadas a cada 5 minutos e seguiu por 7-8 ciclos celulares antes de observar os defeitos substanciais fototoxicidade 1. Finalmente, depois de lapso de tempo de produção de proteína de filmes são adquiridos numa experiência CoTrAC (exemplos mostrados nas Figuras 4 e 5), a expressão da proteína fluorescente deve ser quantificado através da detecção de manchas fluorescentes correspondentes a uma ou mais moléculas, a atribuição de moléculas a células individuais e rastrear as linhagens de células. Nós descrevemos uma rotina Matlab personalizado para estudar λ produção CI repressor 1. Em resumo, é preciso primeiro identificar contornos de células individuais e pontos de tempo correspondentes a divisão celular em imagens de campo claro ao seguir linhagens celulares através de quadro de imagem posteriors. Nós descobrimos que um intervalo de tempo de 5 min foi suficientemente curto que uma célula em um quadro geralmente corresponde à célula no quadro anterior, com o qual a maioria dos partilhada pixels de uma imagem segmentada. Nos casos em que eventuais mudanças grandes de colónias entre dois quadros subsequentes foram observadas, a atribuição manual de células individuais para as suas linhagens foi necessária. Em seguida, é preciso identificar os pontos fluorescentes e quantificar sua intensidade. Descobrimos que manchas fluorescentes podem ser identificados por (1) de passagem de banda de filtragem da imagem de fluorescência para remover de baixa frequência de fundo de fluorescência (por exemplo, autofluorescência) e ruído de alta frequência, (2) a imagem de limiar com base em intensidade de fluorescência e (3) identificar objectos maior do que alguns poucos pixels na imagem de limiar definido. Os objectos na imagem limiarizada foram ajustados a uma função gaussiana 2-dimensional mais um fundo constante, e a intensidade integrada da mancha foi tomada como o produto da amplitude em forma e variância.Em nossos experimentos, vários Tsr-Vênus-Ub repórteres muitas vezes co-localizadas nos pólos celulares, criando pontos que eram mais brilhantes do que os de simples Tsr-Vênus moléculas. O número de moléculas no interior de um único local Venus foi quantificada através da divisão da intensidade integrada da mancha com a intensidade de fluorescência de uma molécula única Vénus, a qual foi quantificada por meio de um baixo nível de expressão, em que a estirpe de manchas raramente contêm mais do que uma proteína fluorescente molécula. Esta medição pode ser ainda complementado com medições in vitro de moléculas individuais de proteínas fluorescentes aderiram a uma lâmina de vidro. Nós descobrimos que as propriedades de proteínas fluorescentes são muito semelhantes in vivo e em sistemas in vitro com condições tampão semelhantes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Agarose (temperatura de fusão baixa) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sais M9 </td><td></td><td></td><td> Seguinte receita descrita em 9 </td></tr><tr><td> Glicose 20% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x solução de MEM aminoácidos </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controlada CrescimentoCâmara Adaptador de estágio </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Aquecedor objetivo </td><td> Bioptechs </td><td> Modelo depende objetiva de microscópio </td><td></td></tr><tr><td> Deslize Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro óculos cobertura </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Pode ser difícil de fonte; também disponível a partir de Bioptechs </td></tr><tr><td> Tampa de vidro / slide junta </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Vário </td><td> Exemplo de configuração: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, microscópio Olympus IX-81, Olympus PlanApo 100X 1,45 NA objetivo, Metamorph software </td><td> Deve ter excitação laser, automatizado fase xyz, software de automação capaz de imagem roteirizado e autofocus, óptica capazes de resolvinag únicas proteínas fluorescentes </td></tr><tr><td> EM-CCD da câmera </td><td> Vário </td><td> Exemplo de configuração: Andor ixon DU-898 </td><td> Deve ter ruído suficientemente baixo para detectar proteínas fluorescentes individuais acima fundo </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC) a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método faz com que seja possível contar o número de moléculas de proteínas produzidas em uma célula durante sequenciais, as janelas de tempo de cinco minutos. Ela requer um microscópio de fluorescência com o laser de densidade de potência de excitação de ~ 0,5-1 kW / cm 2, o que é suficientemente sensível para detectar moléculas individuais de proteínas fluorescentes em células vivas. O repórter fluorescente usada neste método consiste em três partes: uma sequência de membrana alvo, um amadurecimento rápido, proteína fluorescente amarela e uma sequência de reconhecimento de protease. O repórter é traducionalmente fundidas com o N-terminal de uma proteína de interesse. As células são cultivadas em um estágio de microscópio de temperatura controlada. De cinco em cinco minutos, moléculas fluorescentes no interior das células são criadas imagens (e mais tarde coUnted, analisando imagens de fluorescência) e, posteriormente, Foto-descoloração, de modo que apenas as proteínas recém-convertidos são contados na medição seguinte. Imagens de fluorescência resultantes deste método podem ser analisados ​​por detecção de manchas fluorescentes em cada imagem, atribuindo-lhes a células individuais e, em seguida, a atribuição de células de linhagens de células. O número de proteínas produzidas dentro de uma janela de tempo numa dada célula é calculado dividindo-se a intensidade de fluorescência das manchas integrada com a intensidade média de moléculas fluorescentes individuais. Foi utilizado este método para medir os níveis de expressão na gama de 0-45 moléculas individuais em janelas de tempo 5 min. Este método permitiu-nos medir o ruído na expressão do repressor λ CI, e tem muitas outras aplicações potenciais em sistemas de biologia.

Os resultados típicos de uma experiência CoTrAC rastrear a produção do repressor λ CI são mostrados nas Figuras 4 e 5. Nesta experiência, foram obtidas imagens de 12 colónias em intervalos de 5 min. Em cada ponto de tempo, a colónia foi autofocused, centralizado no interior da região da imagem latente. Em seguida, a posição centrada / foco foi armazenada e uma imagem de campo claro foi adquirido. O palco foi então translocado por ~ 0,5 m ao longo do eixo z para mover a partir do plano focal de campo claro ao plano que divide as células (sem contraste de fase ou o contraste de interferência diferencial (DIC) óptica, semi-transparentes objetos podem ser visualizados em pouco fora de foco-aviões 8). Finalmente, seis imagens foram obtidas em intervalos de 1 segundo, cada uma com uma exposição msec 100 (Figura 5 mostra um ponto de tempo tal). Este procedimento foi repetido para todas as células em cada ponto de tempo. Como quase todas as moléculas são de Vênus Foto-descoloração em cada ponto no tempo, os fluoresmanchas cento nas Figuras 4 e 5 correspondem a moléculas de Vénus amadurecidas (tornou-se fluorescente) dentro de 5 min a passado. Moléculas Venus amadurecer rapidamente in vivo, com uma meia-vida de 2-7 min ~ 1, 2, 7 e clivagem por Ubp1 é muito eficiente de 4, 9. Portanto, o número de moléculas de proteína produzida após a última medida pode ser precisamente inferida a partir do número de moléculas de Vénus contaram com a membrana. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50042/50042fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig1.jpg" /> Figura 1. Usando CoTrAC para contar a expressão de moléculas de factores de transcrição individuais (1). Um repórter incluindo a sequência de membrana Tsr-localização, a rápida maturação YFP Vénus e ubiquitina (Ub) é expressa em fusão traducional com um factor de transcrição a partir de um proer regulados pelo factor de transcrição (2). A protease Ubp1 co-tradução do polipeptídeo nascente cliva depois o resíduo C-terminal de Ub. (3) O repórter Tsr-Venus-Ub localiza na membrana onde ela pode ser contado no único -molécula nível. (4) O factor de transcrição podem regular a sua própria expressão. Caricatura método. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig2.jpg" /> Figura 2. Células esquemáticos da câmara de amostra utilizada em experimentos CoTrAC. São colocados entre almofada de gel de agarose e tampa de vidro. Microaqueduct slide e objetivo são mantidos a uma temperatura fixa usando um controlador eletrônico. Preparação de amostras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig3.jpg" /> Figura 3. Fluxo de trabalho de uma experiência CoTrAC típico. Experifluxo de trabalho mental. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50042/50042fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig4.jpg" /> Figura 4. Timelapse dados típicos de um experimento CoTrAC. Imagens de uma única colônia são mostrados em intervalos de 25 min. Nesta experiência, os dados foram adquiridos a cada 5 min a partir de 12 colónias diferentes. (A) as imagens de campo claro. (B) Venus (YFP) imagem de fluorescência (médias de fundo subtraído de conta de variações do fundo do campo de imagem inteira ao longo do tempo). (C ) imagem sobreposta mostra a localização do pólo de moléculas Tsr-Vênus-Ub repórter e heterogeneidade no número de moléculas produzidas em 5 min janelas de tempo em células diferentes (imagem de campo claro é invertido e imagem Venus é banda filtrada). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50042/50042fig4large.jpg" target="_blank">Clique h</a>ere para ver maior figura. <img alt="Figura 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50042/50042fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50042/50042fig5.jpg" /> Figura 5. Dados típicos de apenas um tempo, em um experimento CoTrAC. (A) Venus (YFP) imagens de fluorescência. 100 mseg seis exposições foram adquiridas no início de cada intervalo de tempo de 5 min. Cada uma das 6 posições foi separado por 900 mseg para que haja tempo para moléculas transitoriamente escuras Venus que tinha piscado fora para se tornar fluorescente. (B) Para a análise, imagem 6 é subtraída uma imagem para corrigir as moléculas não branqueado e fundo autofluorescência. Pontos nesta imagem são localizadas a linhagens celulares específicas e quantificadas pela sua intensidade de fluorescência integrada. (C) A fluorescência média integrada da colónia em A é representada com mais de 6 imagens (modolinha tampa). Encaixando esta linha para um decaimento exponencial mais um offset constante (linha tracejada) dá um meio-tempo de decaimento de 1 seg. Nesta experiência, Vénus Fotobranqueador moléculas muito mais rapidamente do que autofluorescência celular, então isso significa que, aproximadamente, metade do número total de moléculas de Vénus são Foto-descoloração em cada quadro. Fotodegradação progresso em um único momento.

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC), a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método tem sido utilizado para seguir as dinâmicas de expressão estocásticos de um factor de transcrição, o repressor CI λ<sup&gt; 1</sup&gt;.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC), a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método tem sido utilizado para seguir as dinâmicas de expressão estocásticos de um factor de transcrição, o repressor CI λ 1.

Vídeo: Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Biologia

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes can be demonstrated by combining current measurements with a biotinylation approach to investigate the appearance of ion channel cleavage products at the cell surface. Functionally important cleavage sites can be identified by using site-directed mutagenesis.

Demonstração de Proteolytic ativação do canal de sódio epitelial (ENAC) combinando Medidas atuais com Detecção de clivagem Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...