Estamos profundamente agradecidos ao Dr. Frank Kirchhoff para a prestação de GFAP-EGFP e cepas CX3CR1-EGFP do mouse. O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, Tekes, o finlandês Graduate School of Neuroscience (FGSN) e da Academia da Finlândia.

Todos os procedimentos aqui apresentados foram realizados de acordo com a orientação local para cuidar dos animais (A lei finlandesa de Experimentação Animal º 62/2006). Licença Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) foi obtida de autoridade local (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Camundongos adultos de 1-3 meses de idade, peso 24-38 g, foram mantidos em gaiolas individuais no biotério da Universidade de certificado e desde que com comida e água ad libitum. 1. Lesão Cerebral de imagem através de uma janela Cranial <ol><li> Anestesiar animais e preparar o campo de operação <ol><li> Anestesiar os ratos por injecção peritoneal de uma mistura de cetamina (Ketalar, 80 mg / kg) e xilazina (Rompun, 10 mg / kg) dissolvido em solução salina tampão de fosfato, esterilizada por filtro (PBS), pH 7,4. Confira os reflexos do rato regularmente (cauda e sonda pitada tep) para verificar a profundidade da anestesia. Aumentar a dose se necessário, para manter a anestesia adequada, mas evitar Overdose. </li><li> Manter o animal a 37,0 ° C utilizando uma almofada de aquecimento durante a operação cirúrgica, sessão de imagem e primeira hora após a recuperação da anestesia. </li><li> Para proteger os olhos do rato de secar, aplique um lubrificante ocular. </li><li> Administrar dexametasona (veterinário Rapidexon, 2 mg / kg) por injecção subcutânea para reduzir a inflamação e edema cerebral. </li><li> Administrar um analgésico (por exemplo, por via intraperitoneal Ketoprophene) até 30 minutos antes ou imediatamente após a cirurgia. Se o animal apresenta quaisquer sintomas de dor, como a relutância em se movimentar, comer ou beber, ou perda de peso, salivação, piloereção, ou respiratória sons anormais após a cirurgia, repetir a injeção de analgésico. </li><li> Raspar a cabeça de rato &quot;, com uma máquina de barbear (ver Materiais e Equipamentos). Evite danificar os bigodes. </li><li> Tratar a pele na cabeça do rato com uma solução de etanol 70% para limpar a área raspada. </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica (ver Materiais eEquipamentos) e fórceps (ver Materiais e Equipamentos), corte a pele da linha média entre as orelhas para a testa. </li><li> Delicadamente raspar o tecido conjuntivo ligado ao crânio com uma lâmina microcirúrgica contundente. </li><li> Deslize fronteiras de pele de lado e puxe barras de ouvido ligeiramente em orifícios auditivos do crânio para a cabeça e fixação da pele. </li><li> Limpe o crânio com PBS estéril e tratar o local da cirurgia na cabeça do rato com 0,5% de digluconato de clorexidina, em seguida, secar a superfície do crânio usando uma combinação de cotonetes estéril e ar comprimido. </li></ol></li><li> Infliction da lesão picada <ol><li> Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com um suporte de animais (ver Materiais e Equipamentos). </li><li> Ajustar a posição do microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal. </li><li> Utilizando um microscópio binocular, localizar o ponto bregma no crânio. </li><li> Identificar a region de interesse, utilizando as coordenadas estereotáxica. NOTA: Evite as áreas de interesse que estão localizados diretamente sobre os vasos corticais superficiais. Destruição destes pode afetar fortemente a progressão trauma. </li><li> Posicione a agulha 30 G acima da região escolhida e marcar o local de destino, arranhando a superfície do crânio. </li><li> Perfurar o crânio com todas as precauções possíveis para evitar a ampliação desnecessária da superfície osso afetado. Use uma broca cirúrgica de alta velocidade (ver Materiais e Equipamentos) sob o microscópio. Pare de perfurar se líquido aparece na área perfurada. </li><li> Tocar no fundo do poço perfurado com agulha. </li><li> Mergulhar a agulha suavemente no cérebro (taxa de inserção 5-10 mm / min), para a profundidade de 0,5-2,0 mm, de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada. </li><li> Remova a agulha imediatamente após atingir a profundidade desejada (taxa de retração 5-10 mm / min) e limpar o sangue que aparece após a picada com um pequeno tampão (see Materiais e equipamentos). </li><li> Realize microinjeção de 100 M Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão usando uma bomba de micro-seringa (WPI) e 10 mL Hamilton seringa montar com pipeta de vidro. NOTA: Durante a preparação da pipeta de vidro de borosilicato capilar de vidro, aguçar a ponta de um diâmetro de 10-20 m. </li><li> Infundir 250-1,500 nl de solução de injecção a uma taxa de 2-5 nl / seg. NOTA: Deixe a pipeta após o término da infusão por pelo menos 5 minutos em parênquima cerebral, em seguida, removê-lo devagar e com cuidado para evitar a solução de saída. </li></ol></li><li> Craniotomia para janela craniana crônica <ol><li> Fure o crânio delicadamente e com cuidado para fazer uma janela de círculo em torno do local da lesão. Use diâmetro janela de 3-3,5 mm. </li><li> Aplicar uma gota de tampão de córtex (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM e 2 mM de MgSO4 em H2O destilada) para cobrir o window. </li><li> Coloque uma lamela de vidro redondo (# 1.5 espessura) na janela craniana. </li><li> Remover o excesso de tampão de córtex em torno da lamela. </li><li> Selar as bordas da lamínula com cola poliacrílico (ver Materiais e Equipamentos). NOTA: Assegurar que a cola não é aplicada à superfície superior da lamela. Se a tampa de vidro está contaminado com cola, espere até que o vidro é estavelmente colado ao crânio e a cola na superfície do vidro fica seca, em seguida, retire cuidadosamente a cola contaminar com uma micro-lâmina. </li><li> Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar. </li><li> Usando os parafusos altura da barra de ouvido, ajuste a posição da cabeça, de modo que o suporte do metal pode ser colocado. </li><li> Aplique uma pequena quantidade de cola poliacrílico no anel do suporte do aço (ver Materiais e Equipamentos). </li><li> Cole o anel do suporte do aço na lamela de vidro com o punho suporte de metal dirigido para trás. </li><li> Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar. </li><li> Mix cimento dental (ver Materiais e equipamentos) com cola poliacrílico em um prato de Petri 3,5 centímetros (ou analógico) para alcançar condições viscosos. </li><li> Selar as bordas da janela craniana com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura até a fronteira da pele. </li><li> Aguarde 15 minutos para deixar a mistura de cola cimento + secar e, em seguida, remover as barras de ouvido. </li><li> Realize dois fótons de excitação microscópica (TPEM) de imagem para a região de interesse e uma área de controle, uma vez que definido no protocolo 3. </li><li> Depois de imagem, permitem que o animal se recuperar da anestesia em uma almofada de aquecimento e mantê-lo em uma gaiola indivíduo sob observação até a recuperação completa. Alimentos úmidos pode ser dada para facilitar a mastigação e hidratação. </li></ol></li></ol> 2. Lesão Cerebral de imagem através do crânio afinado <ol><li> Anestesiar animais e preparar o campo de operação <ol><li> Anestesiar o mouse e prepará-lo para a indução do traumatal como descrito na etapa 1.1. </li></ol></li><li> Crânio afinamento e imposição da lesão picada <ol><li> Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com o suporte do animal (ver Materiais e equipamentos). </li><li> Ajustar a posição de um microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal. </li><li> Localize o ponto bregma no crânio usando o microscópio binocular, identificar a área do cérebro a ser trabalhada com base nas coordenadas estereotaxia e marcá-lo riscando. NOTA: Crânio posição desbaste não deve ser localizado sobre ou perto suturas cranianas, como a estabilidade crânio é comprometido nessas áreas. Além disso, grandes vasos e meninges localizados abaixo das suturas do crânio corticais ou meninges são susceptíveis de causar artefatos de imagem. </li><li> Colocar o suporte metálico revestido com cola ao longo da área de interesse no crânio do animal, aplicar uma ligeira pressão e esperar cinco minutos, até o suporte do metal é firmemente colado ao crânio. </li&gt; <li> Misturar o cimento dental (ver Materiais e Equipamento) com cola poliacrílico em uma placa de Petri de 3,5 cm (ou análogo) para alcançar condições viscosos. </li><li> Selar as bordas do suporte de metal com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura-se até à fronteira da pele. </li><li> Aguarde 15 minutos para deixar o cimento e mistura de cola secar. </li><li> Lavar a região crânio diluído e as partes circundantes de suporte metálico várias vezes com PBS, de modo que os restos de cola nonpolymerized são lavados. NOTA: É fundamental garantir a fixação estável do crânio ao titular. Isto permite que a estabilidade durante a preparação de imagem. </li><li> Usando o modo de alta ampliação do microscópio binocular, remover as camadas superiores do osso do crânio com um micro-broca de alta velocidade para criar uma área de crânio diluído de ~ 0,5-1,5 mm de diâmetro. Use ar comprimido durante a perfuração para remover os escombros do osso. Realize o intermittentl perfuraçãoy durante o processo de desbaste de modo a evitar o sobreaquecimento induzida por fricção. Arrefece-se a broca com a solução à temperatura ambiente e aplicar periodicamente tampão para a zona adelgaçada para absorver o calor. NOTA: Para evitar danos ao córtex, não perfurar em grandes regiões (&gt; 1,5 mm) até uma camada fina (&lt;50 mm). NOTA: A estrutura de roedor osso do crânio é constituído por duas camadas finas de osso compacto separadas por uma camada espessa de osso esponjoso. Cavidades minúsculas da forma de osso esponjoso círculos concêntricos e canalículos, que contêm vasos sanguíneos. Utilizar a microdrill para remover tanto a camada externa de osso compacto e mais da camada esponjosa. O rompimento dos vasos sanguíneos dentro do osso esponjoso pode provocar sangramento. Use esponja de colágeno hemostasia para parar o sangramento. </li><li> Use geração de segundo harmônico (SHG) de imagem para analisar se a maior parte do osso esponjoso foi removido. Tenha cuidado para evitar desbaste excessivo, certifique-se que o osso restante é thicker do que 50 um, nesta fase da preparação. </li><li> Coloque uma gota de tampão quente (35-37 ° C) no topo da região diluído. Use uma lâmina microcirúrgica ou acabamento Micro Bur para remover mais camadas de osso e formam uma zona lisa de ~ 700 um de diâmetro com a espessura do osso de ~ 20 mM. Durante este passo, que é útil para realizar imagiologia de SHG repetitivo e regularmente medir a espessura do osso. </li><li> Realize imagem TPEM para a região de interesse e uma área de controle. </li><li> Ajustar a posição de cabeça utilizando os parafusos de barra de altura da orelha, de tal maneira que a região é diluído posicionados rigorosamente horizontalmente. Posicione a agulha acima da região diluída e certifique-se de que não existem grandes navios sob o local alvo. </li><li> Fazer uma lesão por meio de imersão da agulha no cérebro, com a profundidade de 0,5-2,0 mm da superfície do crânio e afinada de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada. </li><li> Remova a agulha e suprimir a hemorragia que aparece depois de tele lesão cerebral aguda com tampão hemostático (ver Materiais e equipamentos). Espere até que os coágulos de sangue forma e pulsação vaso no local da lesão pára. </li><li> Realizar a microinjecção de 100 uM Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão, tal como acima descrito na secção 1.2.10. </li><li> Realize imagem TPEM para monitorar a progressão de lesões e recuperação, conforme descrito no Protocolo no 3. </li><li> Depois de imagem, permitem que o animal a recuperar a consciência da anestesia em uma almofada de aquecimento. Não deixe o animal sem supervisão e devolvê-lo à sua gaiola somente após a recuperação física completa. </li></ol></li></ol> 3. Imagem <ol><li> Colocar o animal sob o microscópio, anexando o suporte do metal para o quadro personalizado construído. </li><li> Para imagens, use por exemplo, o FV1000MPE dois fótons microscópio equipado com Mai Tai DeepSee laser e XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de imersão em água otimizado para in vivo de dois fótonsimagiologia. </li><li> Identificar o local da lesão ao microscópio usando o modo de fluorescência de campo amplo. Utilize filtros passa longos para visualizar vasculatura cerebral e selecionar a área de controle de acordo com o padrão observado dos vasos sanguíneos. </li><li> Para a imagem do sinal de geração de segundo harmônico (SHG), ajustar o laser de femtosegundos para o comprimento de onda de 800 nm e coletar a luz emitida usando o filtro de desvio nm 380-410. Para imagens de fluorescência, utilize o filtro passa-banda (515-560 nm) para coletar a luz emitida, e os seguintes comprimentos de onda são usados ​​para excitar a fluorescência: GFP-860 nm, YFP-950 nm. </li><li> Use software FluoView para aquisição de imagem. </li><li> Coordena loja de cada ROI para posterior imagem repetitivo. Imagem da mesma ao longo do tempo de ROIs, e ajustar as coordenadas de cada vez para maximizar a sobreposição de imagem. </li><li> Analisar as imagens com o software apropriado (por exemplo,. ImageJ). Reconstruções aqui apresentados foram feitos usando software Imaris. </li></ol>

<ol>
	<li>Lighthall, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cortical+impact:+A+new+experimental+brain+injury+model.">Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model.</a> J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).</li><li>Lindgren, S., Rinder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+in+head+injury.">Experimental studies in head injury.</a> Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).</li><li>Shreiber, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+investigation+of+cerebral+contusion:+histopathological+and+immunohistochemical+evaluation+of+dynamic+cortical+deformation.">Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).</li><li>Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+cortical+injury:+I.+Methodology+and+local+effects+of+contusions+in+the+rat.">Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat.</a> Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).</li><li>Bardehle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+astrocyte+responses+to+acute+injury+reveals+selective+juxtavascular+proliferation.">Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation.</a> Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).</li><li>Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+neuronal+and+astroglial+disruption+in+the+peri-contusional+cortex+of+mice+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging.">Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Nolte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter-controlled+EGFP-expressing+transgenic+mice:+a+tool+to+visualize+astrocytes+and+astrogliosis+in+living+brain+tissue.">GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.</a> Glia. 33 (1), 72-86 (2001).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo.">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).</li><li>Carr&#233;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+an+impact+acceleration+traumatic+brain+injury+rat+model+with+potential+suitability+for+both+microdialysis+and+PtiO2+monitoring.">Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring.</a> J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).</li><li>Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-evoked+calcium+transients+in+somatosensory+cortex+are+temporarily+inhibited+by+a+nearby+microhemorrhage.">Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage.</a> PloS one. 8 (5), (2013).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J. Vis. Exp. 61, (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Trauma cerebral é um evento abrupto, imprevisível. Aqui, nós descrevemos o modelo animal que reproduz um espectro de alterações patológicas observadas em pacientes humanos após a lesão do cérebro, tais como a neurodegeneração, a eliminação de dendritos, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias no córtex cerebral, juntamente com uma hemorragia subaracnóide focal e aumento da permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Estudar patogênese primário e secundário, bem como a recuperação após o trauma, este modelo foi combinado com lesão longitudinal na visualização in vivo de neuronal multa e estruturas gliais. Linhagens transgênicas de rato foram usados ​​que expressam proteínas fluorescentes em neurônios (Thy1-YFP-H) 7, os astrócitos (GFAP-EGFP) 8, ou microglia (CX3CR1-EGFP) 9. Além disso, usamos geração de segundo harmônico (SHG) de imagem e astrócitos carregamento com Sulfarhodamine 101 10. O modelo descrito aqui recapitula penetrating tipo de lesão cerebral. Portanto, uma limitação do presente modelo é que ele não fornece informações sobre os mecanismos de traumatismo craniano fechado. Recentemente Espada e co-autores relataram resultados de imagem multiphoton sobre o comportamento das células no córtex pericontusional 6. Tendo em conta que fechou ferimento na cabeça é um caso médico mais frequente, a abordagem metodológica relatado pelos autores é altamente promissora para complementar os métodos tradicionais de pesquisa na área de trauma impacto cérebro 11. Usamos tanto a janela do crânio crônica 12 e do crânio desbaste 13 preparações para estudar o comportamento das células em condições pós-traumáticas no cérebro vivo. Ambos os métodos possuem certas vantagens e limitações. Assim, a janela craniana crónica proporciona uma melhor resolução, a penetração mais profunda óptico para dentro do tecido cerebral e conveniência para múltiplas sessões de imagem. Por outro lado, desbaste crânio é menos provável de induzir inflamação no thlocal de imagem e, e, talvez mais importante, permite que aplicações repetidas de drogas e corantes. Alguns exemplos de agentes farmacológicos para ser aplicadas neste tipo de ensaios estão apresentados na Tabela 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:127px;"> Tipo de Agente </td><td style="width:221px;"> Agente Injetado </td><td style="width:304px;"> Áreas de investigação em biologia / farmácia </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:127px;"> Anti-inflamatório </td><td style="width:221px;"> A ciclosporina A </td><td style="width:304px;"> Traumatismo crânio-encefálico, lesão secundária, neurodegeneração </td></tr><tr height="21"><td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:127px;"> Toxinas </td><td style="width:221px;"> Tetrodotoxin </td><td style="width:304px;"> TCE - dano secundário, excytotoxicity </td></tr><tr height="21"><html><td height="21" style="height:21px;width:221px;"> Bicuculina </td><td style="width:304px;"> TCE - danos secundários, a homeostase cloreto </td></tr><tr height="21"><td height="62" rowspan="2" style="height:62px;width:127px;"> Os inibidores da sinalização de vias </td><td style="width:221px;"> PD98059 (inibidor MAPKK) </td><td rowspan="2" style="width:304px;"> mecanismos de sinalização de inflamação, danos secundários, a morte celular pós-traumático, neurodegeneração e regeneração </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:221px;"> SU6656 (inibidor da quinase da família Src) </td></tr><tr height="41"><td height="82" rowspan="2" style="height:82px;width:127px;"> Os factores neurotróficos </td><td style="width:221px;"> O factor neurotrófico derivado do cérebro, o BDNF </td><td rowspan="2" style="width:304px;"> TCE - sobrevivência neuronal após a lesão, neuroproteção em danos cerebrais pós-traumático secundário </td></tr><tr height="41"><html> &quot;Style =&quot; height: 41px; width: 221px; &quot;&gt; células da glia fator neurotrófico derivado-line, GDNF </td></tr><tr height="41"><td height="82" rowspan="2" style="height:82px;width:127px;"> Vírus </td><td style="width:221px;"> lentivirais para a expressão da proteína </td><td rowspan="2" style="width:304px;"> mecanismos moleculares da neurodegeneração pós-traumático e regeneração, rotulagem diferencial de tipos de células no cérebro danificado por imagem in vivo </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:221px;"> vectores adenovirais para a expressão de proteínas </td></tr><tr height="21"><td height="61" rowspan="2" style="height:61px;width:127px;"> Ca 2 + indicadores fluorescentes </td><td style="width:221px;"> Fluo-2, 4 </td><td rowspan="2" style="width:304px;"> mecanismos de sinalização de inflamação pós-traumática, morte celular, migração celular, axonal / regeneração dendrítica </td></tr><tr height="40">221px; &quot;&gt; Oregon Verde BAPTA </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Agentes farmacológicos e corantes para injeção cortical em modelo de lesão picada. Uma vasta gama de eventos bioquímicos que são altamente importante em condições fisiológicas e patológicas podem ser sondados com inibidores químicos, os indicadores fluorescentes e proteína mutante introduzidas através de construções virais. Vantagens para a escolha de determinada janela de tempo fornecidos pela preparação desbaste crânio pode ser altamente relevante para os estudos. No presente estudo, foram utilizados segundo sinal geração harmônica para delinear o local da lesão. Alternativamente, as bordas da lesão local pode ser indicado por um corante fluorescente fracamente difusão, por exemplo, um conjugado de peso molecular elevado de dextrano fluorescente (2 milhões de Dalton). Recentemente, Schaffer e colegas 14 usaram uma preparação crônicacom reopenable janela craniana para entrega repetitiva de corantes fluorescentes para rato córtex. É provável que a janela reabertura craniana pode afetar adversamente a transparência do tecido cerebral. Além disso, é difícil prever o curso de tempo da inflamação induzida reabrindo-, o que pode afectar a regeneração do tecido conjuntivo. Uma grande vantagem da preparação do crânio diluído é a possibilidade de fornecer compostos terapêuticos (e outros materiais que necessitam de injecção tópica no tecido do cérebro) várias vezes durante a progressão do trauma, sem complicar estruturas (por exemplo, sem a janela craniana reabertura). Se a entrega composto repetitivo diretamente para o local da lesão é desejado, deve-se considerar meios especiais para evitar crânio seco-out e infecção bacteriana. Assim, é recomendado manter a região da cabeça operado em condições estéreis e aplicação de antibióticos (como enrofloxacina). Para preservar a thinned região crânio de secagem, preencha o suporte do metal com 1,5% de agarose e cobri-lo com rodada lamela de vidro. Na maioria dos casos isto irá permitir manter a mesma transparência ou crânio diluído ao longo do período de até 10 dias. Alguns adicional deve ser tomado se várias sessões de imagem na preparação crânio diluído são planejadas ao longo de um período prolongado de tempo. Imediatamente antes de cada sessão de imagens, remova o tecido conjuntivo recém-formado a partir da região diluído com uma lâmina de microcirurgia. Use a imagem TPEM de SHG para verificar a qualidade de imagem e medida a espessura do osso. Regeneração dos tecidos pode comprometer a imagem causa da profundidade de penetração e a desfocagem acompanhada por um aumento da fluorescência de fundo. Atualizar o crânio diluindo suavemente com uma lâmina de microcirurgia para recuperar a alta qualidade de imagem. Nos casos em que não requerem acesso direto ao local da lesão, é altamente recomendável que cobre a região diluída do crânio com um coversli vidrop, conforme descrito no artigo sobre polido e reforçado diluído preparação do crânio por Kleinfeld e colegas 15. Isto pode ser feito usando o seguinte procedimento opcional. Coloque uma pequena gota de agarose (1,5%) na região crânio diluído, espere até que ele se torna um gel, remova todo agarose desnecessário, ou seja, deixá-lo apenas no local da lesão. Agarose deve proteger o local da lesão a partir de efeitos externos. Seque a região crânio diluído com ar comprimido. Largar uma pequena quantidade de cola poliacrílico em um pequeno pedaço de # 0 lamela e colocá-lo na região crânio diluída. A cola poliacrílico impede óssea e regeneração dos tecidos conjuntivos, mantendo, assim, o crânio diluído sob a janela preservada. A combinação desses procedimentos permite estudar os processos pós-traumáticas agudas e crônicas, entregando drogas tópica ou sistêmica e monitorar diretamente os efeitos do tratamento. O uso de linhas de camundongo transgênico dupla ou tripla também pode ser benéfico, particularmente para gravação simultânea de múltiplos processos pós-traumáticos, tais como a formação da cicatriz glial e rebrota ramo neuronal. Esperamos que os nossos modelos de lesão cerebral aguda estudou com microscopia de dois fótons intravital para revelar-se útil para o teste de droga candidatos.

Lesão cerebral aguda é um problema significativo de saúde pública, com alta incidência de lesões em acidentes de trânsito, quedas ou agressões, e alta prevalência de incapacidade crônica subseqüente. As abordagens terapêuticas para o tratamento de lesões cerebrais permanecem totalmente sintomático, limitando assim a eficácia do atendimento pré-hospitalar, cirúrgico e crítico. Isso faz com que o impacto social e econômico da lesão cerebral particularmente grave. Por uma variedade de razões, a maioria dos ensaios clínicos não demonstraram melhoria na recuperação após a lesão cerebral usando novas abordagens terapêuticas. Os modelos animais são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para uma fase em que a eficácia da droga pode ser previsto em pacientes com lesões cerebrais. Atualmente, existem vários modelos animais bem estabelecidos de traumatismo craniano, incluindo o impacto controlado cortical 1, o fluido lesão percussão 2, dinâmico deformação cortical 3, peso-drop4 e lesão foto 5. Uma série de modelos experimentais têm sido utilizados para estudar certos aspectos morfológicos, moleculares e comportamentais de cabeça associada a trauma patologia. No entanto, nenhum modelo animal único é totalmente bem-sucedido na validação de novas estratégias terapêuticas. Desenvolvimento de modelos animais confiáveis, reprodutíveis e controladas de lesão cerebral é necessário avaliar os processos patológicos complexos. A nova combinação das mais recentes tecnologias de imagem microscópica e repórteres fluorescentes geneticamente codificados oferece uma oportunidade sem precedentes para investigar todas as fases da lesão cerebral, que incluem lesão primária, espalhando-se da lesão primária, a lesão secundária e regeneração. Em particular, in vivo microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não-linear única que permite a visualização em tempo real das estruturas celulares e subcelulares mesmo em profundas camadas corticais do cérebro de roedores. Vários tipos de células e organelles podem ser visualizados simultaneamente, combinando diferentes marcadores fluorescentes. Usando essa poderosa ferramenta, podemos visualizar as alterações morfológicas e funcionais dinâmicos no cérebro vivendo sob condições pós-traumáticas. As vantagens da microscopia in vivo de dois fótons em estudar lesão cerebral foram recentemente demonstrado pelo Kirov e colegas 6. Usando um modelo de contusão cortical focal leve, estes autores mostraram que a lesão dendrítica aguda no córtex pericontusional é fechado pela diminuição do fluxo sanguíneo local. Além disso, demonstraram que o córtex metabolicamente comprometida em torno do local contusão é mais danificado pela despolarização espalhar. Este dano secundário afeta circuitos sinápticos, tornando as conseqüências da lesão cerebral traumática mais grave. Aqui, propõe-se o método de picada estereotáxico com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação tópica de drogas em simultâneo, como um modelo avançado para o local do cérebrolesão e como uma ferramenta para estudar as consequências fisiopatológicas do trauma agudo no cérebro de mamíferos in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2A-sa dumb Tweezers, 115mm</td>
			<td style="width:71px;">XYtronic</td>
			<td style="width:119px;">XY-2A-SA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30G &#189;&#8217;&#8217; needle</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">REF 304000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Animal trimmer, shaving machine</td>
			<td style="width:71px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">Isis GT420</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Binocular Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad</td>
			<td style="width:71px;">Supertech</td>
			<td style="width:119px;">TMP-5b</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blunt microsurgical blade</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">REF 374769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Borosilicate tube with filament</td>
			<td style="width:71px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BF120-69-10</td>
			<td style="width:167px;">For glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carprofene</td>
			<td style="width:71px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">Rimadyl vet</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chlorhexidine digluconate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9394</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Dental cement</td>
			<td style="width:71px;">DrguDent, Dentsply</td>
			<td style="width:119px;">REF 640 200 271</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:71px;">FaunaPharma</td>
			<td style="width:119px;">Rapidexon vet</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Disposable drills</td>
			<td style="width:71px;">Meisinger</td>
			<td style="width:119px;">HP 310&#160;104&#160;001&#160;001&#160;008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dulbeco&#8217;s PBS 10X</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D1408</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dumont #5 forceps, 110 mm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Ealing microelectrode puller</td>
			<td style="width:71px;">Ealing</td>
			<td style="width:119px;">50-2013</td>
			<td style="width:167px;">Vertical puller for glass pipette production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eyes-ointment</td>
			<td style="width:71px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">Viscotears</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foredom drill control</td>
			<td style="width:71px;">Foredom&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FM3545</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foredom micro motor handpiece</td>
			<td style="width:71px;">Foredom</td>
			<td style="width:119px;">MH-145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Gas anesthesia platform for mice</td>
			<td style="width:71px;">Stoelting</td>
			<td align="right" style="width:119px;">50264</td>
			<td style="width:167px;">Assembled on stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Hemostasis Collagen Sponge</td>
			<td style="width:71px;">Avitene, Ultrafoam BARD</td>
			<td style="width:119px;">Ref 1050050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:71px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine</td>
			<td style="width:71px;">Intervet</td>
			<td style="width:119px;">Ketaminol vet</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Mai Tai DeepSee laser</td>
			<td style="width:71px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal holder</td>
			<td style="width:71px;">Neurotar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro dressing forceps, 105 mm</td>
			<td style="width:71px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD302R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Microfil</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">MF34G-5</td>
			<td style="width:167px;">Micro syringe filling capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Multiphoton Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">FV1000MPE</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NanoFil Syringe 10 microliter</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">NANOFIL</td>
			<td style="width:167px;">Hamilton syringe</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Nonwoven swabs 5&#215;5</td>
			<td style="width:71px;">Molnlycke Health Care</td>
			<td style="width:119px;">Mesoft</td>
			<td style="width:167px;">Surgical tampons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyacrylic glue</td>
			<td style="width:71px;">Henkel</td>
			<td style="width:119px;">Loctite 401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Round glass coverslip&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 thickness&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Small animal stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:71px;">David Kopf Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">900</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Stoelting mouse and neonatal rat adaptor</td>
			<td style="width:71px;">Stoelting</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51625</td>
			<td style="width:167px;">Assembled on stereotaxic instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Student iris scissors, straight 11.5 cm</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Sulforhodamine 101</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">S-359</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-1</td>
			<td style="width:167px;">Microinjector and controller</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Xylazine</td>
			<td style="width:71px;">Bayer Health Care</td>
			<td style="width:119px;">Rompun vet</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging

Embora trauma cerebral aguda muitas vezes resulta de danos à cabeça em diferentes acidentes e afeta uma fração substancial da população, não existe um tratamento eficaz para ele ainda. Limitações dos modelos animais usados ​​atualmente impedem a compreensão do mecanismo de patologia. Microscopia Multiphoton permite o estudo de células e tecidos dentro cérebros de animais intactos longitudinalmente sob condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos dois modelos de lesão cerebral aguda estudados por meio de dois fótons de imagem de comportamento das células do cérebro em condições pós-traumáticas. A região do cérebro selecionado é ferido com uma agulha fina para produzir um trauma de largura controlada e profundidade no parênquima cerebral. O nosso método utiliza estereotáxico picada com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação simultânea de drogas. Propomos que este método pode ser utilizado como uma ferramenta avançada para estudar os mecanismos celulares de consequências fisiopatológicos de traumas agudos no cérebro dos mamíferos <em&gt; In vivo. Neste vídeo, nós combinamos lesão cerebral aguda com duas preparações: cranial janela e crânio de desbaste. Discutimos, também, vantagens e limitações de ambos os preparativos para várias sessões de imagem de regeneração cerebral após trauma.

Nós otimizamos dois procedimentos de operação: 1) janela craniana crônica e 2) desbaste crânio, para imagiologia cerebral pós-traumático em camundongos transgênicos. Representação esquemática das preparações experimentais é apresentada na Figura 1. Traumática por picada de agulha de aço de 0,3 mm de diâmetro externo (30 L) é aplicada ao poço perfurado (Figura 1A). A preparação janela craniana bem sucedido permite imagens em profundidades de até 650 mícrons abaixo da superfície pial (Figura 1B), enquanto desbaste crânio tende a impor um limite de cerca de 300 mm (Figura 1C), como demonstrado na reconstrução 3D de Thy1-YFP- H rato neurônios piramidais corticais. O trauma resultados picada em eliminação de dendritos e destruição de redes capilares em um volume controlado do córtex cerebral. Durante os primeiros dois dias, a área da lesão e o aumento do trauma induzido Blebbing dendrite e formação de dendrítica retracção bulbs nas áreas perilesion, tal como observado em microscópio utilizando multiphoton vivo (Figura 2). Foi realizada crânio desbaste para activação imagem e migração da microglia em ratinhos CX3CR1-EGFP imediatamente após a lesão (Figura 3A). A imagiologia de SHG oferece uma ferramenta valiosa para delinear com precisão o local da lesão (Figura 3B). Moléculas da matriz extracelular que produzem sinais SHG são grandemente enriquecido em parênquima cerebral no trauma picada. Em primeiro lugar, os processos microgliais finas são recuperados, em seguida, as células microgliais migrar para a fronteira do local da lesão (Figura 3A). Para estimar possíveis lesões induzidas pelo vidro fino pipeta de inserção e entrega de corante, realizamos experimentos de microscopia in vivo de dois fótons com Sulforodamina 101 microinjeção em ratos Thy1-YFP-H sem trauma cerebral. Imagens representativas mostradas na Figura 4 demonstram milhaslocal croinjection 3 horas após a injecção. O rastreio de inserção pipeta pode ser visto na meninges cerebrais visualizadas por SHG (Figura 4A). Os astrócitos são rotulados com Sulphorhodamine 101 introduzida através da injecção (Figura 4B). Dendritos expressando YFP sob Thy1 promotor não demonstram quaisquer sinais morfológicos de lesão como blebbing ou retração lâmpadas (Figura 4 C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51559/51559fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51559/51559fig1.jpg" /> Figura 1. O método de lesão cerebral aguda, em combinação com janela craniana ou preparações crânio finas combinadas com microscopia de dois fótons in vivo. A picada. Traumático por agulha de aço de 0,3 milímetros OD (30G) aplicado a bem da perfurado. A agulha é brevemente imersa no cérebro 0,5-2 mm de profundidade a partir do fundo do poço. B, C </strong&gt;. Reconstrução 3D de Thy1-YFP-H rato neurônios corticais piramidais em vista amarela e esquemática de preparações experimentais. O sinal de geração de segundo harmônico (SHG) de crânio diluído é mostrado em cinza (C). D. Campo de visão brilhante dos vasos sanguíneos superficiais através da janela de vidro imediatamente após a lesão aguda do cérebro. E. Diluído crânio antes da aplicação lesão. A região de interesse escolhida (quadro branco) e do local de aplicação picada (círculo vermelho). A área diferente (moldura vermelha) da região diluída deve ser trabalhada para monitorar possíveis artefatos induzida por cirurgia. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51559/51559fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51559/51559fig2.jpg" /> Figura 2. Exemplo de imagem multiphoton longitudinal do cérebro desenvolvimento trauma através do crânio diluída. A. Paravista p do local da lesão cercado por dendrites YFP-rotulados de neurônios corticais 20 min após trauma imposição, como fotografada através da preparação crânio diluída. B. Visão ampliada da área descrita no painel A. C. A mesma área do cérebro como em B, reimaged 5 dias após o trauma. Dendrite blebbing é mostrado com setas brancas, lâmpadas de retração dendríticas - com setas vermelhas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51559/51559fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51559/51559fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplos de inflamação monitoramento e ativação glia durante o desenvolvimento de trauma cerebral utilizando diferentes marcadores adequados para in vivo de proteínas de imagem multiphoton por exemplo fluorescentes, corantes e segundo sinal geração harmônica. As imagens foram adquiridas 3 horas após a lesão cerebral. <strong&gt; A. Expressando GFP microglia (verde) de ativação e migração após trauma cerebral aguda fotografada pela janela craniano em ratos CX3CR1-EGFP; geração de segundo harmônico (SHG) são mostradas em cinza. B. -Expressando GFP (verde) e 101 Sulforodamine-rotulado (vermelho) em ratinhos astrócitos GFAP-EGFP em torno do local da lesão, que é delineada pela geração do sinal harmónico segunda forte (cinzento) a partir de moléculas de matriz extracelular. As setas indicam exemplos de células microgliais (A) e os astrócitos (B) após a lesão. A fronteira local da lesão é identificado com o sinal de SHG e representado pela linha tracejada. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51559/51559fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51559/51559fig4.jpg" /> Figura 4. Exame de impacto tecido feito por injecção de solução através de uma micropipeta de vidro. A. Uma trace (shown com linha tracejada) em SHG visualizando meninges cerebrais 3 horas após a injecção. B. Os astrócitos marcadas com sulfo introduzidas pela injecção. C. Dendritos expressando YFP sob Thy1 promotor. D. Imagem combinada de A (SHG - cinza), B (astrócitos - vermelho), C (dendritos neuronais - amarelo).

Watch this Scientific Journal Video about Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging at JoVE.com

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

acute-brain-trauma-in-mice-followed-by-longitudinal-two-photon-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K visualizações.  University of Helsinki.  Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo. 

Vídeo: Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Pseudofracture: An Acute Peripheral Tissue Trauma Model

Following trauma there is an early hyper-reactive inflammatory response that can lead to multiple organ dysfunction and high mortality in trauma patients; this response is often accompanied by a delayed immunosuppression that adds the clinical complications of infection and can also increase mortality.1-9 Many studies have begun to assess these changes in the reactivity of the immune system following trauma.10-15 
Immunologic studies are greatly supported through the wide variety of transgenic and knockout mice available for in vivo modeling; these strains aid in detailed investigations to assess the molecular pathways involved in the immunologic responses.16-21
The challenge in experimental murine trauma modeling is long term investigation, as fracture fixation techniques in mice, can be complex and not easily reproducible.22-30
This pseudofracture model, an easily reproduced trauma model, overcomes these difficulties by immunologically mimicking an extremity fracture environment, while allowing freedom of movement in the animals and long term survival without the continual, prolonged use of anaesthesia. The intent is to recreate the features of long bone fracture; injured muscle and soft tissue are exposed to damaged bone and bone marrow without breaking the native bone.
The pseudofracture model consists of two parts: a bilateral muscle crush injury to the hindlimbs, followed by injection of a bone solution into these injured muscles. The bone solution is prepared by harvesting the long bones from both hindlimbs of an age- and weight-matched syngeneic donor. These bones are then crushed and resuspended in phosphate buffered saline to create the bone solution.
Bilateral femur fracture is a commonly used and well-established model of extremity trauma, and was the comparative model during the development of the pseudofracture model. Among the variety of available fracture models, we chose to use a closed method of fracture with soft tissue injury as our comparison to the pseudofracture, as we wanted a sterile yet proportionally severe peripheral tissue trauma model. 31
Hemorrhagic shock is a common finding in the setting of severe trauma, and the global hypoperfusion adds a very relevant element to a trauma model. 32-36 The pseudofracture model can be easily combined with a hemorrhagic shock model for a multiple trauma model of high severity. 37

Pseudofracture, a reproducible murine model of sterile musculoskeletal trauma, allows for evaluation of late term post-traumatic immune responses. This article describes the procedural execution of the model step by step, including the potential for experimental model combinations to permit study of multiple trauma.

Pseudofracture: Um Modelo de trauma agudo do tecido periférico

Following trauma there is an early hyper-reactive inflammatory response that can lead to multiple organ dysfunction and high mortality in trauma patients; ...

Medicina

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged mechanical ventilation, contributes to morbidity and mortality of critical illness, and studies on novel genetic or pharmacological targets are areas of intense investigation (1-3, 5, 8, 26, 30, 33-36). ALI is defined by the acute onset of the disease, which leads to non-cardiac pulmonary edema and subsequent impairment of pulmonary gas exchange (36). We have developed a murine model of ALI by using a pressure-controlled ventilation to induce ventilator-induced lung injury (2). For this purpose, C57BL/6 mice are anesthetized and a tracheotomy is performed followed by induction of ALI via mechanical ventilation. Mice are ventilated in a pressure-controlled setting with an inspiratory peak pressure of 45 mbar over 1 - 3 hours. As outcome parameters, pulmonary edema (wet-to-dry ratio), bronchoalveolar fluid albumin content, bronchoalveolar fluid and pulmonary tissue myeloperoxidase content and pulmonary gas exchange are assessed (2). Using this technique we could show that it sufficiently induces acute lung inflammation and can distinguish between different treatment groups or genotypes (1-3, 5). Therefore this technique may be helpful for researchers who pursue molecular mechanisms involved in ALI using a genetic approach in mice with gene-targeted deletion.

A murine model for ventilator induced lung injury is an important tool to study an acute lung injury in vivo. Here, we report an easy applicable in situ model for acute lung injury using high-pressure mechanical ventilation to induce acute failure of the lung.

Ventilação a pressão controlada para induzir lesão pulmonar aguda em ratos

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

O Uso de desafio-Farmacológicas fMRI em pesquisa pré-clínica: aplicação ao sistema 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Use of genetically modified mice enhances our understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders such as a spinal cord injury (SCI). Freehand manual control used to produce a laceration model of SCI creates inconsistent injuries often associated with a crush or contusion component and, therefore, a novel technique was developed. Our model of cervical laceration SCI has resolved inherent difficulties with the freehand method by incorporating 1) cervical vertebral stabilization by vertebral facet fixation, 2) enhanced spinal cord exposure, and 3) creation of a reproducible laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm in depth without associated contusion. Compared to the standard methods of creating a SCI laceration such as freehand use of a scalpel or scissors, our method has produced a consistent lesion. This method is useful for studies on axonal regeneration of corticospinal, rubrospinal, and dorsal ascending tracts.

A novel technique to create a reproducible in vivo model of cervical spinal cord laceration injury in the mouse is described. This technique is based on spine stabilization by fixation of the cervical facets and laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm.

Controlada por laceração do colo do útero em camundongos

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...