Agradecemos a todos os membros da Lenne e laboratórios Bertrand, em particular Olivier Blanc para desenvolvimento de software e Jérémie Capoulade para discussão. Agradecemos também a facilidade de imagem PICsL-IBDM, em particular Claude Moretti e Brice Detailleur para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios Atip do CNRS (a P.-FL e VB), o Labex INFORMAR concessão (para P.-FL e VB) e uma bolsa da Sanofi-Aventis (para VB). Reconhecemos infraestrutura France-BioImaging apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chamada &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Configuração da Folha de Luz eo Caminho de Detecção A Figura 1 apresenta um esquema geral da configuração óptica. <ol><li> Coloque e fixe o microscópio e os lasers na mesa óptica. </li><li> Combine lasers 488 nm, 561 nm e 405 nm, com os correspondentes espelhos dicróicas. Após os espelhos dicróicos, os lasers têm de ser precisamente co-alinhadas. Note-se que a escolha dos comprimentos de onda de laser, os espelhos dicróicos, filtros ópticos e é determinada a partir dos espectros de absorção dos marcadores fluorescentes específicos utilizados nas experiências. </li><li> Coloque o filtro sintonizável acústico-ótico (AOTF). Use a folha de teste fornecido pelo fornecedor para ajustar a frequência ea potência do AOTF. Quando bem alinhada, cerca de 90% da energia do laser é transmitido a um máximo de ajuste tal como medido por um powermeter. Note que alguns lasers pode ser totalmente controlado por software, o que poderia tornar o AOTF desnecessário. </li><li> Coloque e fixeo telescópio. Note-se que o telescópio é composta por duas lentes que ampliam o feixe com uma largura igual ou maior do que o diâmetro da abertura da parte de trás da lente objectiva iluminação. A lente com distância focal menor deve vir em primeiro lugar. </li><li> Lugar, alinhar e fixar o periscópio trazendo para cima do percurso óptico mais perto da abertura da parte de trás da lente cilíndrica. Note-se que os dois espelhos do periscópio são montados de uma forma que o seu eixo longo está colocando na inclinação do espelho para refletir o feixe totalmente expandida. </li><li> Coloque a lente cilíndrica próxima da saída de periscópio. Note-se que a lente cilíndrica focaliza o feixe em um sentido e deixa colimada na outra direção, formando assim uma folha de luz. </li><li> Recentrar a folha de luz resultante usando a lente objetiva iluminação. Note-se que o ponto focal imagem da objectiva de iluminação deve coincidir com o ponto focal do objecto o objectivo de detecção. Projeto do feixeem uma tela (por exemplo, uma parede) em uma longa distância. Mova o objetivo de iluminação ao longo do eixo do feixe de iluminação para obter na tela contornos nítidos da folha de luz. </li><li> Coloque a linha quad (405/488/561/638) filtro de emissão no lugar reservado no microscópio (cubo). </li><li> Coloque a câmara EMCCD na porta de saída do microscópio. </li><li> Fixar o primeiro estágio de translação manual sobre o palco de microscópio por meio de parafusos em furos na platina do microscópio. Note-se que a borda da plataforma de translação tem de ser posicionado a cerca de 2 cm de distância a partir do centro da platina do microscópio, de modo a que a tina é centrado por baixo da lente objectiva de detecção. </li><li> Fixar o segundo estágio de translação manual sobre o primeiro. As direções das duas etapas tem que ser perpendicular (X e Y traduções). </li><li> Fixar a fase Z piezoeléctrico no topo das duas fases anteriores. Note-se que uma plataforma motorizada pode ser utilizado em vez do estágio piezeléctrico. </li><li> Fixe o holde tinar (ver Figura 2), na parte superior das fases. A cuvete irá, assim, ser colocado na intersecção do caminho de iluminação e o caminho de detecção, que são perpendiculares um ao outro. </li></ol> 2. Verificar a folha de luz <ol><li> Encha uma tina de vidro com solução fluorescente, e colocá-lo no porta-amostras no cruzamento dos dois caminhos ópticos. A folha de luz é assim visível. Tem de ser horizontal, e simétrico / centrada em relação à lente objectiva de detecção. </li><li> Retirar a lente cilíndrica e adquirir uma imagem para medir a espessura da folha de luz. Note-se que a espessura da folha de luz depende da abertura numérica (AN) da iluminação da lente objectiva (cerca de 3-4 mm para NA = 0,3). Note-se que para uma dada lente, a espessura da folha, a luz pode ser aumentada reduzindo o tamanho do feixe de entrar na abertura traseira, com uma fenda. Note-se que as microesferas fluorescentes pode ser utilizado para medir o machadoial e resolução lateral do microscópio. </li><li> Volte a colocar a lente cilíndrica antes de iniciar o experimento. </li></ol> 3. A montagem de C. elegans Embriões Os passos seguintes são apresentados na Figura 3. <ol><li> Use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço de uma lâmina de vidro de 10 x 20 x 1 mm. </li><li> Prepare 5% bacto-agar na água, fervê-lo e mantê-lo em um bloco de aquecimento a 60 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul de poli-L-lisina sobre um lado da peça de corte da lâmina, deixá-lo secar. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio no banco e corrigi-lo. </li><li> Justapor a peça de corte de lâmina com a lâmina fixa e adicionar uma gota de agar derretido no topo. Esprema o agar usando outra lâmina de microscópio limpa para obter um bloco de ágar fina. </li><li> Permitir que o bloco de ágar para secar antes de retirar o top slide. </li><li> Cortar a almofada de ágar sobre o lado da lâmina fixa, de modo a deixar um excesso de cerca de 3 mm of agar e remova cuidadosamente a lâmina fixa. </li><li> Adicionar 50 mL de poli-L-lisina sobre o agar e deixe secar completamente. </li><li> Coloque vermes grávidas em meio M9 em um vidro de relógio. </li><li> Cortar os vermes ao nível da vulva com um bisturi para libertar os embriões. </li><li> Sob um binóculo identificar os embriões na fase de interesse e recolhê-las usando uma pipeta microcapilar. </li><li> Colocar os embriões na parte do agar revestidos com poli-L-lisina, que se projecta a partir da peça de corte da lâmina. Coloque os embriões apenas junto à fronteira do slide. Não posicione os embriões na fronteira do agar, porque não vai ser estável o suficiente. Remover cuidadosamente o líquido, de modo que os embriões vai ficar sobre a camada de poli-L-lisina. </li><li> Alinhar rapidamente os embriões para evitar a dessecação. </li><li> Colocar a lâmina de corte em um prato de plástico Petri e adicione delicadamente meio M9 para cobrir o slide. </li><li> Verifique sob um binóculo que os ovos ainda estão presos no ágar. </li&gt; </ol> 4. Gravação de C. Desenvolvimento elegans <ol><li> Fixar a preparação anterior (corte deslizante, além de embriões de agar) no suporte de amostra e coloca-se numa cuvete. Figura 4 descreve o titular caseiro e A Figura 5 mostra uma vista da tina em contexto de observação. </li><li> Fixar a cuvete na fase piezoeléctrico. </li><li> Identificar a posição dos embriões com iluminação de campo brilhante. </li><li> Inicie o software feito em casa controlando a AOTF, a câmera eo estágio piezoelétrico. Note-se que um software livre, tal como micromanager, também pode ser utilizado. </li><li> Selecione a linha de laser e de energia (AOTF). </li><li> Ajustar a posição da folha de luz utilizando a fase três instruções de suporte da lente cilíndrica e a lente de iluminação. Mover o palco ao longo da direcção lateral (X) para obter o sinal mais brilhante. Ajustar então a posição Z da folha de luz, e a posição longitudinal (Y) para obter the melhor relação sinal-ruído. Note-se que a posição do foco folha de luz pode ter de ser ajustada a partir de um embrião de um outro para corrigir as diferenças de comprimento de caminho de luz. </li><li> Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione o tempo de exposição, o ganho, o tempo entre duas imagens, bem como o número de imagens a serem adquiridas, eo poder do laser. Para 2 aquisição de cores, selecione uma segunda linha de laser. Duas imagens coloridas são adquiridos de forma consecutiva. </li><li> Para adquirir pilha az, selecione também a distância entre as duas fatias, eo início e fim posições do piezoelétrico. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve uma configuração fácil de microscopia folha de luz para imagem in vivo de C. elegans embriões. Os elementos ópticos necessários para criar e alinhar a folha de luz, incluindo lasers, expansor de feixe, colimação e lentes de foco, pode ser facilmente montado em um banco óptico. Em combinação com um microscópio vertical para o caminho detecção ea câmera, este fornece uma solução simples de configurar uma folha de microscópio de luz. Essa geometria faz com que o ambiente de exemplo simples. O espécime vivo é colocado em uma cuba de vidro, que é realizada, posicionado e movido por um pequeno conjunto de peças mecânicas. Como microscopia iluminação folha é uma técnica de campo grande com capacidade de corte, apenas um único eixo motorizado movimento é necessário para imagens 3D. Isto limita o requisito de sincronização para um único elemento de varrimento e facilita o desenvolvimento do software. Comparado com ISPIM 6 nossa geomet verticalry permite o uso de elevados lente objectiva NA para detecção. Comparada com as configurações SPIM com lentes objectivas em relação ao plano horizontal da montagem da amostra e a imagem de uma série de embriões são mais fáceis. Ao todo, a implementação desta técnica é simples e pode ser alcançado com pouca experiência em ótica. Isto é uma alternativa mais barata a microscopia confocal, com as vantagens de uma maior velocidade e fototoxicidade reduzida, mas inconveniente de uma resolução axial inferior. Também desenvolvemos uma maneira fácil e reprodutível para montar C. embriões elegans para imagem in vivo utilizando este sistema. O procedimento de montagem é rápida (15 minutos) e é adequado para experiências diárias. Para C. elegans imagem, as vantagens desta configuração simples são pelo menos duas dobras: (i) em imagem toto é possível sem rotação e, portanto, a reconstrução 3D é simples; (Ii) a montagem da amostra é fácil e vários embriões podem ser visualizados sequencialmenteno mesmo slide. Nós mostramos exemplos de filmes de lapso de tempo com resolução temporal suficiente para observar as divisões celulares e alterações na forma celular. O poder de microscopia folha de luz para estudar C. desenvolvimento elegans também foi ilustrado recentemente por outros 6, 7, 8. Portanto, esta técnica vai ser muito útil para estudar a morfogénese e padronização da C. elegans embrião. Este sistema pode também ser utilizado para analisar o desenvolvimento de outros organismos modelo? É importante reconhecer que a implementação de microscopia de iluminação folha para pequenas e transparente organismo, como C. elegans é menos rigorosa do que para organismos maiores, como embriões de Drosophila. In toto imagens de Drosophila normalmente requer rotação e multi-view reconstruções 9, 10. Excitação de dois lados com lentes objetivas de excitação colineares também pode reduzir os efeitos de sombra causados ​​pela attenuatíon da luz 11. No entanto, a configuração aqui apresentada é ainda adaptado para a imagem de um lado dos embriões de Drosophila, com baixo branqueamento e baixo photoxicity. Esta configuração também pode ser útil para imagem pequenas e transparentes embriões como ascídias ou peixe-zebra.

A formação ea formação de um organismo envolve movimentos celulares, mudanças no formato da célula, divisão celular e diferenciação celular. Compreender a progressão e coordenação destes processos exigem ferramentas de imagem rápidos com capacidade de três dimensões e resolução subcelular. Entre as técnicas com estes em recursos de imagem in vivo, microscopia de iluminação luz folha também chamada microscopia de iluminação avião single / seletiva tem a vantagem única de produzir efeitos de baixa phototoxic e baixa fotodegradação 1,2. Em microscopia de iluminação da folha, a amostra é iluminada a partir do lado de uma folha de luz, o qual executa o corte óptico. O caminho de iluminação e o caminho de detecção são perpendiculares uns aos outros e a folha leve está alinhado de forma a coincidir com o objecto plano focal da lente objectiva de detecção. A amostra é colocada na intersecção dos dois caminhos, umnd pode ser movido ao longo do eixo para permitir a detecção de imagem 3D. Apenas o plano de interesse é iluminado e todos os pontos deste plano são detectados ao mesmo tempo. Isto aumenta significativamente a velocidade de aquisição e reduz a fotodegradação, bem como fototoxicidade em comparação com microscopia confocal 3. Praticamente, microscopia de iluminação folha é fácil de configurar e align: para dois imagem dimensional, sem varredura é necessário nem para a parte de detecção, nem para a parte de iluminação; como uma técnica de campo largo com capacidade de corte, a imagem tridimensional pode ser obtida através de um único movimento do eixo da fase, com a amostra. Aqui apresentamos a criação de um microscópio simples folha de luz e sua implementação no toto imagens de C. elegans embriões. C. elegans embriões são bem adaptados para viver in vivo imaging devido a sua transparência, linhagem invariante e estereotipada célula posiciona 4,5. A configuração da folha de luz desenvolvido baseia-se num microscópio vertical padrão para a detecção. O protocolo apresentado abaixo detalha como construir e alinhar o módulo de excitação / caminho, testar e caracterizar a folha de luz e montar a amostra para geração de imagens 3D. Ele também fornece exemplos de filmes time-lapse adquiridos com a configuração em várias cepas expressando marcadores fluorescentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Técnicas rápidas e baixas de imagem phototoxic são pré-requisito para estudar o desenvolvimento de organismos in toto. Microscopia folha de luz com base reduz foto-branqueamento e ação fototóxica em comparação com a microscopia confocal, proporcionando imagens em 3D com resolução subcelular. Aqui apresentamos a configuração de um microscópio folha base de luz, que é composto por um microscópio vertical e um pequeno conjunto de elementos opto-mecânico para a geração da folha de luz. O protocolo descreve como construir, alinhar o microscópio e caracterizar a folha de luz. Além disso, ele detalha como implementar o método no toto imagens de C. elegans embriões utilizando uma câmara de observação simples. O método permite a captura de 3D e duas cores filmes time-lapse mais algumas horas de desenvolvimento. Isso deve facilitar o rastreamento de forma da célula, as divisões celulares e proteínas marcadas por longos períodos de tempo.

Três experimentos de gravação de lapso de tempo 3D a partir de três diferentes C. elegans estirpes ilustrar o tipo de dados que podem ser obtidos usando a configuração do microscópio folha de luz descrita acima. Nós verificamos que, nestas condições, os embriões se desenvolvem em velocidade normal e sobreviver a imagem, de acordo com relatórios anteriores, indicando que a imagem SPIM provoca apenas baixos níveis de fototoxicidade em C. elegans embriões 6,7. A primeira linhagem expressa uma histona fundida a GFP (zuIs178; stIs10024). A gravação foi realizada durante 2 horas, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 37 seg. Figura 6 ilustra um plano da pilha em diferentes pontos de tempo. Ambos os núcleos interphasic (seta) e cromatina condensada mitótico (cabeça de seta) são claramente visíveis. A segunda estirpe expressa um tubulina fundido a GFP (ruIs57) e uma histonafundido com mCherry (itIs37; stIs10226). A gravação foi realizada durante 16 min, com uma pilha de fatias 20 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 105 s. Figura 7 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. O filme associado 1 apresenta reconstruções 3D em três momentos sucessivos. Durante a divisão, o fuso mitótico (verde) e cromossomos condensados ​​(vermelho) são claramente visíveis, permitindo o acompanhamento das orientações de divisão celular durante o desenvolvimento. A terceira estirpe expressa a apolipoproteína VIT-2 fundido a GFP (pwIs23) e uma membrana ligada mCherry (ltIs44). O registo foi feito durante 25 minutos, com uma pilha de fatias 10 (distância entre fatias de 1 um) feita a cada 30 seg. Figura 8 ilustra diferentes planos da pilha e diferentes pontos de tempo. Os movimentos rápidos das partículas de gema de lipoproteínas (verde) no interior das células podem ser facilmenteseguido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: configuração óptica SPIM composto da iluminação e detecção de unidades, frente e vista para o fundo. Na unidade de iluminação, os lasers combinados pelos espelhos dicróicos entrar AOTF, o qual controla a potência de cada laser independentemente. Em seguida, o telescópio aumenta o tamanho do feixe por 4 vezes e a periscópio traz para a altura do microscópio. A lente cilíndrica forma a folha de luz, que é reorientada pelo objectivo iluminação. A unidade de detecção é integrado no microscópio vertical e é composta principalmente por a lente de detecção, o filtro, o tubo de lente e o EMCCD. A amostra é colocada na intersecção entre os caminhos de iluminação e detecção. A fase piezoeléctrico permite vertical (Z) deslocamentos de amostrapara a aquisição 3D. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:. Titular Cuvette O portador consiste em três placas de alumínio e é enroscado sobre a fase piezoeléctrico. A cuba de vidro é realizado por uma mola (em vermelho). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Montagem protocolo de C. elegans embriões para experiências SPIM. A peça cortada de vidro é revestido com poli-L-lisina. Uma almofada de ágar é posicionada sobre a superfície revestida. Poli-L-lisina Adiciona-se então para a almofada de ágar. Finalmente, C. elegans embriões são alinhados na almofada de ágar revestidos com poli-L-lisina. Figura 4: Exemplo de titular. O detentor encaixa às dimensões interiores da tina de vidro. Duas molas (em vermelho) manter a lâmina de vidro (descrito na Figura 3). Este suporte é então colocado dentro da tina de vidro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:... Suporte da amostra no contexto observação embriões são imobilizadas sobre a lâmina de vidro de acordo com o protocolo resumido na Figura 3 A corrediça é mantida pelo suporte de amostras descrito na Figura 4 O suporte de amostra é inserida na cuvete de vidro, detida pelo titular descrito na Figura 2. A folha de luz é horizontal e illuminates os embriões a partir do lado. A lente da objectiva de detecção esteja na vertical, por cima da amostra. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: a gravação de um C. elegans embrião expressar uma fusão histona :: GFP imagens individuais de um embrião transgênico avião expressar uma histona :: fusão GFP (zuIs178; stIs10024) em momentos diferentes imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D:.. pilhas feitas de 20 fatias ( distância entre fatias de 1 mm); tempo de exposição por fatia: 30 ms; intervalo de tempo entre as pilhas: 37 seg; tempo de aquisição total: 2 horas. Arrow: núcleo interphasic, cabeça da seta: cromatina condensada mitótico. No instante t = 0 min, o embrião está na fase de 2 células-e a t = 120 min, o embrião contém cerca de 70 células como esperado sob s normais de desenvolvimentoxixi (notar que apenas as células contidas num mesmo plano são visíveis nas imagens e não todas as células do embrião). O poder de iluminação foi de 30 μW a 488 nm (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7: A gravação de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP e uma histona :: fusão mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando um Tubulin :: fusão GFP (ruIs57) e um Histone :: fusão mCherry (itIs37; stIs10226). Condições de gravação: a aquisição de uma pilha de 20 fatias (distância entre fatias 1mm) a cada 105 seg; tempo de aquisição total: 16 min; tempo de exposição: 200 ms para cada canal. O painel A mostra 10 fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 210 seg. O poder de iluminação foi de 30 μW e 300 μW, para 488 e 561 nm, respectivamente lasers (medido na saída do objectivo de iluminação). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8: a gravação de um C. elegans embrião expressando uma VIT-2 :: GFP Fusion e um alvo a membrana mCherry. Imagens extraídas de uma gravação de lapso de tempo 3D de um C. elegans embrião expressando uma fusão VIT-2 :: GFP (PWIs23) e um mCherry direcionados à membrana (ltIs44). Condições de gravação: aquisição de uma pilha de 10 fatias (distância entre fatias 1 mícron) a cada 30 seg; tempo de aquisição total: 25 min; tempo de exposição por canal: 200 ms. O painel A mostra as 5 primeiras fatias da mesma pilha. O painel B mostra a mesma fatia cada 30seg. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K visualizações.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões. 

Vídeo: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biologia

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Componentes principais do microscópio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...