Interna fundos institucionais e as Ciências Biológicas Scholars Program da Universidade de Michigan apoiaram este trabalho.

Preparação Worm <ol><li> Transferência L4 worms larval de placas apropriadas 18-24hs antes da imagem 22. Isso irá garantir que você tenha ovo-rolamento adultos para uma ampla oferta de embriões. </li><li> Prepare os tubos de vaselina e Agarose. Nós preparamos vários tubos de 15mL falcon pelo derretimento vaselina num copo no microondas e dispensa em 05/04 alíquota mL por tubo. Da mesma forma derreter 2-3% (w / v) em tampão de Agarose (M9 ou Egg buffer) e 4-5 mL alíquota em tubos falcon. Tenha cuidado para não ferver em excesso, a fim de minimizar a evaporação. No dia da imagem, derreta um tubo de vaselina em um bloco de aquecimento 65-70 ° C e derreter um tubo de agarose no microondas, mais uma vez ter cuidado para minimizar a ferver sobre. Armazenar os tubos no bloco de calor para manter a vaselina e os Agarose no estado fundido. </li><li> Faça Agarose pad. Posição uma lâmina de microscopia novo entre dois slides guia, que são cobertos por lâminas de uma única camada de fita de laboratório comum adere a parte superior e inferior de cada slide guia. Use uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para colocar 2-3 gotas de agarose derretida no novo slide. Cubra com um slide 2 nd perpendicular ao slide original, para que ela cobre e ajuda a espalhar a Agarose para criar uma almofada fina quadrados. O slide 2 º deve descansar acima da fita nos slides guia. A concentração de Agarose pode ser aumentada para 5% para almofadas mais espessas. </li><li> Usando um escopo de dissecação e um fio de platina &quot;pick&quot;, a transferência de dois vermes adultos a uma queda de 9 12μL de tampão M9 ou ovo em uma lamela mm x 18 mm 18. </li><li> Corte worms aberta com uma agulha (usamos 27G1 / 2 agulhas) ou bisturi para liberar embriões. Tente cortar no meio do worm. </li><li> Menor Agarose pad (com o lado agar para baixo) para a lamela 18x18 milímetros contendo os embriões. Agar guarnição que se estende desde a borda da lamínula com uma lâmina de barbear. </li><li> Seal Coverslip usando um pincel ou vara de madeira fina para aplicar a vaselina derretida para todas as quatro bordas da lamínula. </li></ol> Alternativa para montagens agar estão pendurados cai 23 se os embriões são suscetíveis à pressão (ou seja, se a casca do ovo não faz corretamente). Imagem também pode ser realizada dentro do útero a seguir fertilização ou eventos precoces, como a meiose. Worms devem ser anestesiados com Levamisole 24. A fim de aumentar o número de embriões a partir de um determinado estágio de desenvolvimento, worms várias pode ser dissecado em um tempo e os embriões posicionadas juntas delicadamente usando uma ponta fina-pipeta ou uma escova de cílios ou pipetar à boca. 4D Nomarski DIC (contraste de interferência diferencial) Filmes <ol start="8"><li> Ligue o microscópio BX61 Olympus. Como a câmera é sensível a EM ondas emitidas por outros dispositivos que está ligado passado, a lâmpada de mercúrio (se necessário, para GFP ou fluorescência) em primeiro lugar. Iniciar Micro Manager-uma vez que tudo está ligado. Escolha o arquivo de configuração adequada para imagem DIC ou fluorescentes. A principal diferença é que o arquivo DIC não inclui controle de obturador fluorescente. Cada arquivo também seleciona o cubo de filtro apropriado e ajuste de ganho da câmera. </li><li> Encontrar embriões no microscópio utilizando objetiva de 10x. Procure perto de corpos sem-fim para os grupos de embriões jovens a fim de obter vários embriões dentro do campo de imagem. Evite embriões dentro do worm para melhores imagens. </li><li> Utilizando o interruptor de software para uma maior ampliação (40x a 100x) e resolução (NA 0,9-1,4) O objectivo para a imagem latente. </li><li> Ajuste Nomarski DIC Optics (Os seguintes sites contêm explicação útil da óptica DIC ea terminologia; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Em nosso Olympus BX61 os componentes importantes são: <ol><li> Polarizador - controle deslizante abaixo do condensador </li><li> Prism condensador Wollaston - torre no condensador, logo abaixo do palco. </li><li> Prism Wollaston objetivo - controle deslizante abaixo do filtro de cubos </li><li> 2 nd polarizador (analisador) - cubo de filtro na posição DIC </li></ol></li><li> Interruptor Cube Filtro para DIC para posicionar o Analyzer (2 polarizador nd) no caminho da luz (software deve fazer isso no arranque). </li><li> Certifique-se que os dois polarizadores estão devidamente alinhados (cruzados). Quando ambos os prismas Wollaston estão fora do caminho da luz do campo de visão deve ser escura. Se necessário, gire o polarizador abaixo do condensador até que isso seja correto. </li><li> Insira o objetivo (superior) Prism Wollaston no caminho da luz. </li><li> Gire o revólver no condensador para selecionar o prisma Wollaston que corresponde ao objetivo que você está usando. </li><li> Ajuste o controle deslizante abaixo desta torre para combinar NA da lente. </li><li> Foco do condensador para a iluminação Koehler ideal. </li><li> Ajustar o superior Wollaston Prism para obter um contraste ideal, girando o botão do controle deslizante. </li><li> Outras configurações de inicialização controladas por software incluem o ganho de câmera (definido como 0) e mudar para salvar arquivos como 8-bit não arquivos TIFF de 16 bits. </li></ol></li><li> Ajustar o nível de luz para dar boa imagem. (Geralmente usam 4,7 Volts) (controlada via software). Nós preferimos a iluminar a amostra de modo que o mais brilhante pixels são apenas abaixo dos níveis de saturação. Bom DIC resultados óptica em uma imagem com um olhar 3-dimensional, onde os grânulos da gema no embrião destacam-se claramente. Em alternativa, este pode ser descrito como se a luz que ilumina a amostra aparece para brilhar a partir de um ângulo de modo que um lado da amostra (ou características da amostra) é iluminado brilhantemente e do lado oposto está nas sombras e aparece mais escura. </li><li> Selecione região de interesse (ROI) para incluir os embriões que você quer para a imagem, clique em conjunto de botões ROI para reduzir janela. </li><li> Abrir a janela de aquisição multi-dimensional. Selecione Z-stacks (fatias) e Pontos de Time. </li><li> Use botão de foco microscópio para encontrar o fundo do embrião (plano focal passado, com alguns grânulos da gema em foco). Clique em baixo Select. Repita o procedimento para identificar e definir o topo do embrião. Normalmente, usamos um tamanho do passo micron e acabar com ~ 20 aviões focal. Em geral, coletar vários planos focais em cada momento, porque os embriões e células são relativamente grosso. Além disso, especialmente quando as células começam a se dividir em diferentes orientações podem deslocar em torno de outras células no embrião movê-los dentro ou fora do plano focal original. Se o seu microscópio não tem um motor de foco você pode ajustar manualmente o foco para seguir o processo de celular ou você está interessado. </li><li> Número de entrada de pontos de tempo e intervalo de tempo necessário. Nós usamos geralmente intervalo de 15 segundos ea um máximo de 500 pontos tempo. Começamos com pontos mais tempo do que vamos precisar parar a aquisição e quando desejar. Se você é imagem múltiplos planos focais, certifique-se que há tempo suficiente para adquirir todos os planos focais no intervalo entre os pontos de tempo. </li><li> Selecionar ou criar um local para salvar os dados. Certifique-se que o software é configurado para exibir a última imagem só. Dê um nome ao arquivo e clique em Acquire. Monitorar a aquisição de imagem automatizado para os primeiros pontos pouco tempo para garantir que ele está funcionando corretamente. </li><li> Clique parar quando quiser parar a aquisição, mude para objetiva de 10x e preparar o próximo slide. </li><li> Quando terminar de imagem remover componentes DIC do caminho da luz. Óleo limpo off objetivo se necessário. Desligue tudo começando com a câmera. </li></ol> Filmes GFP <ol start="20"><li> Iniciar microscópio e encontrar embriões como acima. Use arquivo de configuração que inclui o controle de software do obturador fluorescente. </li><li> Certifique-se que o prisma superior DIC (slider) não está no caminho de luz. </li><li> Interruptor Cube filtro para FITC / GFP (definido automaticamente na inicialização) </li><li> Alterar o ganho da câmera para 255 e arquivo de imagem para 16-bit Tiff (definido automaticamente na inicialização com esse arquivo de configuração). </li><li> Desligue a luz branca. </li><li> Clique ao vivo de imagens para visualização da imagem. Trabalhar rapidamente para minimizar a exposição à luz. Alternativamente use Imagem Snap para coletar única imagem. </li><li> Ajuste Mercury poder bulbo / filtros de densidade neutra, comprimento exposição para obter uma boa imagem. Em geral, você deve usar luz atingindo o mínimo de amostra para obter os dados que pretende reduzir photodamage para a célula e fotodegradação dos sinais de fluorescência. </li><li> Configurar intervalo de tempo, número de pontos de tempo e número de aviões focal. Muitas vezes usamos 10/05 intervalos de um segundo plano focal e 1-3. </li><li> Selecione ROI e definir parâmetros para aquisição de imagem, como descrito anteriormente em Passos 13-19. </li></ol> Filmes analisando <ol start="29"><li> Dados serão guardados para a pasta com o nome digitado e conter uma série de arquivos para cada imagem tiff da pilha 4D, um arquivo de texto e um arquivo xml contendo metadados, tais como níveis de exposição e intervalos de tempo. </li><li> As imagens TIFF podem ser abertos por ImageJ através de dois métodos. O primeiro (um método) é o mais simples e também ler os metadados de cada arquivo. A segunda (método b) é capaz de usar a memória virtual para abrir arquivos que são maiores do que a quantidade de memória alocada para ImageJ, mas não inclui os metadados. <ol class="lalpha"><li> Usando Micro-Manager Plugin <ol><li> Micro-Manager é construído sobre e usa ImageJ (ele instala uma nova versão do ImageJ que será diferente de qualquer outra versão que você pode ter instalado anteriormente) e inclui um plugin para abrir dados. Alternativamente, você pode copiar o conteúdo da pasta Micro-Manager-1.3/plugins para a pasta plugins para outra versão do ImageJ. </li><li> Ir para o menu Plugins, selecione Micro-Manager e, em seguida, File Manager Micro-Open. </li><li> Selecione a pasta que contém os dados que deseja visualizar e clique ok. </li><li> Jogue através das dimensões Z e T. </li></ol></li><li> Usando LOCI plugin para abrir filmes com Importador BioFormats. <ol><li> Xml e transferir os arquivos txt da pasta contendo os arquivos de tiff e renomear os dois arquivos para corresponder ao nome do conjunto de dados. </li><li> Dentro ImageJ, vá para o Plugins no menu suspenso, selecione LOCI e então ou Data Browser ou Bio-Formatos de importação. </li><li> Encontre a pasta com as pilhas a sua tiff. Clique sobre o arquivo tiff em primeiro lugar, em seguida, abra. </li><li> Ver pilha com Hyperstack. Sob organização Dataset: Selecione Arquivos de Grupo com dimensões Trocar nomes similares, e Abra todas as séries. Sob gestão da memória: Selecione: Use pilha virtual (especialmente para grandes conjuntos de dados). Clique ok </li><li> O plugin irá determinar as dimensões do conjunto de dados (número de pontos no tempo e aviões focal) e exibir o intervalo entre um conjunto de &lt;&gt; colchetes. Clique em OK ou alterar o número de pontos no tempo e / ou planos focais para abrir. </li><li> Confirmar que dimensão corresponde a cada série. </li><li> Jogue através das dimensões Z e T. </li></ol></li></ol></li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Stills de um filme ilustrando DIC Nomarski normais eventos celulares durante o início C. elegans desenvolvimento embrionário: migração pronuclear (0-5:45), primeira divisão assimétrica (6:45-14:45) e segunda divisão assíncrona (14:45-27:00). Os dados foram coletados com uma lente 60x NA 1,35. 20 aviões focal em intervalos de 1 micron foram coletados a cada 15 segundos de exposição com 40 mS. As imagens foram mudados de modo que é posterior à direita e ventral é baixo. Bar escala representam 10 microns. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Stills de um filme fluorescentes ilustrando os movimentos dinâmicos de uma subunidade GFP-rotulados do complexo de passageiros cromossomo (AR-2) presentes em cromossomos de metáfase anáfase de início (A a C) antes de aparecer na midzone fuso em anáfase até citocinese completa (C a F). Os dados foram coletados com uma lente 60x NA 1,35. Um único plano focal foi coletada a cada 10 segundos de exposição com 50 ms. As imagens foram mudados de modo que é posterior à direita. Bar escala representam 10 microns. Filme 1 Filme Nomarski de Wild-Type Embryo. Filme correspondente a Figura 1. Posterior é para a parte inferior direita e ventral é o inferior esquerdo. Mostra um único plano focal do conjunto de dados original. A imagem foi recolhida a cada 15 segundos e reproduzir é fixado em 14 quadros por segundo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Clique aqui para assistir vídeo</a> Filme Movie 2 fluorescentes de tipo selvagem embrião expressando GFP:: AIR-2. Filme correspondente à Figura 2. Posterior é no canto superior direito. Filme foi coletado como um único plano focal. A imagem foi recolhida a cada 10 segundos e reproduzir é fixado em 14 quadros por segundo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Clique aqui para assistir vídeo</a>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Uma consideração importante para a imagem latente de lapso de tempo viver é preservar a integridade e viabilidade da célula e do organismo. Microscopia DIC fornece o benefício que a amostra não é exposto à luz ultravioleta e aquecimento excessivo da fonte de iluminação. Microscopia DIC é adequado para detectar a migração celular e alterações nas células forma como citocinese e identificar algumas estruturas subcelulares, como o fuso mitótico e membrana nuclear. Imagens de fluorescência de proteínas repórter complementa microscopia DIC, identificando adicionais compartimentos subcelulares e permitindo a visualização de proteínas específicas. Para mitigar os riscos de fototoxicidade e danos ao embrião durante a imagens de fluorescência, que geralmente aumentam o ganho digitais da câmera, para compensar a intensidade da luz UV e duração reduzida de iluminação. Para fraco fluorescentes repórteres transgênicos, algoritmos de deconvolução para reatribuir algoritmos fora de foco de luz ou deblurring reduzir o fundo pode melhorar a qualidade das imagens capturadas. Enquanto microscópios avançados, tais como sistemas confocal ou multifotônica às vezes são necessários, temos verificado que muitos repórteres fluorescentes podem ser visualizados usando esta configuração de microscópio de epifluorescência, produzindo imagens de alta qualidade. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), além de ser livre, salva os arquivos diretamente para o formato TIFF em vez de formatos de arquivos proprietários de muitos pacotes de software comercial. Este simplifica significativamente a análise de nossos dados, eliminando a etapa de conversão de arquivos necessários para ler os arquivos de imagem em ImageJ, Photoshop e software de edição de imagem.

Olympus BX61 microscópio com câmera Orca Hamamatsu-ER. 10x Plano Fluorita (NA 0,3) e PlanAchromat 60x (NA 1,35) lentes objetivas Micro-Manager 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) Imagem J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarose - biologia molecular / grau de eletroforese em gel Fisher Superfrost / Plus Lâminas de Microscopia (Catalog # 12-550-15) Fita de laboratório (Fisher Catalog # Series 15-901) 18 mm x 18 milímetros # 1.5 Lamelas M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Ovo tampão (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH 7.3) 25. Vaselina Escova / Stick Giletes Bloco de aquecimento Microscópio de dissecação Worms 22 Fio de platina pegar 22 27G1 / 2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) ou um bisturi com uma lâmina pequena

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

Processos celulares, como a segregação de cromossomos, montagem e citocinese, são inerentemente dinâmicos. Lapso de tempo de imagens de células vivas, utilizando-fluorescente etiquetado proteínas repórter ou contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia, permite a análise da progressão temporal destes eventos dinâmicos que de outra forma inferida a partir de análise de amostras de 1,2 fixo. Além disso, o estudo dos regulamentos de desenvolvimento de processos celulares requer a realização de experimentos de lapso de tempo em um organismo intacto durante o desenvolvimento. O embrião Caenorhabiditis elegans é luz transparente e tem uma resposta rápida, programa de desenvolvimento invariante com uma célula conhecida linhagem 3, proporcionando assim uma experiência modelo ideal para estudar questões na biologia de células 4,5 e desenvolvimento 6-9. C. elegans pode ser alterada para a manipulação genética pela frente genética (mutagênese aleatória com base em 10,11) e da genética reversa para genes-alvo específicos (baseados em RNAi interferência mediada e orientada mutagênese 12-15). Além disso, animais transgênicos podem ser facilmente criado para expressar as proteínas fluorescentes marcados ou repórteres 16,17. Essas características se combinam para tornar mais fácil identificar as vias genéticas que regulam processos celulares fundamentais e de desenvolvimento in vivo 18-21. Neste protocolo, apresentamos métodos para geração de imagens ao vivo de C. embriões elegans utilizando óptica DIC ou de fluorescência da GFP em um microscópio composto de epifluorescência. Nós demonstramos a facilidade com que os microscópios prontamente disponíveis, normalmente usado para imagens de amostra fixa, também pode ser aplicado para o lapso de tempo de análise usando open-source software para automatizar o processo de imagem.

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

O<em&gt; C. elegans</emEmbrião&gt; é um poderoso sistema para o estudo de biologia celular e desenvolvimento. Nós apresentamos um protocolo para geração de imagens ao vivo de<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões utilizando óptica DIC ou fluorescência usando prontamente disponíveis microscópios de epifluorescência e open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.8K visualizações.  University of Michigan. O C. elegans é um poderoso sistema para o estudo de biologia celular e desenvolvimento. Nós apresentamos um protocolo para geração de imagens ao vivo de C. elegans Embriões utilizando óptica DIC ou fluorescência usando prontamente disponíveis microscópios de epifluorescência e open-source software.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Assembléia, Tuning e Uso de um microscópio de campo Apertureless Near Infrared for Imaging Protein

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

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Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Cuidados e limpeza do microscópio

Assembléia, Tuning e Uso de um microscópio de campo Apertureless Near Infrared for Imaging Protein

C. elegans Chemotaxis Assay

Anticorpo de coloração em

Medição dos Efeitos de bactérias em

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em

Configurando um Microscópio folha de luz simples para

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em