Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF), a Biologia de Sistemas de Sinalização em Câncer (Helmholtz Alliance em Biologia de Sistemas) e do Centro de Pesquisa do Câncer Alemão (DKFZ).

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais do DKFZ. Cuidado: A fim de evitar a contaminação de RNAse de amostras, tomar precauções básicas para evitar a contaminação de RNAse e preparar todos os tampões com água tratada com DEPC. 1. Preparação de gradientes de sacarose <ol><li> Prepare a 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 e soluções de sacarose a 50% (ver Tabela 1). Comece a preparar gradientes adicionando lentamente 2 mL de solução de sacarose a 50% para o fundo de um tubo de polialómero ultracentrífuga. Congelar a camada pela colocação de tubos durante 20 minutos à temperatura de -80 ° C. </li><li> Adicione as camadas subsequentes a diminuir porcentagens de sacarose com as etapas de congelamento entre eles, acabando com até 17,5% de sacarose. Manter gradientes de gelo durante a adição de soluções de sacarose a fim de evitar que a descongelação das camadas subjacentes. </li><li> Preparar gradientes de sacarose recentemente um dia antes da utilização e manter a 4 ° C. Alternatively, preparar gradientes de antecedência, armazenar a -80 ° C e descongelamento, a 4 ° C a noite anterior à experiência. </li></ol> 2. Preparação de Tecidos (Cord e / ou cérebro espinhal) <ol><li> Anestesiar rato por uma overdose de cetamina e xilazina em NaCl e transcardialmente perfundir com 20 ml de solução de sais equilibrada de Hank (HBSS) contendo 200 ug / ml CHX que imobiliza ribossomas em transcritos associados. Confirme anesthetization adequada por não-resposta às pitadas dedo do pé. </li><li> Extrair tecido rapidamente. Abra o dorsal crânio e extrair o cérebro. Realizar laminectomia de toda a coluna vertebral torácica e lombar, e extrair a medula espinhal. Use cérebro inteiro (~ 400 mg) ou um pedaço de 4 cm da medula espinhal (~ 90 mg), respectivamente. </li><li> Transferir tecido em gelo frio homogeneização tampão A (ver Tabela 1) (medula espinal: 1 ml; cérebro: 4 ml) e dice em pedaços pequenos com um bisturi limpa para permitir o aumento da absorção de cicloheximida. Perform todos os outros passos no gelo. </li><li> Incubar durante 15 min e homogeneizar o tecido mecanicamente utilizando um homogeneizador Dounce. Homogeneização cuidadosamente controlada é necessário para assegurar que os núcleos permanecem intactos. Trate todas as amostras exatamente da mesma maneira para assegurar a comparabilidade. Nota: para o tecido cerebral: Disrupt tecido por 5 golpes com um pilão bem justa. Para tecido da medula espinhal: interromper por cinco golpes com um pilão vagamente montagem, seguidos por 5 mais golpes com um pilão bem justa. </li><li> Tome alíquotas (400 mL para o cérebro e 200 mL de medula espinhal), congelamento flash e armazenar a -80 ° C para o isolamento de RNA total. </li><li> Retirar núcleos e células ininterrupto e fragmentos de tecido através de centrifugação a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Centrifugação a baixa velocidade evita a perda dos ribossomos. </li><li> Fragmentos de membrana Lyse no sobrenadante livre de núcleos de 30 min por adição de NP-40 e desoxicolato de sódio detergentes (cada um a uma concentração final de 1%). </li></ol><ol><li> Este passo remove componentes gordos da amostra que de outra forma mascarar o sinal no perfil polyribosome. Primeiro, baldes ultracentrífuga pré-frio e rotor a 4 ° C e preparar 2 M, 1,1 M e 0,9 M soluções de sacarose (ver Tabela 1). </li><li> Misturar com um lisado 1,22 volumes de solução 2 M de sacarose e transferir para um tubo de ultracentrífuga polietileno. Encha-se todos os tubos para igual volume de 10 ml com 1,1 M solução de sacarose, depois cobri-la com cuidado e com 0,9 M solução de sacarose. </li><li> Coloque os tubos ultracentrífuga em baldes ultracentrífuga pré-refrigerados. Centrifugar durante 3 horas a 100.000 x g a 4 ° C. Durante este processo os ribossomas se depositam no sedimento enquanto componentes gordos flutuam e permanecem no sobrenadante. </li></ol> 4. Sacarose Gradiente Fracionamento <ol><li> Remover o sobrenadante e dissolve-se o pellet em tampão de homogeneização B (ver Tabela 1 </strong&gt;). Medir a absorvância a 260 nm para cada amostra utilizando um aparelho Nanodrop ou equivalente e normalizar valores para carregar de acordo com o valor da absorvância. </li><li> Coloque gradientes de sacarose (a preparação é descrita numa secção anterior) para os baldes ultracentrífuga previamente arrefecidos. Amostras da camada cuidadosamente em cima do gradiente. Adicionar um gradiente de sacarose em branco como controle técnico. </li><li> Ajustar o peso de cada balde com o tampão de homogeneização. Centrifugue as amostras de 1,5 h a 285.000 x g a 4 ° C. </li><li> Começar a preparar a Isco fraccionador 30 minutos antes do final de centrifugação. Se um outro modelo de fraccionador é usado, seguir o protocolo do fabricante. <ol><li> Defina a sensibilidade adequada (0,2 AUFS para o cérebro ou 0,05 AUFS para medula espinhal) para a lâmpada UV e ligá-lo para aquecer. Monte o piercer tubo, conectá-lo através da bomba de rolamento para solução de sacarose 60% através do piercer tubo. </li><li> Teste a instalação por bombeamento rato sacarose (fluxoe: 1 ml / min), em particular se certificar de que não há vazamentos nas tubulações que irá introduzir bolhas no gradiente. </li><li> Absorção de fundo branco, bombeando manualmente tampão gradiente para o detector UV e correção de linha de base. </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente os baldes ultracentrífuga contendo os gradientes de sacarose com amostras sedimentadas do rotor e colocá-los no gelo. Evite qualquer colisão de gradientes para evitar a perda de resolução. </li><li> Gradientes executado no fraccionamento. Execute gradientes vazios primeiro a avaliar absorção de fundo e garantir a configuração técnica adequada. <ol><li> Anexar gradiente para o detector de UV e perfurar o fundo do tubo com o tubo de perfurador. Iniciar o bombeamento de 60% de sacarose, o qual irá desalojar o gradiente com amostras sedimentados para cima, através do detector de UV e para a conta-gotas. </li><li> A absorvância a 260 nm está documentado para gerar o perfil de absorção da amostra, com picos que indicam a sedimentaçãoção de mRNAs associados subunidades ribossomais, monosomes e, posteriormente, aumento do número de ribossomos. </li></ol></li><li> Coletar amostras em 20 frações por meio do conta-gotas (600 mL cada, em tubos de 2 ml). </li></ol> 5. Isolamento de ARN a partir de fracções individuais <ol><li> Adicionar 10% de SDS para uma concentração final de 1% para as fracções individuais e misturar bem, a fim de se desdobrar proteínas e dissociar os ribossomas. Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a -80 ° C. Dependendo da questão a ser abordada, frações podem ser agrupados de acordo com o perfil de absorção. </li><li> Isolar o ARN com a extracção com fenol / clorofórmio, ácido, que também remove os traços de contaminantes de ADN. <ol><li> Adicionar um volume de ácido fenol / clorofórmio (pré-aquecido até à temperatura ambiente), para cada amostra, o calor durante 10 min a 65 ° C e pressão de libertação sob a coifa depois. </li><li> Centrifugue as amostras durante 20 min a 17.000 x g à temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente fase aquosa para um novo 1,5 mltubo. Esteja ciente de inversão de fase em frações de sacarose mais densas, onde a fase aquosa pode estar no fundo após a centrifugação. </li><li> Adicionar um volume de isopropanol, 1/9 do volume de acetato de sódio (pH 5,2) e 1 pi GlycoBlue para cada amostra, a fim de precipitar o RNA. Manter as amostras, pelo menos, 1 hora a -80 ° C. </li><li> Centrifugar durante 30 minutos a 17.000 xg e 4 ° C. GlycoBlue proporciona a visualização da pelota. Remover o sobrenadante, lavar pellet uma vez com o frio do gelo etanol 80% e ar pellet seco. Dissolver sedimento em RNAse livre água. </li></ol></li><li> Quantificar quantidade de RNA por Nanodrop e analisar a integridade do RNA por um chip Bioanalyzer. ARN, que é obtido pelo protocolo apresentado é adequado para todos os estado da arte, incluindo ensaios de elevado rendimento de microarray e sequenciação de profundidade. </li></ol>

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	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. 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Não há conflito de interesse declarados.

Embora polyribosome fracionamento não é uma técnica nova, continua a ser um particularmente desafiador. Com base no material de entrada, a otimização substancial pode ser necessário. Este é especialmente o caso para amostras in vivo do SNC, onde a quantidade de material é muitas vezes uma limitação e componentes do tecido adiposo dificultar o isolamento de mRNAs de tradução. Mais fraccionamento protocolos publicados lidam com a levedura ou as linhas de células de mamíferos, e existem protocolos estabelecidos para o cérebro 12,13,14. Em contraste, há quase todas as publicações que descrevem fracionamento das medulas espinhais e protocolos anteriores exigem medula espinhal de um grande número de animais a serem agrupados 15. Por estes motivos, várias modificações essenciais foram feitas para adaptar o protocolo de fraccionamento para os tecidos do SNC, incluindo o único rato medula espinhal. Imobilização ribossomo com cicloheximida é realizada durante a perfusão animal para evitar a dissociação dos ribossomos during o longo processo de extração do tecido. Subsequentemente, os ARN polissomal são extraídos de uma forma específica para maximizar o rendimento polyribosome. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido controlada pelo douncing, mantém o núcleo intacto e evita a contaminação do ADN. O núcleo é então removido de forma fiável por centrifugação. A combinação dos detergentes NP-40 e desoxicolato de sódio assegura lise do retículo endoplasmático e de libertação das suas membranas associadas ribossomas. Além disso, os componentes de absorção de UV na mielina lipídico rico obscurecer os perfis polyribosome. Mielina flotação é, portanto, necessário, em que os compostos densos, tais como polirribossomas são sedimentadas e compostos mais leves, tais como a mielina flutuador e são removidos 16. Polirribossomos são então sedimentadas sobre um gradiente de sacarose de 17,5% para 50%. Em vez de camadas manualmente e congelando cada camada de sacarose, gradientes também pode ser preparado utilizando um misturador de gradiente. A extracção de ARN a partir de fracções usando ácido fenol / clorofórmio permite DNA a ser removido com a perda mínima de ARN. No entanto, a inversão de fases pode ocorrer em fracções de sacarose e densas (acima fracção 16). Este protocolo oferece vantagens sobre os outros métodos convencionais que se dirigem ao nível da tradução. Por exemplo, tanto a medida de fosforilada S6 (um marcador de tradução de destaque), bem como a rotulagem das cadeias nascentes com radioisótopos dão informações sobre os níveis de tradução global mas revelam pouco sobre o que está especificamente a ser traduzido. Polyribosome fraccionamento, por outro lado, permite não só a avaliação da tradução global, mas também da identidade do traduzindo ARNm e as proteínas reguladoras associadas. PCR quantitativa em tempo real pode ser realizada em ARN isolado de uma leitura rápida de ARNm seleccionados, e microarranjos e próxima geração de sequenciação de ARN pode ser realizada por estudos de genoma. As optimizações aqui apresentados permitem a técnica a ser usado com uma quantidade mínima de tecidos do SNC, por conseguinte, diminuirção do número de animais necessários e melhorar a qualidade global experimental, reduzindo o tempo de processamento do tecido. Por outro lado, esta técnica não pode distinguir ribossomos paralisadas desde as traduzindo. Transcrições transportando ribossomos paralisadas sedimenta nas frações pesadas, e isso deve ser mantido em mente ao interpretar os dados. Existem técnicas relatadas, nomeadamente RiboTaq e armadilha, em que os ribossomos são marcadas com etiquetas de epitopos ou repórteres respectivamente de uma maneira específica tipo de célula e mRNAs isolados por imunoprecipitação 17,18 associados. Esta técnica pode ser acoplado a polyribosome fraccionamento para oferecer alta resolução lido para populações de células específicas. Ribossomo pé-impressão é uma outra nova técnica que envolve a digestão nuclease para gerar pequenos fragmentos, ou &quot;pegadas&quot;, de mRNAs que são protegidos por ribossomos. Bibliotecas são então gerados a partir dessas pegadas e seqüenciados. Este método provides toda uma análise do genoma específico do códon de tradução e é capaz de identificar os ribossomos paralisadas, não-agosto começam códons e pequenos quadros de leitura aberta a montante, que não podem ser alcançados por polyribosome fracionamento 19. No entanto, polyribosome fraccionamento pode ser acoplado ao perfil de ribossoma para o isolamento dos fragmentos digeridos individuais contendo ribossomas, enriquecendo assim para as espécies moleculares necessários para a preparação da biblioteca em que a alta pureza da amostra é muitas vezes necessário. Tomados em conjunto, polyribosome fracionamento é um método flexível, com significado duradouro e pode ser acoplado a várias aplicações a jusante, incluindo amplos ensaios genoma como sequenciamento de última geração.

A expressão de genes é determinado pela acção combinada de transcrição, tradução e estabilidade de ARNm e proteínas, com tradução tendo o efeito mais predominante 1. É agora evidente que cada um destes passos é altamente regulado. Micro-RNAs, a formação de grânulos de RNA, alternativa e poliadenilação citoplasmática são alguns exemplos de regulação pós-transcricional da expressão gênica 2,3. Cada um destes mecanismos de transcrição desacopla da tradução e influencia o proteoma do sistema biológico de interesse. Assim, sem surpresa, os níveis de mRNA por si só são uma leitura imperfeita dos níveis de proteína 4. Proteômica quantitativa fornece a avaliação mais direta da expressão do gene, no entanto, apesar dos avanços recentes, ainda há limitações consideráveis ​​na sensibilidade e resolução seqüência da proteína. Portanto, a abordagem translatome, o repertório de mRNAs traduzindo, oferece um excelente compromisso entre o estudo datranscriptoma e proteoma. É mais preciso do que transcriptomics em avaliar a expressão gênica final, e fornece maior cobertura e resolução seqüência de proteômica. Em sistemas de mamíferos, a maioria dos eventos de tradução começar via iniciação dependente do cap. Um grupo de factores de iniciação eucarióticas conjuntamente com a subunidade ribossomal 40S montar a tampa de extremidade 5 &#39;de um mRNA. O complexo, em seguida, verifica o mRNA e ao chegar ao início códon agosto, recruta a subunidade ribossômica 60S para formar uma completa 80S dos ribossomas. O alongamento da fase prossegue com o ribossoma se deslocam ao longo do mRNA, com factores de alongamento auxiliar a incorporação de aminoácidos a partir de ARNt carregados para a cadeia de péptido nascente. Várias ribossomas pode prosseguir ao longo de um único mRNA, simultaneamente, e o número de ribossomas associados foi demonstrado haver uma correlação com a taxa de síntese de proteína de 5,6. Isso faz com que o carregamento ribossômica uma indicação fiável para translation e permite a separação de traduzir ARNm activamente com base na taxa de sedimentação. Além disso a quantificação de traduzir ARNm, a informação da sequência pode ser obtida para identificar motivos envolvidos na regulação de tradução. RNA também proteínas de ligação e outros factores de tradução podem ser isolados a partir de diferentes fracções, facilitando o estudo e descoberta de proteínas reguladoras associadas. No sistema nervoso, o controlo da tradução foi ligada a processos, tais como a armazenagem de ARNm, o transporte e síntese de proteínas local. Cones de crescimento têm sido mostrados para abrigar uma piscina específica localizada do ARNm distintas do resto do axónio 7. Além disso, os axónios possuem a capacidade de sintetizar localmente proteínas 8,9. Como resultado, o controle local da tradução se tornou um tema crucial do estudo em neurobiologia. O potencial de polyribosome fraccionamento para resolver este tenha sido ilustrada em vários estudos, nos quais foi utilizada a técnica deinvestigar orientação axônio no desenvolvimento da medula espinhal, e demonstrou a tradução dependente de atividade de BDNF no cérebro 10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salts solution</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>caution</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td>danger</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>warning</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>danger</td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>danger</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>warning</td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td>danger</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x&amp;nbsp;g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionator</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Vários processos estão envolvidas na expressão de genes, incluindo a transcrição, tradução e estabilidade de ARNm e proteínas. Cada uma dessas etapas são fortemente regulados, afetando a dinâmica finais da abundância de proteínas. Existem vários mecanismos de regulação na etapa de tradução, tornando os níveis de mRNA só um indicador fiável da expressão gênica. Além disso, a regulação local da tradução do mRNA tem sido particularmente implicado em funções neuronais, mudando &#39;translatomics&#39; para o foco de atenção em neurobiologia. O método apresentado pode ser usado para transcriptomics ponte e proteômica. Aqui nós descrevemos modificações essenciais para a técnica de fracionamento polyribosome, que interroga o translatome baseada na associação de mRNAs ativamente traduzido para vários ribossomos e sua sedimentação diferencial em gradientes de sacarose. Tradicionalmente, o trabalho com em amostras in vivo, particularmente do Central sistema nervoso central (SNC), tem se mostrado um desafio devido às quantidades limitadas de material ea presença de componentes de tecido adiposo. A fim de solucionar este problema, o protocolo descrito é especificamente optimizado para utilização com uma quantidade mínima de material de CNS, como demonstrado pela utilização de um único rato medula espinal e do cérebro. Resumidamente, os tecidos do SNC são extraídos e ribossomas traduzindo são imobilizados em mRNAs com ciclo-heximida. Mielina flutuação é então realizada para remover lipídeos componentes ricos. O fraccionamento é realizado em um gradiente de sacarose em que os mRNAs são separados de acordo com a sua carga ao ribossoma. As frações isoladas são adequados para uma série de ensaios a jusante, incluindo as novas tecnologias de análise do genoma de largura.

A Figura 2 mostra os perfis representativos polyribosome após fraccionamento. Os perfis de cérebro e medula espinal mostram as curvas de absorção características tal como descrito antes para as linhas celulares. mRNAs ligados a pequenas subunidades ribossomais (40S) de sedimentos de fracções mais leves e aparece em primeiro lugar como um pico no perfil, seguido da grande subunidade ribossomal (60s) e (80S) monosome mRNAs ligados. mRNAs ligados a vários ribossomos sedimentos em fracções mais pesadas, com os picos mais tarde indicando aumento do número de ribossomos ligados. Tradução global pode ser avaliada a partir do perfil. Como um exemplo, o tecido cerebral tem um polyribosome superior a monosome proporção do que o tecido da medula espinal, indicando mais activa de tradução. ARN extraído de fracções individuais foram avaliadas por Bioanalyzer, mostrando a distribuição de 18S e 28S rRNA. 18S rRNA aparece mais cedo no perfil, de acordo com as pequenas subunidades ribossomais sedimente em sucr isqueiro<html> frações OSE. Os rendimentos típicos de ARN total são de 10-20 ug de cérebro e 2-4 ug de medula espinhal. Rendimentos de ARN a partir de fracções individuais são de até 4 mg e 0,8 mg de cérebro e medula espinal, respectivamente, em função da fracção. Um gradiente de sacarose em branco já mostra alguma absorção de fundo a 260 nm, devido à presença de DTT. Este fundo pode ser subtraída durante a análise de dados, a fim de normalizar os valores da amostra. Tratamento com EDTA colapso dos picos polyribosome, demonstrando o perfil de sedimentação é devido à tradução. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Workflow e aplicações potenciais in vivo polyribosome fracionamento.&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Perfis Figura 2. (A) Perfis polyribosome típicas do cérebro e da medula espinhal, com a avaliação de RNA extraído por Bioanalyzer. (B) Distribuição do ARNm de GAPDH sobre fracções por qRT-PCR. (C) Polyribosome de gradiente vazio e cérebro com e sem tratamento EDTA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Tampão gradiente 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM de MgCl 2, 600 mM de NaCl, 200 ug / ml de ciclo-heximida (CHX), 2 mM de ditiotreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> a solução de sacarose de 17,5% </td><td> 8,67 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> a solução de sacarose de 25,6% </td><td> 12,8 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> a solução de sacarose de 33,8% </td><td> 16,9 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solução de sacarose de 41,9% </td><td> 20,95 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solução de sacarose a 50% </td><td> 25 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeneizaçãotampão A </td><td> 0,25 M de sacarose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 200 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF), 100 U / ml de RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Solução de sacarose 2M </td><td> 68,4% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M solução de sacarose </td><td> 38,5% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M solução de sacarose </td><td> 30,8% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM </td><td> 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampão B </td><td> 0,25 M de sacarose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, desoxicolato de sódio a 1% </td><td> 200 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml de RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de tampões e soluções.

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In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K visualizações.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado. 

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Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Bioquímica

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Biologia do Desenvolvimento

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biologia

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Neurociência

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

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