Sarah A. Alfaqeeh é financiado pelo tipo Saud University College of Dentistry, Ministério do Ensino Superior, Reino da Arábia Saudita.

1. Estabelecer <ol><li> Afiar instrumentos de dissecção (utilizando uma pedra de afiar lubrificado com óleo mineral) e esterilizar antes da sua utilização para a cultura de órgãos, utilizando um pulverizador de etanol a 70% e a esterilização por calor seco. Afie as agulhas de dissecação através da eletrólise em hidróxido de sódio 2 M usando uma alimentação de 12 V. </li><li> Preparar o meio de cultura utilizado para a dissecção e a cultura de órgãos embrionários, que consiste de Meio de Eagle Modificado F12 da Dulbecco avançada (DMEM F12) suplementado com 1% GlutaMAX e 1% de penicilina-estreptomicina. </li></ol> 2. Embrião Dissection <ol><li> Cull uma fêmea grávida acoplado cronometrado usando uma programação um método aprovado pelo Ministério do Interior ou outro órgão de governo. Dissecar longe a pele ao redor do abdômen inferior, e abriu o abdome com uma tesoura. Localize os dois cornos uterinos, que ligam juntos na linha média inferior. </li><li> Dissecar o útero e coloque em um tubo cheio de médio no gelo. When em gelo, o tecido pode ser deixada durante várias horas. </li><li> Remover o útero e lugar em uma placa de Petri em meio sob o microscópio. Sempre que possível, dissecações embriões devem ser realizados numa hote de fluxo laminar para minimizar a contaminação. </li><li> Dissecar os embriões do útero e libertá-los de seus tecidos extra-embrionário. </li><li> Decapitar os embriões utilizando uma agulha de tungstênio e transferir as cabeças em um novo prato de meio. </li><li> Isolar as mandíbulas de cabeças, colocando uma agulha para dentro da cavidade oral e cortar para a parte de trás da cabeça (Figuras 1A e 1B). Isolados mandíbulas podem ser temporariamente armazenados em meio no gelo enquanto espera para cortar. </li><li> Para fatias inteiras mandíbula encena E11.5-E15.5 são ideais para a cultura do germe do dente. Após E15.5 o osso da mandíbula em desenvolvimento é muito difícil para cortar. Fatias de dentes ainda podem ser feitas, mas o osso (osso alveolar dentário e formação) devem ser previamente removidos pordissecção antes de cortar 9. Remover osso cuidadosamente o uso de agulhas de tungstênio e fórceps. </li></ol> 3. Embrião Fatias <ol><li> Preparar as fatias de tecido de mandíbula usando um cortador de tecido tabela padrão (Figura 1C). Use uma lâmina nova após cerca de 200 mandíbulas, e certifique-se que se encontra alinhado com o disco de montagem quando cai. </li><li> Limpar o disco de montagem e lâmina com etanol 70% antes da utilização. Cuidados devem ser tomados ao utilizar a máquina, como a lâmina é muito afiada. </li><li> Definir o helicóptero, a uma distância de corte de entre 200-400 mm de acordo com a idade do espécime, e dependendo se todo o germe do dente é necessária. Defina a força da lâmina no máximo. </li><li> Transferir uma mandíbula para o disco de montagem de plástico com uma pipeta ou uma pinça. Organizar a mandíbula sobre a produção do disco se de que a orientação ainda é clara. A língua em desenvolvimento pode ser usada como um ponto de referência útil para determinar a orientação. Para molares uso afRontal / orientação transversal (ver plano de corte na Figura 1B), enquanto que para os incisivos usar um corte sagital através da mandíbula para refletir a diferente orientação desses dentes à medida que crescem (ver plano de corte na Figura 2A). </li><li> Remover o excesso de meio de todo o tecido, utilizando papel de filtro, a fim de secar ligeiramente a mandíbula no disco de montagem. </li><li> Imediatamente após a secagem, coloque o disco na mesa de aço inoxidável circular de helicóptero. Ligue a máquina e começar a pressionar. A mesa desloca automaticamente a partir da esquerda para a direita e, ao mesmo tempo, o braço de desbastamento levando a lâmina é levantado e deixado cair em até 200 batimentos / min. </li><li> Desligue a máquina uma vez que o tecido foi completamente cortado. Certifique-se o braço da pá está na posição levantada e remover o disco. Não coloque os dedos debaixo do braço lâmina ou deixar a máquina sem vigilância quando cortar. </li><li> Pegue o disco de montagem e adicionar imediatamente médio to as fatias no disco, a fim de evitar o ressecamento excessivo. Cuidadosamente desalojar o tecido cortado a partir da parte inferior do disco, utilizando uma agulha de tungsténio e, em seguida, pipeta numa pequena placa de Petri com meio (Figura 2A). </li><li> Separe as fatias usando uma agulha e, em seguida, selecione as fatias de tecido contendo o tecido de interesse sob um microscópio estereoscópico (Figuras 1D, 1E, e 2B). Coloque fatias selecionadas em placas de cultura com meio fresco. </li></ol> 4. Fatia Cultura <ol><li> Preparar pratos de órgãos centrais poços de cultura, prontos para a cultura através da adição de cerca de 2 ml de água esterilizada para o poço externo para impedir a desidratação, e pelo posicionamento de uma grade de metal através do centro do prato (Figuras 3A e 3B). </li><li> Prepare grades metálicas cortando tiras aproximadamente 4 cm x 1,5 cm, a partir de folhas de malha de aço inoxidável. Use um furador para fazer um buraco no centro e dobreos lados para criar um final escalonada. A grelha deve ficar plano através do poço central, encontra-se em paralelo ao fundo do prato (Figuras 3A e 3B). Autoclave as grades para esterilizar antes da utilização. </li><li> Cortar um pedaço de tereftalato de polietileno transparente (PET) de membrana (dimensão de poro 0,4 um) suficientemente grande para cobrir o furo na grade. Coloque a membrana corte no prato com a fatia selecionada. </li><li> Coloque a fatia sobre a membrana e, em seguida, levante cuidadosamente a membrana fora do meio, com fatia achatada no centro. </li><li> Colocar o filtro da grelha sobre o orifício circular no centro, e adicionar cerca de 1 ml de meio de cultura para o poço, até ao nível da membrana. </li><li> Para manipulações adicionar proteínas ou inibidores de moléculas pequenas para o meio (por exemplo 8). </li><li> Fotografar a fatia para um registro de morfologia no dia 0 de cultura. </li><li> Colocar as cápsulas numa atmosfera húmida de 5% de CO <sub&gt; 2 a 37 ° C em uma incubadora. </li><li> Fotografar as culturas em intervalos regulares para, em média, 7 dias. Altere o meio de cultura a cada 48-72 horas. Para a fotografia visualizar as fatias com uma fonte de luz por baixo (Figuras 2C-E). </li></ol> 5. Lineage Tracing Se o rastreamento de linhagem é necessária, corantes lipofílicos, como DII ou DiO pode ser injetado no germe do dente antes do passo 4, a cultura fatia. <ol><li> Puxe agulhas capilares de vidro usando um extrator de agulha. </li><li> Quebrar a ponta da agulha com a pinça e colocar ponta para baixo para dentro da solução corante. Deixe por alguns minutos, enquanto o corante enche a ponta por ação capilar. </li><li> Coloque a agulha colocada em um suporte e anexar via tubulação para um injetor ou a boca do aspirador. </li><li> Posicionar a ponta da agulha no meio de cultura que toca a área da fatia devido a ser rotulada. Aplicar pressão de ar para deslocar uma quantidade pequena de corante para fora da agulhad para o tecido. </li><li> Remova a agulha e verificar se a rotulagem sob fluorescência. </li><li> Fatias marcadas com sucesso pode ser transferido para filtros e cultivados como descrito no passo 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+dental+mesenchyme:+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle.">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li><li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition.">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes &amp; development. 12, 2636-2649 (1998).</li><li>Trowell, O. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination.">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li><li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone.">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li><li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions.">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li><li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars.">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li><li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root:+implications+for+Hertwig's+epithelial+root+sheath+formation.">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li><li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse.">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li><li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars:+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells,+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units,+the+cusps.">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li><li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development.">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li><li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme:+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction.">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este método de cultura de dentes tem a vantagem de que o acesso ao germe do dente é excelente, permitindo linhagem precisas rastreio e colocação de grânulos no interior do epitélio ou mesênquima. Regiões definidas do germe do dente em desenvolvimento pode, por conseguinte, ser dirigida especificamente. Durante a cultura a morfologia mudança do germe do dente podem ser seguidos, e o efeito de manipulações rapidamente avaliada. O método, no entanto, é apenas apropriado para germes dentários jovens antes da formação substancial de tecidos duros, como o esmalte e dentina, uma vez que estas não podem ser cortados com precisão. Para mandíbulas após E15.5 é necessário remover o osso antes de cortar. Isto tem a desvantagem de potencialmente prejudicar o germe do dente, que está intimamente associada com o osso do E16.5. Temos cortado com sucesso germes dentários dissecados até dia pós-natal 4, após o qual o dente torna-se muito difícil para o helicóptero para cortar devido à deposição de esmalte. A fatia método funciona bem em germes dentários de E13.5, ou seja, a fase de botão 1,6. Antes deste ponto de tempo, quando o dente está em fase de espessamento epitelial, os germes de dentes se desenvolvem, mas a taxa de sucesso é reduzida e a morfologia pode ser afectada a longo prazo. Uma grande desvantagem com o método é que o corte ocorre ao acaso através do dente. Em algumas fatias de um germe de dente inteiro será encontrada dentro de uma fatia, enquanto em outros o helicóptero pode cortar o germe do dente no meio. Isto significa que pode ser difícil obter um grande número de cortes idênticos. Para combater este problema, é possível dividir uma fatia ao meio e usar os lados direito e esquerdo como experimental e de controlo. Para isso, no entanto, a mandíbula têm de ser cuidadosamente colocado sobre o disco de corte para assegurar a fatia é cortada de forma simétrica. Para algumas experiências, é uma vantagem ter fatias que disseca o dente, de modo que as estruturas internas, tais como o esmaltenó, pode ser acessado por linhagem rotulagem 4. O germe do dente parece muito robusto e esses germes meio dente são capazes de desenvolver bem em cultura, como anteriormente mostrado na germes dentários molares pela metade 12,13. Como uma alternativa para cortar cultura, os germes de dentes podem ser dissecados para fora da mandíbula e cultivadas em isolamento 14. Isso elimina o problema da má nutrição e oxigenação associada à cultura de grandes blocos de tecido e leva ao bom desenvolvimento dos dentes, mas como conseqüência o dente se desenvolve sem interação com o tecido circundante. Quando grandes quantidades de mesênquima circundantes são removidos o número de germes dentários que se formam podem ser alteradas, destacando a importância do mesênquima circundante para o desenvolvimento normal do dente 15. Fatia de cultura é, por conseguinte, um bom método para estudar as interacções de tecidos, por exemplo, como o osso e dente de interagir na formação do osso alveolar, ou como o salivariar glândulas interagir com a lingueta e do epitélio bucal, algo que é perdida quando esses tecidos são cultivadas isoladamente. Este documento realça a utilização deste método para a cultura das bactérias dos dentes, mas o mesmo método também é excelente para a cultura em desenvolvimento a glândula submandibular e sublingual e acompanhando o desenvolvimento de estrutura, tais como a cartilagem de Meckel (Figura 2).

Para um número de experiências é importante ser capaz de cultura de tecidos ex vivo para seguir o desenvolvimento. Cultura de desenvolvimento do tecido proporciona acesso em períodos definidos de desenvolvimento e permite a manipulação de genes através da adição de factores para o meio de cultura, ou em pérolas carregadas, e pela utilização de transfecção e electroporação 1. Para muitos ensaios, é importante ser capaz de visualizar o tecido à medida que cresce, por exemplo, para seguir o destino de células de linhagem rotulado como o tecido é submetido a morfogénese. Isto pode ser particularmente problemática nos tecidos que se desenvolvem de profundidade dentro do embrião, que não são óbvias, quando um bloco de tecido a partir do embrião é cultivado. Os dentes são bons exemplos disso, como elas se desenvolvem dentro do processo nasal mandíbula, maxilar e frontal. Quando toda a mandíbula é cultivaram as estruturas superficiais do dente podem ser vistos, mas as alterações na morfologia só pode ser analisado depois de seccionamento do tecido fixado <sup&gt; 2. Nós adaptamos uma fatia técnica cultura viva que nos permite acompanhar o desenvolvimento do germe do dente e dar acesso a diferentes partes do dente durante o desenvolvimento. As culturas técnica as fatias germinais dente na interface gás-líquido, usando um método modificado Trowell 3. Estas culturas fatia têm sido muito úteis em seguir diretamente morfogênese do dente, e permitindo o rastreamento de linhagem de componentes distintos, como o nó do esmalte e da papila dental e do folículo 1,4-7. A técnica não se limita aos embriões de ratinho e com sucesso tem sido utilizado para cultura de fatias de porco vivos e cobra 8,9 tecido dental. Para além da vantagem de ser capaz de visualizar o desenvolvimento dos dentes, o método fatia também tem a vantagem de que as fatias finas de tecido ter um maior acesso para os nutrientes a partir do meio e de ar a partir do incubador. Isso resulta em melhor crescimento dos germes dentários, que correspondem desenvolvimento in vivo, e mostram invasião de células endoteliais na papila 7. Em contraste, os germes de dentes em culturas de mandíbula inteiros desenvolver mais lento do que os in vivo, e o centro da cultura é frequentemente necrosado em culturas de longo prazo. Na cultura fatia, o dente desenvolve dentro de uma fatia de mandíbula, e a sua interacção com o desenvolvimento de osso circundante e outros tecidos podem ser monitorizados. Em nosso método, o tecido é cortado logo após dissecção sem a necessidade de incorporar em um meio de suporte 10,11 e não há necessidade de qualquer sistema para prender o tecido para o bloco de desbastamento. O método é, por conseguinte, não invasiva e rápida, permitindo que muitas mandíbulas para ser seccionado em uma sessão.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101077Y</td>
			<td>100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>Cell-labeling solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geminator 500</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>Thomas No. 3885A20</td>
			<td>Dry-heat sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Standard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &#956;m pore size)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>PET track-etched membrane, 6-well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>FE228710</td>
			<td>(Fe/Cr18/Ni10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Intracel Ltd</td>
			<td>051-0500-900 0-100 psi</td>
			<td>Single channel picospritzer III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary with filament 1 mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.1 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.38 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>Used for mouth aspiration lineage tracers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the slice culture method for following development of tooth germs in explant culture

Cultura explante permite a manipulação de órgãos em desenvolvimento em pontos de tempo específicos e é, portanto, um método importante para a biologia do desenvolvimento. Para muitos órgãos é de difícil acesso tecido em desenvolvimento para permitir o monitoramento durante ex vivo da cultura. O método de cultura fatia permite o acesso ao tecido para que os movimentos morfogenéticos podem ser seguidas e populações de células específicas podem ser direcionados para a manipulação ou o rastreamento de linhagem. Neste artigo descrevemos um método de cultura fatia que tem sido muito bem sucedido para a cultura de germes dentários em uma variedade de espécies. O método proporciona um acesso excelente para os germes de dentes, que se desenvolvem a uma taxa semelhante à observada in vivo, rodeado por outros tecidos maxila. Isto permite que as interacções de tecido entre o dente e tecido circundante a ser monitorizado. Embora este documento concentra-se germes de dente, o mesmo protocolo pode ser aplicado para seguir o desenvolvimento de uma sériede outros órgãos, tais como as glândulas salivares, cartilagem de Meckel, glândulas nasais, língua e orelha.

De modo a seguir o movimento do primeiro folículo molar, 250 mM fatias frontais foram tomadas através de uma mandíbula, utilizando o método descrito acima. O folículo é a camada de mesênquima que rodeia o esmalte epitélio exterior (OEE) do dente em desenvolvimento, e tem sido mostrado previamente para participar na formação de tecido do periodonto 6. Mandíbulas foram dissecadas na E14.5, o estágio tampa do desenvolvimento dentário. No corte do contorno do epitélio dental foi claro, e o mesênquima dentário de condensação pode ser identificado como um anel em torno de mais escuro do epitélio do dente (Figura 4A). DII foi injectado no mesênquima ao lado do epitélio do esmalte exterior do corte de dente no lado lingual (Figura 4A). Após a marcação das fatias foram cultivadas durante 4 dias e fotografada em intervalos (Figuras 4B e 4C). In vivo os germes dente teria atingidoa fase de sino por E18.5, e uma forma de sino fase distinta foi observada nas fatias, indicando uma progressão semelhante ao longo deste período de tempo. O ponto de DII foi visto para se estender para uma banda de células que se prolongam em torno do epitélio dental exterior como o dente cresceu (Figuras 4B e 4C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig1.jpg" /> Figura 1. Formação de fatias ao vivo. (A) embrião E14.5. As linhas tracejadas indicam os planos cortados com uma agulha de dissecação, começando com o corte inferior por decapitação. (B) dissecado maxilar inferior. A língua é virada para baixo. O plano de secção para o helicóptero tecido é mostrado usando linhas tracejadas. (C) Tecido triturador mostrando lâmina braço (BA) e disco de montagem branco (MD) com a amostra preparada (seta). (D) fatia Representante através do molarregião. As setas indicam a germes dentários molares. (E) de alta potência vista de uma fatia do molar. O epitélio germe dentário é descrito com manchas pretas. Imagens afiada usando o Photoshop. T = Língua, DB = dentário osso, cartilagem MC = de Meckel. Barra de escala em A = 3 mm. Barra de escala em B &amp; D = 1 mm. Barra de escala em E = 500 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50824/50824fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig2.jpg" /> Figura 2. Incisivo e cultura glândula. (A) E12.5 Mandíbula que foi picado sagital. Desenvolvendo incisivos (manchas brancas delineadas com asterisco) e submandibular (esboçado com manchas pretas e com setas) pode ser feito apenas para fora. (B) O mesmo mandíbula mostrando centrais 4 fatias separadas. O desenvolvimento da glândula submandibular cum ser visto como um broto cercado por mesênquima condensado (setas) nas duas seções mais laterais (parte superior da imagem). A condensação mesênquima em torno da glândula é esboçado no vermelho. Os incisivos estão em fase epitelial espessamento (asterisco) nas duas fatias centrais (parte inferior da imagem). (C) corte sagital através de um incisivo em E14.0 no Dia 0. (D) A mesma fatia um dia mais tarde. (E) da mesma fatia após 3 dias em cultura. (EC) seta aponta para incisivo e formando alça cervical labial. Arrowhead aponta para o desenvolvimento da glândula submandibular. Na cultura do germe do dente se estende para trás como os lacetes cervicais crescer, enquanto a glândula salivar continua a passar por ramificação morfogénese e formação de lúmen. Imagens afiada usando o Photoshop. T = Língua, cartilagem MC = de Meckel. Barra de escala em A &amp; B = 1 mm. Barra de escala em C, D, E = 500 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50824/50824fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui</a>para ampliar figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig3.jpg" /> Figura 3. Método Cultura. (A) fatia Cultivadas. A cultura fica em um filtro transparente suspensa sobre meio através de uma grade de metal. Um furo na grade permite que a fatia a ser visualizada com luz abaixo. (B) Esquema do método de cultura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig4.jpg" /> Figura 4. Rotulagem DII do folículo dental. (AC) Incorporada de luz e de campo escuro imagens que mostram o desenvolvimento do germe do dente molar e localização do rótulo linhagem DII. (A) Dia 0. O germe do dente (ponta de seta) está em fase de boné. DII rótulos células do folículo dental do lado lingual do dente. (B </strong&gt;) Dia 1. (C) Dia 4. O germe do dente alcançou o estágio de sino e as células DII rotulados são vistos a espalhar-se em um arco em torno do desenvolvimento de epitélio do esmalte exterior. Imagens foram afiada no Photoshop depois de mesclar camadas usando o modo de ecrã. Epitélio de dente delineado com manchas pretas. DP = papila dentária situada no epitélio interno do esmalte. DF = folículo dental, que corre ao redor do epitélio do esmalte exterior. MC = cartilagem de Meckel. Barra de escala em A, B, C = 500 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50824/50824fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais.

O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K visualizações.  King's College London.  Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais. 

Vídeo: The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Biologia

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.