Sarah A. Alfaqeeh wird durch Art Saud University College of Dentistry, Ministerium für Höhere Bildung, Königreich von Saudi-Arabien finanziert.

1. Aufbauen <ol><li> Schärfen Sie die Dissektionsinstrumente (mit einem Schleifstein mit Mineralöl geschmiert) und zu sterilisieren, bevor für Organkultur verwenden mit einem 70% igem Ethanol Spray-und Trockenhitzesterilisation. Schärfen Sie die Dissektion Nadeln mittels Elektrolyse in 2 M Natriumhydroxid mit einem 12-V-Versorgung. </li><li> Vorbereitung der für die Präparation und Kultur von embryonalen Organen verwendete Kulturmedium, bestehend aus Erweiterte Dulbeccos Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) mit Glutamax 1% und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt. </li></ol> 2. Embryo Dissection <ol><li> Cull eine zeitgesteuerte gepaart schwangere Frau, die einen Zeitplan ein Verfahren durch das Innenministerium oder anderen leitenden Gremium genehmigt. Präparieren Sie sich die Haut um die Unterbauch, und schnitt den Bauch mit einer Schere. Suchen Sie die beiden Uterushörner, die zusammen an der unteren Mittellinie zu verbinden. </li><li> Präparieren Sie sich die Gebärmutter und in ein Rohr mit Medium auf Eis gefüllt. When auf Eis, kann das Gewebe für mehrere Stunden stehen gelassen werden. </li><li> Entfernen der Gebärmutter und in einer Petrischale in Medium unter dem Mikroskop. Wo möglich Embryo Dissektionen sollten in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt, um eine Kontamination zu minimieren. </li><li> Präparieren Sie sich die Embryonen aus der Gebärmutter und befreien sie von ihrer extra Gewebe. </li><li> Enthaupten die Embryonen mit einem Wolfram-Nadel und übertragen Sie die Köpfe in ein frisches Gericht Medium. </li><li> Isolieren Sie die Unterkiefer von den Köpfen, indem eine Nadel in die Mundhöhle durchtrennt und in Richtung der Rückseite des Kopfes (1A und 1B). Isolierte Unterkiefer können vorübergehend in Medium auf Eis während der Wartezeit für das Hacken gespeichert werden. </li><li> Für ganze Unterkiefer Scheiben inszeniert E11.5-E15.5 sind ideal für Zahnkeim Kultur. Nach E15.5 die Entwicklungs Knochen im Unterkiefer ist zu hart für das Hacken. Zahnscheiben können immer noch gemacht werden, aber die Knochen (Dentale und Bildung Alveolarknochen) zuerst entfernt werden, indemDissektion vor 9 hacken. Entfernen Sie vorsichtig mit Knochen Wolfram Nadeln und Pinzette. </li></ol> 3. Embryo Slicing <ol><li> Bereiten Sie die Unterkiefer von Gewebeschnitten mit einem Standard-Tabelle Gewebe Chopper (Abbildung 1C). Verwenden Sie eine frische Klinge nach etwa 200 Unterkiefer, und stellen Sie sicher, dass es bündig mit der Befestigungsscheibe, wenn er fällt. </li><li> Reinigen Sie die Befestigungsscheibe und die Klinge mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch. Vorsicht ist bei der Verwendung der Maschine genommen werden, da die Klinge ist sehr scharf. </li><li> Gesetzt den Chopper bei einer Schnittdistanz von 200-400 &amp;mgr; m nach dem Alter der Probe, und je nachdem, ob die gesamte Zahnkeim erforderlich. Stellen Sie die Klinge Kraft auf Maximum. </li><li> Die Übertragung eines Unterkiefers mit dem Kunststoffbefestigungsscheibe mit einer Pipette oder Pinzette. Ordnen Sie den Unterkiefer auf der Disc machen, dass die Orientierung ist immer noch klar. Die Entwicklungs Zunge kann als nützliche Orientierungspunkt für die Bestimmung Orientierung verwendet werden. Für Backenzähne Verwendung afRontal / Querorientierung (siehe Ebene der Hacken in Abbildung 1B), während für Schneidezähne verwenden einen sagittalen Schnitt durch den Unterkiefer, die unterschiedliche Ausrichtung dieser Zähne zu reflektieren, wie sie wachsen (siehe Ebene der Hacken in Abbildung 2A). </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Medium aus der ganzen Verwendung von Filterpapier, um den Unterkiefer auf der Montagescheibe leicht trocknen das Gewebe. </li><li> Unmittelbar nach dem Trocknen, legen Sie die Disc auf der kreisförmigen Edelstahl-Tabelle der Chopper. Schalten Sie das Gerät ein und drücken Sie Start. Die Tabelle läuft automatisch von links nach rechts, während gleichzeitig die Schneide tragenden Arm der Klinge angehoben und fallen bis zu 200 Hübe / min. </li><li> Schalten Sie das Gerät, wenn das Gewebe vollständig geschnitten worden. Achten Sie darauf, die Klinge Arm in der erhöhten Position und entfernen Sie die CD. Stellen Sie keine Finger unter der Klinge Arm oder verlassen die Maschine unbeaufsichtigt hacken. </li><li> Nehmen Sie die Montagescheibe und sofort Medium to die Scheiben auf der Disc, um eine übermäßige Austrocknen zu verhindern. Sorgfältig verdrängen die geschnittenen Gewebes von der Unterseite der Scheibe unter Verwendung eines Wolfram-Nadel und dann Pipette in eine kleine Petrischale Medium (2A). </li><li> Trennen Sie die Scheiben mit einer Nadel und Gewebeschnitten, die das Gewebe von Interesse unter einem Stereomikroskop (1D, 1E, und 2B) und wählen Sie dann. Zeigen ausgewählten Scheiben in frische Kulturschalen mit Medium. </li></ol> 4. Slice-Kultur- <ol><li> Vorbereitung zentralen Vertiefungen Organkulturschalen bereit Kultur durch Zugabe von etwa 2 ml autoklaviertem Wasser zu der äußeren Wanne, um Austrocknung zu vermeiden, und durch Positionieren eines Metallgitters in der Mitte der Schale (3A und 3B). </li><li> Bereiten Metallgitter von Schneidleisten ca. 4 cm x 1,5 cm aus Platten aus Edelstahlgewebe. Verwenden Sie einen Locher, um ein Loch in der Mitte machen und beugendie Seiten, um eine gestaffelte Ende zu schaffen. Das Gitter sollte auch über den zentralen Flach passen, parallel zum Boden der Schale (3A und 3B) liegen. Autoklavieren die Gitter vor dem Einsatz zu sterilisieren. </li><li> Schneiden Sie ein Stück transparenten Polyethylenterephthalat (PET)-Membran (Porengröße 0,4 um) groß genug, um das Loch im Gitter abzudecken. Setzen Sie den Schnitt Membran in die Schale mit dem ausgewählten Scheibe. </li><li> Legen Sie die Scheibe auf der Membran und dann heben Sie die Membran aus dem Medium, mit Scheibe in der Mitte abgeflacht. </li><li> Platzieren des Filters auf dem Gitter über dem kreisförmigen Loch in der Mitte, und fügen etwa 1 ml Kulturmedium zu dem Brunnen bis zur Ebene der Membran. </li><li> Manipulationen hinzuzufügen Proteine ​​oder niedermolekulare Inhibitoren zu dem Medium (zum Beispiel 8). </li><li> Fotografieren Sie das Stück für einen Datensatz der Morphologie am Tag 0 der Kultur. </li><li> Die Schalen werden in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO <sub&gt; 2 bei 37 ° C in einem Inkubator. </li><li> Fotografieren Sie die Kulturen in regelmäßigen Abständen auf durchschnittlich 7 Tage. Ändern Sie das Kulturmedium alle 48-72 Std. Für die Fotografie sehen Sie die Scheiben mit einer Lichtquelle von unten (2C-E). </li></ol> 5. Lineage Tracing Wenn Linie Verfolgung erforderlich ist, können lipophile Farbstoffe wie Dil oder DiO in die Zahnkeim vor Schritt 4, Scheibe Kultur eingespritzt werden. <ol><li> Ziehen Glaskapillare Nadeln mit einer Nadel Magnet. </li><li> Brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette und legen Spitze nach unten in die Farbstofflösung. Lassen Sie für ein paar Minuten, während der Farbstoff füllt die Spitze durch Kapillarwirkung. </li><li> Legen Sie die gefüllte Nadel in eine Halterung und befestigen Sie über Schläuche mit einem Injektor oder Mund Sauger. </li><li> Positionieren Sie die Spitze der Nadel in dem Kulturmedium berühren den Bereich der Scheibe durch gekennzeichnet werden. Druckluft beaufschlagen, um eine kleine Menge des Farbstoffs aus der Nadel ein verdrängenauf das Gewebe d. </li><li> Entfernen Sie die Nadel und überprüfen Sie für die Kennzeichnung unter Fluoreszenz. </li><li> Erfolgreich markierten Scheiben können auf Filter übertragen und kultiviert werden, wie in Schritt 4 beschrieben. </li></ol>

<ol>
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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars:+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells,+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units,+the+cusps.">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li><li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development.">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li><li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme:+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction.">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Diese Methode der Zahn Kultur hat den Vorteil, dass an der Zahnkeime zuzugreifen ist ausgezeichnet, was eine genaue Linienverfolgung und die Platzierung der Perlen im Epithel oder Mesenchym. Definierte Bereiche der Entwicklungszahnkeim kann deshalb gezielt angegangen werden. Während der Kultur der Veränderung der Morphologie der Zahnkeim verfolgt werden kann, und die Wirkung von Manipulationen schnell beurteilt. Das Verfahren ist jedoch nur für kleine Zahnkeime, bevor eine wesentliche Bildung von harten Geweben, wie Dentin und Schmelz geeignet, da diese nicht genau geschnitten werden. Für Unterkiefer nach E15.5 ist es notwendig, die Knochen vor Hacken entfernen. Dies hat den Nachteil potentiell eine Beschädigung der Zahnkeime, die eng mit dem Knochen aus E16.5 zugeordnet ist. Wir haben erfolgreich zu postnatalen Tag 4 in Scheiben zerschnitten Zahnkeime auf, nach der die Zahn zu hart für den Zerhacker aufgrund der Ablagerung von Zahnschmelz schneiden. Die Scheibe methode funktioniert gut auf Zahnkeime aus E13.5, dh die Knospenstadium 1,6. Vor diesem Zeitpunkt, wenn der Zahn ist an der Epithelverdickung Bühne, tun die Zahnkeime zu entwickeln, aber die Erfolgsquote reduziert und die Morphologie kann auf lange Sicht beeinträchtigt werden. Ein wesentlicher Nachteil des Verfahrens ist, dass die Schneide tritt zufällig durch den Zahn. In einigen Scheiben eine ganze Zahnkeim wird innerhalb einer Scheibe gefunden werden, während in anderen die Chopper können den Zahnkeim durch die Mitte geschnitten. Dies bedeutet, dass es schwierig sein kann, eine große Anzahl von identischen Scheiben zu erhalten. Um dieses Problem zu bekämpfen, ist es möglich, eine Scheibe in der Mitte aufteilen und die rechte und die linke Seite als Versuchs-und Kontroll. Dafür ist jedoch der Unterkiefer sorgfältig auf der Lochscheibe angeordnet werden, um sicherzustellen, dass die Scheibe symmetrisch geschnitten. Für einige Experimente ist es ein Vorteil, dass die Zahnscheiben zerlegen, so dass die internen Strukturen, wie beispielsweise die SchmelzKnoten, für die Kennzeichnung Linie 4 erreicht werden. Der Zahnkeim scheint sehr robust und solche Halbzahnkeime sind in der Lage, in der Kultur gut entwickeln, wie zuvor in halbierten Backenzahn Keime 12,13 gezeigt. Als Alternative zur Kultur in Scheiben schneiden, können Zahnkeime aus dem Unterkiefer und isoliert 14 kultiviert seziert werden. Dadurch wird das Problem der schlechten Ernährung und Sauerstoffversorgung mit Kultivierung große Blöcke von Gewebe verbunden und führt zu einer guten Zahnentwicklung, sondern als Folge der Zahn entwickelt ohne Interaktion mit dem umgebenden Gewebe. Wenn große Mengen der umgebenden Mesenchym entfernt die Anzahl der Zahnkeime, die sich bilden können verändert werden, was die Bedeutung des umgebenden Bindegewebes bei normalen Zahnentwicklung 15. Schnittkultur ist deshalb eine gute Methode zur Untersuchung der Interaktion von Gewebe, zum Beispiel, wie der Knochen-und Zahn bei der Bildung des Alveolarknochens zusammenwirken oder wie die saliDrüsen variieren interagieren mit der Zunge und Mund Epithel, etwas, das verloren geht, wenn diese Gewebe isoliert, kultiviert. In diesem Dokument werden die Verwendung dieser Verfahren für die Kultivierung der Zahnkeime, aber das gleiche Verfahren ist auch für die Kultivierung Entwicklungsunterkieferspeicheldrüsen und sublinguale und nach der Entwicklung der Struktur, wie Meckel-Knorpel (Figur 2).

Für eine Anzahl von Versuchen ist es wichtig, in der Lage, Gewebekultur ex vivo, um die Entwicklung zu verfolgen. Kultur entwickeln Gewebe Zugang zu bestimmten Perioden der Entwicklung und ermöglicht die Manipulation von Genen, die durch die Zugabe von Faktoren, zu dem Kulturmedium, oder beladenen Kügelchen und durch die Verwendung von 1-Transfektion und Elektroporation. Für viele Experimente ist es wichtig, in der Lage, um das Gewebe zu visualisieren, wie es wächst, zum Beispiel, um das Schicksal der Linie markierten Zellen folgen, wie das Gewebe erfährt Morphogenese sein. Dies kann besonders problematisch für Gewebe, die tief innerhalb des Embryos entwickeln, die nicht offensichtlich sind, wenn ein Block von Gewebe aus dem Embryo kultiviert werden. Die Zähne sind gute Beispiele dafür, wie sie in den Unterkiefer, Oberkiefer-und Stirnnasen Prozess zu entwickeln. Wenn die ganze Unterkiefer ist kultiviert die oberflächlichen Strukturen des Zahnes können angezeigt, aber Veränderungen in der Morphologie kann nur analysiert werden, nachdem Schneiden von fixiertem Gewebe <sbis&gt; 2. Wir haben eine Live-Scheibe Kulturtechnik ermöglicht es uns, Zahnkeim Entwicklung zu folgen und den Zugang zu den verschiedenen Teilen des Zahnes während der Entwicklung angepasst. Die Technik Kulturen die Zahnkeimscheiben an der Gas-flüssig-Grenzfläche, mit einem modifizierten Verfahren Trowell 3. Diese Scheibe Kulturen wurden direkt nach der Morphogenese des Zahns und damit Linie Verfolgung unterschiedliche Komponenten, wie beispielsweise die Schmelz Knoten und Zahnpapille und Follikel 1,4-7 sehr nützlich. Die Technik ist nicht auf Maus-Embryonen beschränkt und hat erfolgreich die Kultur Live-Scheiben von Schwein und Schlange Zahngewebe 8,9 verwendet. Zusätzlich zu dem Vorteil, dass die Zahnentwicklung sichtbar, weist die Scheibe Verfahren auch den Vorteil, dass die dünnen Scheiben von Gewebe haben Zugang zu Nährstoffen aus dem Medium und Luft aus dem Inkubator erhöht. Dies führt zu einem verbesserten Wachstum der Zahnkeime, die Entwicklung in vivo übereinstimmen, und zeigen INVASIonen von Endothelzellen in die Papille 7. Im Gegensatz Zahnkeime ganz Kiefer Kulturen entwickeln langsamer als die in vivo und die Mitte der Kultur häufig nekrotische in Langzeitkulturen. In Schnittkultur entwickelt der Zahn innerhalb einer Scheibe des Kiefers, und seine Wechselwirkung mit dem umgebenden Knochen zu entwickeln und in anderen Geweben beobachtet werden. In unserem Verfahren wird das Gewebe unmittelbar nach Präparation ohne die Notwendigkeit, in einem Trägermedium 10,11 einzubetten und keine Notwendigkeit für jedes System, das Gewebe an den Hackblock befestigen zerhackt. Das Verfahren ist daher nicht-invasive und schnell, so dass viele Unterkiefer in einer Sitzung geschnitten werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101077Y</td>
			<td>100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>Cell-labeling solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geminator 500</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>Thomas No. 3885A20</td>
			<td>Dry-heat sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Standard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &#956;m pore size)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>PET track-etched membrane, 6-well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>FE228710</td>
			<td>(Fe/Cr18/Ni10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Intracel Ltd</td>
			<td>051-0500-900 0-100 psi</td>
			<td>Single channel picospritzer III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary with filament 1 mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.1 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.38 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>Used for mouth aspiration lineage tracers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the slice culture method for following development of tooth germs in explant culture

Explantatkultur ermöglicht die Manipulation der Entwicklung von Organen zu bestimmten Zeitpunkten und ist damit eine wichtige Methode für die Entwicklungsbiologe. Für viele Organe ist es schwierig, die Entwicklung Gewebe zugreifen Überwachung während der Ex-vivo-Kultur zu ermöglichen. Die Scheibe Kulturverfahren ermöglicht den Zugang zu Gewebe, so daß morphogenetische Bewegungen folgen und spezifischen Zellpopulationen zur Manipulation oder Linienverfolgung richtet sein. In diesem Beitrag beschreiben wir eine Methode der Schnittkultur, die sehr erfolgreich für Kultur der Zahnkeime in einer Reihe von Arten war. Das Verfahren stellt eine hervorragende Anbindung an die Zahnkeime, die mit einer ähnlichen Rate wie in vivo zu beobachten, durch die andere Backe Gewebe umgeben zu entwickeln. Dies ermöglicht Gewebe Wechselwirkungen zwischen dem Zahn und dem umgebenden Gewebe zu überwachen. Obwohl dieses Papier konzentriert sich auf die Zahnkeime, kann das gleiche Protokoll verwendet werden, um die Entwicklung einer Reihe folgenvon anderen Organen, wie Speicheldrüsen, Meckel-Knorpel, Nasendrüsen, Zunge und Ohr.

Um die Bewegung des ersten Backenzahnsäckchen zu verfolgen, wurden 250 &amp;mgr; m Frontalschnitten durch einen Unterkiefer unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Zahnfollikel ist die Schicht des Bindegewebes, die die äußere Schmelzepithels (OEE) der Entwicklungs Zahn umgibt, und war zuvor gezeigt worden, um an der Bildung von Gewebe des Zahn 6 zu nehmen. Mandibles wurden bei E14.5, die Kappe Stadium der Zahnentwicklung seziert. In der Scheibe war der Umriss des Zahn Epithel klar, und die Kondensation Zahn Mesenchym könnte als ein dunkler Ring um den Zahn Epithel (4A) identifiziert werden. Dil wurde im Mesenchym neben dem äußeren Schmelz Epithel der Zahnscheibe auf der lingualen Seite (4A) eingespritzt. Nach der Markierung wurden die Scheiben für 4 Tage kultiviert und in Abständen fotografiert (Fig. 4B und 4C). In vivo würde die Zahnanlagen erreicht habendie Glocke der Bühne von E18.5 und eine deutliche Glockenstadium Form wurde in den Scheiben beobachtet, was auf eine ähnliche Entwicklung in diesem Zeitraum. Der Fleck des DiI gesehen wurde, in ein Band von Zellen, die sich um den äußeren Zahn Epithel der Zahn aufgewachsen (Fig. 4B und 4C) erstrecken. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Die Bildung von Live-Scheiben. (A) E14.5 Embryos. Gestrichelte Linien zeigen die mit einem Nadelschnittebenen zerlegt, beginnend mit dem unteren Schnitt für Enthauptung. (B) Dissected Unterkiefer. Die Zunge nach unten zeigt. Die Schnittebene für das Gewebe Chopper mit gestrichelten Linien dargestellt. (C) Tissue Chopper zeigt Klinge Arm (BA) und weiß Montagescheibe (MD) mit vorbereiteten Probe (Pfeil). (D) Vertreter Schnitt durch die Mol-Region. Pfeile zeigen auf Backenzahn Keime. (E) Hohe Leistungs Ansicht eines Molaren Slice. Der Zahnkeim Epithel ist mit schwarzen Flecken skizziert. Bilder mit Photoshop geschärft. T = Zunge, DB = Zahnbein, MC = Meckel-Knorpel. Maßstabsbalken in A = 3 mm. Maßstabsbalken in B &amp; D = 1 mm. Maßstabsbalken in E = 500 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50824/50824fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig2.jpg" /> 2. Schneidezahn und Bodenkultur. (A) E12.5 Unterkiefer, die sagittal gehackt hat. Entwicklung Schneidezähne (umrissen weißen Flecken mit Stern) und Unterkieferspeicheldrüsen (mit schwarzen Flecken skizziert und Pfeil) können nur gemacht werden aus. (B) Gleiche Kiefer zeigt zentrale 4 Scheiben abgetrennt. Die Entwicklungsunterkieferspeicheldrüse cals eine Knospe durch verkürzte Mesenchym (Pfeilspitzen) in den zwei seitlichen Abschnitte (oben des Bildes) umgeben ein gesehen werden. Die Kondensations Mesenchym um die Drüse ist rot umrandet. Die Schneidezähne sind an der Epithelverdickung Stufe (Stern) in den beiden zentralen Scheiben (unten im Bild). (C) Sagittal-Schnitt durch einen Schneidezahn bei E14.0 an Tag 0. (D) Gleiche slice 1 Tag später. (E) Gleiche Scheibe nach 3 Tagen in Kultur. (CE) Pfeil zeigt auf Schneide-und Form Lippen-Hals-Schleife. Pfeilspitze zeigt auf die Entwicklung Kieferspeicheldrüse. In der Kultur der Zahnkeim erstreckt sich nach hinten, wie die Hals-Schleifen zu wachsen, während der Speicheldrüse weiter zu unterziehen Verzweigung Morphogenese und Lumenbildung. Bilder mit Photoshop geschärft. T = Zunge, MC = Meckel-Knorpel. Maßstabsbalken in A &amp; B = 1 mm. Maßstabsbalken in C, D, E = 500 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50824/50824fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier</a>für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig3.jpg" /> 3. Kultur-Methode. (A) Cultured Slice. Die Kultur sitzt auf einem transparenten Filter über ein Metallgitter über Medium suspendiert. Ein Loch in dem Gitter kann die Scheibe mit Licht von unten dargestellt werden. (B) Schematische Darstellung der Kultur-Methode. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50824/50824fig4.jpg" /> 4. DiI Markierung der Zahnfollikel. (AC) verschmolzen Licht-und Dunkelfeld-Bilder, die die Entwicklung Backenzahn Keim und Ort der Linie Dil-Label. (A) Tag 0. Der Zahnkeim (Pfeilspitze) ist an der Kappe Bühne. Dil markiert Zellen des Follikels an der lingualen Seite des Zahns. (B </strong&gt;) 1. Tag. (C) 4. Tag. Der Zahnkeim die Glocke Stadium erreicht hat und die DiI markierten Zellen gesehen werden, um in einem Bogen um den Entwicklungsaußen Schmelzepithels auszubreiten. Bilder in Photoshop nach dem Zusammenführen Schichten mit den Bildschirm-Modus geschärft worden. Epithel der Zahn skizziert mit schwarzen Flecken. DP = Zahnpapille innerhalb des inneren Schmelzepithels liegt. DF = Zahnfollikel, die um die Außen Schmelzepithels läuft. MC = Meckel-Knorpel. Maßstabsbalken in A, B, C = 500 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50824/50824fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Hier werden wir ausführlich eine Methode, um Kultur Zahnkeime im Unterkiefer Scheiben mit einem Gewebe-Chopper. Diese Methode ermöglicht einen einzigartigen Zugang zu den Zahn während der Entwicklung und bietet eine ausgezeichnete Gelegenheit für die Manipulation und Abstammung Verfolgung, nicht verfügbar mit traditionellen Kulturverfahren.

Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  King's College London.  Hier werden wir ausführlich eine Methode, um Kultur Zahnkeime im Unterkiefer Scheiben mit einem Gewebe-Chopper. Diese Methode ermöglicht einen einzigartigen Zugang zu den Zahn während der Entwicklung und bietet eine ausgezeichnete Gelegenheit für die Manipulation und Abstammung Verfolgung, nicht verfügbar mit traditionellen Kulturverfahren. 

Serie: The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Forschung

Biologie

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Vorbereitung der Gene Gun und Aufzählungszeichen Biolistic Transfektion von Neuronen in Scheiben Kultur

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.