Skidmore Faculdade Desenvolvimento Grant financiou a elaboração e publicação deste manuscrito.

1. Montagem Embriões (após a conclusão da técnica de visualização selecionado, como imunocitoquímica, hibridização in situ, etc) <ol><li> Coloque embriões num prato 35 milímetros de Petri cheia com tampão de escolha (Figura 1A). A escolha do tampão baseia-se no procedimento de marcação. Tipicamente, tampões à base de PBS, são adequados. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, e usando uma pinça, fixar a cabeça com um par de pinças, enquanto puxa a gema de distância com o outro par (Figura 1B). Como alternativa, use um pino de inseto em um suporte inseto pin para puxar suavemente a gema. </li><li> Usando o póquer embrião (linha de pesca (0,41 mm de diâmetro) ou colado a um tubo capilar ou uma pipeta de Pasteur) mover os embriões de uma parte da placa de Petri que não tem uma grande quantidade de detritos gema (Figuras 1C-D). </li><li> Com uma pipeta Pasteur de vidro, aspirar os embriões em tão pouco líquido possível, e gSuavemente pipeta-los sobre uma lâmina (Figura 1E). </li><li> Gentilmente pavio fora o excesso de líquido usando um laboratório wipe. Evitar o contacto com os embriões. </li><li> Adicione uma gota de meio de montagem de embriões. No caso de etiquetas fluorescentes, usar um reagente Antifade de escolha. Para sinais colorimétricos, glicerol a 70% pode ser usado como um meio de montagem. </li><li> Usando o pôquer embrião, orientar os embriões em seus lados em linhas (Figura 1F). </li><li> Adicione uma &quot;bagatela&quot; de vaselina ou graxa de vácuo elevado para cada canto de uma lamela (Figura 1G). Isso evita danos de embrião de compressão excessiva. </li><li> Coloque lamela (lado vaselina para baixo) em cima de embriões (Figura 1H). </li><li> Bata suavemente na lamela em cada canto até o meio de montagem (70% de glicerol ou reagente de montagem anti-fade) está tocando a lamela (Figura 1H). </li><li> Se necessário, adicione mais mídia montagem pipetando ao lado do coverslip, usando uma pipeta, no intervalo de 20-200 ml. Ele vai pavio para baixo. </li><li> Usando um laboratório de limpar, completamente limpa ao redor da lamela. Esteja certo de não aplicar pressão sobre a lamela, pois isso irá danificar embriões. Essa área deve ser seco e não tem vaselina ou meios de montagem do mesmo. </li><li> Use unha polonês para selar em torno da borda da lamela (Figura 1I). </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Wnt+signaling+using+Lithium+Chloride:+Inquiry-Based+Undergraduate+Laboratory+Exercises.">Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises.</a> Zebrafish. , (2012).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling.">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li><li>Gribble, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis.">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

Não existem interesses financeiros concorrentes para qualquer autor.

Montagem lateral de embriões Zebrafish auxiliares de visualização fixa de desenvolvimento da medula espinhal. Através da remoção da gema de bola, a distância de trabalho necessária para a imagem microscópica excepcional é reduzida. Os resultados representativos foram limitados à fase 24 hpf, no entanto, esta técnica pode ser usado tão cedo quanto 18 hpf, embora embriões precoces são mais difíceis de dissecar devido ao tamanho do embrião e a fragilidade do tecido. Esta técnica é também aplicável aos embriões mais velhos do que 24 hpf. Ajudado pela claridade óptica do peixe-zebra embrionário, a capacidade de executar telas genéticos para a frente, a genética reversa e abordagens transgênicas, vários processos de desenvolvimento podem ser investigadas. Isto inclui os índices de mitose de células progenitoras neuronais com marcadores como BrdU e anti-fosfo-histona 04-06 março e padronização através da expressão de marcadores progenitoras neuronais e gliais do pax, NKX, dbx, e oligo families 1,4-6. Reagentes que relatam determinação glial e neuronal (tal como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e HuC / D) 1,4,5,10 pode ser usado. Subtipo diferenciação neuronal pode ser analisado através da expressão da ilhota, VSX, engrailed e genes gata 1,4-6. E, finalmente, a análise de orientação axónio é possível por meio de anticorpos, tais como anti-tubulina acetilada, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Embora outros sistemas modelo de vertebrados (mouse e galinha) são usados ​​para estudar o desenvolvimento da medula espinhal, apenas o peixe-zebra permite a visualização simultânea de todos os eixos de desenvolvimento do embrião intacto. A limitação óbvia para esta abordagem é que os embriões são fixas, que se opõe a uma imagem ao vivo. De facto, a remoção do (ou dano para) os resultados de gema de morte embrionária rápida, pelo que não é possível reduzir a distância de trabalho em embriões vivos utilizando esta técnica. No entanto, a alta ampliação co espinhalrd imagem em embriões vivos é possível. A fim de preservar a gema durante a imagem ao vivo, os embriões podem ser colocados em lâminas de depressão, que proporcionam um espaço maior entre a amostra e a lamela. Alternativamente, vários 22 milímetros x 22 milímetros lamelas podem ser colados ou deslizamento de um 3 em x 1 em lâminas microscópicas. As lamelas servir como uma &quot;ponte&quot; para a lamela sobrejacente. Se os embriões são mais velhos do que 18 hpf, tricaina é usada para anestesiar os embriões para evitar o movimento. Enquanto uma distância de trabalho de 0,288 milímetros é necessário para embriões deyolked em 24 hpf, quando se trabalha com embriões vivos incorporados em agarose, com gema intacta, uma lente microscópica com uma distância de trabalho de 3,3 mm é suficiente. Alternativamente, culturas de explantes derivados de embriões deyolked pode ser visualizada utilizando uma técnica de imobilização de coágulo de plasma 13. Várias populações de células podem ser observados através da utilização de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, tais como a GFP, mCherry, ou o photoconcorante convertíveis Kaede (para citar alguns). Além disso, as células marcadas com fluorescência dentro embriões quiméricos também pode ser visto com esta abordagem 14. A técnica de montagem consistente que é estável durante meses é uma ferramenta fundamental para os biólogos do desenvolvimento e celulares. Esta técnica simples é reprodutível, permitindo uma fácil comparação entre diferentes ensaios experimentais. Além disso, o alinhamento dos embriões em linhas prontamente permitir a identificação de embriões específicos para análise posterior.

A visualização da medula espinal no peixe-zebra é inibida por um número de factores. Devido à espessura de somitos sobrepostas e o local interno da medula espinal, a uma distância consideravelmente longo trabalho é necessário para alta resolução celular. A bola gema (que ainda está presente durante os primeiros estágios de neurogênese) aumenta ainda mais a distância de trabalho necessário, e é facilmente danificado pela pressão de uma lamela. Além disso, os restos de gema danificada proíbe clara visualização do tecido. Embora sejam possíveis cortes transversais no eixo dorso-ventral (DV), eles não são facilmente permitir a visualização simultânea no ântero-posterior (AP) Eixo 1. Para superar esses obstáculos, os embriões são dissecados e montados em lâminas. Este procedimento proporciona vários benefícios. Primeiro, os embriões de peixe-zebra prontamente se deitar com a lateral voltada para cima, o que facilita a visualização do eixo AP. Em segundo lugar, a remoção da gema ball diminui a distância de trabalho necessário, e limita detritos. Em terceiro lugar, este processo de montagem permite tanto fluorescente e a microscopia de campo claro. Em quarto lugar, os embriões montados são estáveis ​​durante meses a 4 ° C, permitindo a visualização exemplar prolongada. Finalmente, a progressão do desenvolvimento ocorre em que segmentos anteriores são mais maduros do que os segmentos posteriores. A fim de assegurar que encenadas hemisegments espinhais combinados são comparados entre os embriões, que recobre tecido somito é utilizado como um guia. Por exemplo, a décima somito mais posterior sobrepõe hemisegmento espinal décimo, o que é equivalente desenvolvente em embriões combinado da fase. Este procedimento de montagem de embriões intactos permite uma fácil identificação de somitos. Usamos genética e genes tecnologias knock-down para estudar os mecanismos de orientação do axônio na medula espinhal em desenvolvimento. Em particular, nós determinamos que robo2, robo3, e DCC são necessários para comissural primária Ascending (COPA) pathfinding axônio. Usando o procedimento de montagem descrito aqui, fomos capazes de examinar o crescimento ventral, cruzamento da linha média, a largura da comissura, dorsal e 2,3 crescimento anterior. Este processo de montagem pode também ser aplicado para DV ou AP padronização da medula espinhal. Temos utilizado este procedimento para determinar os papéis díspares de efetores Wnt a jusante padronização DV da medula espinhal. Usando esta montagem, fomos capazes de obter resolução de marcadores DV no nível da célula única, e determinar mudanças padronização minutos como resultado da alteração da recepção do sinal Wnt 4,5. Este procedimento também permite a montagem para o cálculo do índice mitótico através de anti-phosphohistone 3 ou rotulagem BrdU (proliferação progenitor) diferenciação 5.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

A medula espinhal peixe-zebra é um modelo de investigação eficaz para investigação do sistema nervoso por várias razões. Primeiro, genética, transgénicos e de genes abordagens de knockdown pode ser utilizado para examinar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Em segundo lugar, as grandes garras de embriões developmentally sincronizados fornecem grandes amostras experimentais. Em terceiro lugar, a claridade óptica do embrião zebrafish permite aos pesquisadores visualizar progenitor, glial, e as populações neuronais. Apesar de embriões de peixe-zebra são transparentes, espessura da amostra pode impedir a visualização microscópica eficaz. Uma razão para isso é o desenvolvimento conjunto do tecido da medula espinal e somito sobrejacente. Outra razão é a grande bola de gema, que ainda está presente durante os períodos de neurogênese cedo. Neste artigo, demonstramos microdissecção e remoção da gema em embriões fixos, que permite a visualização microscópica do tecido circundante, preservando somito. Nós also demonstrar montagem semipermanente de embriões de peixe-zebra. Isto permite a observação de neurodesenvolvimento nos eixos dorso-ventral e ântero-posterior, uma vez que preserva a tridimensionalidade do tecido.

Quando elucidar os mecanismos subjacentes a vários eventos de desenvolvimento, tais como padrões celular, diferenciação, e a orientação do axónio, é importante ser capaz de visualizar as células dentro do contexto do seu tecido. Defeitos padronização dorsoventral tipicamente apresentam-se como uma mudança ventral ou dorsal no domínio de fatores de transcrição expressão na pax, NKX ou famílias dbx 4. Às vezes, as mudanças podem ser sutis, compreendendo apenas alguns diâmetros celulares 4. Estudo transversal permite que este tipo de análise. No entanto, os reagentes com sinais mais fracos, ou secções transversais que não são perpendiculares ao eixo do AP pode limitar interpretação. Além disso, a análise transversal não facilmente levar em conta se as mudanças persistem no eixo AP, e baseia-se na disponibilidade de um criostato. Essa limitação é contornada por visualizações laterais da medula espinhal. Como pode ser visto na Figura 2B, nkx6.1 ARNm é distributed em aproximadamente a metade ventral da medula espinhal às 24 horas pós-fecundação (hpf), dentro do domínio progenitor. As células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas, devido à presença da placa de piso, que se encontra na parte mediana da medula espinal. Visualizado com DIC óptica, as células individuais são claramente distinguíveis, e um limite definido entre expressar e nonexpressing células é evidente. Saída do ciclo de células progenitoras é acompanhada por alterações na expressão de genes. Por exemplo, todos os neurônios pós-mitóticas expressar HuC / D que é detectável com imunocitoquímica 1,5. sondas de mRNA para ilhota, gata, e as famílias VSX rotular neurônios pós-mitóticas específicas de posição consistente e número dentro de cada hemisegmento medula espinhal 6. Além disso, os receptores de orientação do axónio, tais como aqueles na família robo são expressos em populações restritas de neurónios pós-mitóticos (Figura 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montagem lateral de embriões permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticas. Do mesmo modo, células progenitoras, que continuam a dividir pode ser quantificada com anti-fosfo-histona 3 imunocitoquímica, bem como a rotulagem BrdU. Além disso, a morte celular pode ser avaliada com TUNEL rotulagem 4-6. Aos 24 hpf, os axônios dos neurônios pós-mitóticas seguintes podem ser visualizados com vários métodos, e são distinguíveis no nível da célula única: Dorsal Lateral Ascendente (Dola), comissural primária Ascendente (COPA), comissural Secundária Ascendente (CoSA), Ventral Longitudinal Decrescente (estepe), Kolmer-Agdur (KA), bifurcando comissural / longitudinais (COB / L), circunferencial Crescente (CIA), circunferencial Descendente (CID), e Unipolar comissural Descendente (UCoD), Rohon-Barba (RB), neurônios motores ( M) 9. Os axônios estendem-se desde esses neurônios no dorsal, ventral, anterior e posterior direções. Eles ramo, cruzar a linha média, e sair tanto o dorsale medula espinal ventral. Quando combinado com microscopia confocal a laser, estes comportamentos celulares variadas são evidentes em embriões lateralmente montados, utilizando imunocitoquímica e proteínas fluorescentes geneticamente codificados como GFP 2. Na Figura 2D, ZNP-1 imunocitoquímica foi usado para rotular motoneurons desenvolvimento. Os motoneurónios sair da espinal medula ventral a inervam a musculatura desenvolver circundante. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissecção e laterais montagem de embriões de peixe-zebra. (A) Após o processamento para imunofluorescência, hibridização in situ, etc, os embriões são colocados em um prato de 35 milímetros Petri cheia de PBT (PBS com 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS com 0,1% de Tween-20). A gemabola (YB) é evidente. (B) A gema é removido por fixar a cabeça do embrião seguido de dissecção cuidadosa. (C) Um embrião de póquer (linha de pesca colada a uma pipeta de Pasteur) é usada para separar os embriões e os restos da gema (D). Embriões limpos são pipetadas para uma lâmina de microscópio, (E) e alinhados (F). Gelatina (G) de petróleo é aplicada aos cantos da lamela. (H) A lamela é colocada delicadamente em cima dos embriões em meio de montagem. (I) Nail polonês é usado para selar as bordas da lamela. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figura 2. Análise dos padrões de expressão gênica e axônio pathfinding em (A) Desenho de um embrião de peixe-zebra em 24 hpf lateralmente montado embriões de peixe-zebra.. Em BD, aproximadamente quatro hemisegments acima da extensão saco vitelino são visualizados (área de box). (B) nkx6.1 é expresso na medula espinal ventral, incluindo a placa de piso (FP). (C) robo3 é expresso em neurónios pós-mitóticos (PMN). A zona de placa de piso e progenitor não é evidente neste plano focal mais lateral. Em B, C, a espinal medula é delimitado por um suporte, no lado esquerdo da imagem. (D) confocal microscopia foi utilizado para a imagem ZNP-1 de imunofluorescência, que rotula axónios motores que saem da medula espinal ventral. Em todas as imagens, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. A 40X distância de trabalho longa, imersão em água (NA 0,8) lente foi usada (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K visualizações.  Skidmore College.  Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos. 

Vídeo: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percussão Fluid lateral: Modelo de Lesão em Ratos

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...