Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant HL093196 (RCR) e da Pesquisa Atlanta e Education Foundation (AREF).

I. sensibilização a alérgenos e Challenge (ver Figura 1) A. Para o desafio intratraqueal <ol><li> Para a sensibilização inicial, injectar macho ou fêmea C57BL / 6 ou ratinhos BALB / c (6-8 semanas de idade) por via intraperitoneal no dia 0 e novamente no dia 7, com 20 ug de ovalbumina (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionado em 0,2 ml de fosfato estéril tamponada salina (PBS) contendo 2 mg de hidróxido de alumínio (Sigma-Aldrich) ou com 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril como controle. </li><li> Desafio com o antigénio, conforme apropriado (por exemplo, nos dias 14, 16, 18, e 20). Procedimento desafio seguinte. </li><li> Anestesiar rato com uma injecção intraperitoneal (ip) de uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Garantir o rato é completamente anestesiados durante pelo menos 10 min. </li><li> Superfície operação ângulo de 45 graus ou mais. Coloque o rato sobre esta superfície mantendo lado ventral para cima e cabeça para cima. </li><li> Gancho thread sob incisivos da frente para segurar a cabeça para trás. Nível das patas com um outro para garantir a traquéia é reta e usar a fita etiqueta para segurar as pernas. Mergulhe sítio cirúrgico com 70% EtOH e cotonete. </li><li> Aplicar bupivicaine (0,1 a 0,2 ml de solução a 0,25%) topicamente no local da incisão. </li><li> Nip pele na garganta com uma pinça e puxe-o delicadamente para fora. Faça uma pequena incisão vertical com uma tesoura cirúrgica. Minimize o tamanho da incisão. </li><li> Prepara-se uma seringa de 1 ml com 50 ul de PBS ou OVA 0,1% em PBS e inseri-lo de uma pipeta de repetitivo (Tridak Stepper, Torrington, CT). Tomar a pipeta numa mão e usar o outro para segurar o tecido para trás com as pinças e expor a traqueia. </li><li> Segure a seringa como paralela à traquéia possível, inserir a agulha através da parede da traquéia e injetar a solução. </li><li> Manter mouse em uma injeção vertical orientação a seguir para permitir tempo para solução para resolver nos pulmões. </li><li> Área da ferida levemente e esterilizada estreita compinças e selo com sutura. </li><li> Coloque o rato esterno para baixo sobre uma almofada de aquecimento e permitir-lhe recuperar até que esteja totalmente ambulatorial. Após a recuperação, retornar o mouse para a instalação de cuidados com animais e monitorá-lo diariamente para detectar sinais de seroma, inflamação ou infecção, deiscência da ferida e até que a ferida estiver totalmente curado. </li></ol> B. Por Desafio por nebulização <ol><li> Sensibilizar ratinhos no dia 0 por injecção intraperitoneal de 20 mg de OVA (Sigma-Aldrich) emulsionada em 0,2 ml de PBS estéril contendo 2 mg de hidróxido de alumínio (Sigma-Aldrich) ou com 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril como controle . </li><li> No dia 14, aumentar a sensibilização por injecção ip como descrito acima. </li><li> No dia 21 r, 22, 23, 24 e 25 após a sensibilização inicial th, os ratinhos de desafio por exposição durante 30 min a OVA nebulizada 1% ou PBS sozinho entregue através de um nebulizador ultra-sons (Buxco Research Systems, Wilmington, NC). </li><li> Colocar os ratinhos câmara principal de WBP; aclimatar-los dentro da câmara de pletismografia durante pelo menos 10 min. </li><li> O local de 1 ml de OVA 0,1% em PBS estéril ou PBS estéril sozinho, como descrito nos passos 4-6 abaixo, através de uma ampola. Nebulização durante 30 min. </li><li> Remova o copo de nebulizador e descartar a solução restante. </li><li> A nebulização pode ser realizada em todos os ratinhos simultaneamente usando uma câmara de nebulização. </li></ol> II. Determinação da hiperresponsividade brônquica à metacolina A. Medição não-invasiva de hiperresponsividade das vias aéreas por pletismografia de corpo inteiro (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC) <ol><li> Permitir que a garrafa de metacolina em pó a aquecer até à temperatura ambiente antes da abertura (metacolina é muito higroscópico e irá formar grumos inúteis se permitido para absorver água). Prepara-se uma de 200 mg / ml de solução concentrada em PBS estéril, em seguida, fazer de série 2-diluições (por exemplo, 100, 50, 25, 12,5 e 60,25 mg / ml). Mantenha soluções frio. </li><li> Configure o equipamento como se segue: ligue entrada principal do WBP para nebulizador, o viés de fluxo de entrada de ar da bomba, e saída WBP a armadilha de gás usando apertadas tubos de borracha. Anexar transdutor de pressão para colmatar as saídas das câmaras principais e referência do WBP. Ligue transdutor de pressão de pré-amplificador com os cabos fornecidos, e se conectar pré-amplificador para PC utilizando o cartão de aquisição de dados específico. </li><li> Calibrar o pré-amplificador utilizando o software de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Colocar os ratinhos câmara principal de WBP; aclimatar-los dentro da câmara de pletismografia durante pelo menos 10 min, em seguida, as leituras da linha de base de registo (Penhbase) durante 3 min. </li><li> O local de 1 ml de PBS estéril no copo do nebulizador. Nebulização durante 2 min e, em seguida, monitorar as variáveis ​​respiratórias para um min 6 adicional durante a fase de secagem. Remova o copo de nebulizador e descartar qualquer PBS restante. </li><li> O local de 1 ml de 6,25 metacolina mg / ml no copo do nebulizador e REPEAT nebulização durante 2 min mais um ciclo de controlo 6-min. </li><li> Repita medição com 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml de metacolina, usando o mesmo período de nebulização 2-min e 6-min ciclo de controlo. </li><li> Retire os camundongos das câmaras e devolvê-los às suas gaiolas. </li><li> Refil nebulizador copo com 1 ml de PBS estéril e executar outra seqüência para lavar a tubulação. </li><li> Desligue os fluxos de ar, desmontar, e limpe todas as câmaras antes de executar um segundo conjunto de animais. </li></ol> B. medida invasiva da responsividade das vias aéreas pelo computador controlado ventilador (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canadá) <ol><li> Pesar o rato e anestesiar por injecção intraperitoneal (ip) de 60 mg por kg de peso corporal de sódio pentobarbital. </li><li> Após anestesia adequada posição, os ratos ventro-dorsal para traqueostomia. </li><li> Desinfectar a pele do pescoço com etanol 70%. Aplicar bupivicaine (0,1 a 0,2 ml de solução a 0,25%) por via tópica no incision local. Incisão e abrir a pele do pescoço. Separar os músculos do pescoço e expor a traquéia. </li><li> Faça uma 1 - a 2 mm incisão na traquéia com uma tesoura fina (ter a certeza de não cortar a traquéia) e inserir o tubo traqueal com cautela. Amarre uma sutura ao redor da traquéia para evitar uma fuga de ar. </li><li> Coloque o mouse na câmara pletismógrafo de corpo e conectar o tubo inserido traqueal ao ventilador. </li><li> Iniciar ventilação mecânica. Ajuste a taxa respiratória apropriada e volume corrente / acidente vascular cerebral (AVC 150 / min e 200 ul, respectivamente, para um rato 20-g). Certifique-se que o tórax está se movendo em sincronia com o ventilador. Se o mouse está &quot;lutando&quot; com o ventilador (respiração auto-), injetar mais anestésico e esperar a sincronização. </li><li> Após medidas de base, manter os ratos sob ventilação linha de base para outro 3 min, e então tomar a 2 ª série de medições de impedância. Este 2 º conjunto de medidas de base é usada para calcular os valores basais. </li><li> Entregar PBS ou metacolina (MCH) desafios (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml) pela canalização de fluxo inspiratório do ventilador através de um nebulizador ultra-sónico. </li><li> Após cada desafio com MCH (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml), retornar o pistão para entregar uma Vt de 10 ml / kg a 120 ciclos / min e tomar medidas de impedância. </li></ol> III. Medição da infiltração celular no espaço aéreo A. Perform lavado broncoalveolar (LBA) <ol><li> Após a medição da AHR, eutanásia camundongos com CO 2, e posicione cada rato em sua parte traseira no bloco cirúrgico. </li><li> Mergulhar a área com EtOH a 70%. </li><li> Começando na parte inferior do abdome, corte abrir a cavidade abdominal e remover a pele / músculo superior, subindo em direção às costelas. </li><li> Uma vez que as costelas são visíveis, use uma tesoura para cuidadosamente punção do diafragma. Os pulmões devem entrar em colapso para longe do diafragma. Tenha especial careful não nick dos pulmões ou coração. </li><li> Cortar a caixa torácica para expor totalmente os pulmões / coração (evitar o corte de todas as grandes vasos sanguíneos para manter o sangue de encher o site). </li><li> Utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 27 (BD seringas, Franklin Lakes, NJ), a punção dos ventrículos cardíacos e lentamente e cuidadosamente puxar para trás da seringa para recolher o sangue. Tome cuidado para evitar o colapso do coração. </li><li> Recolher o soro de sangue utilizando este protocolo padrão. Armazenar a -70 ° C até à utilização. </li><li> Cortar pele e do tecido a partir da garganta até a traqueia é revelada. Limpar o tecido suficiente para trabalhar facilmente dentro do campo (mais uma vez, evitar o corte de todas as grandes vasos sanguíneos). </li><li> Com uma tesoura curva, corte sob a traquéia para limpar o caminho. </li><li> Passar o ponto de uma pinça curvos sob a traqueia e agarrar a extremidade de um pedaço de sutura. Desenhe o fio de sutura sob a traquéia. </li><li> Amarre um meio nó frouxo-sobre a traquéia, baixa na garganta. </li><li> Carefully corte de um entalhe, suficiente em tamanho para a cânula, acima do fio de sutura. </li><li> Cuidadosamente inserir a cânula no orifício e para baixo da traqueia para além do ponto do fio de sutura. Pressione suavemente para frente até que a cânula surge apenas na entrada para os pulmões (muito longe: pulmões punção; muito curtos: traquéia colapso ao tentar recuperar BAL). </li><li> Apertar fio de sutura e nó completa para selar traqueia em torno da cânula. </li><li> Bloqueio da seringa (contendo 1 ml de PBS) sobre a cânula, e pressionar suavemente o fluido para o pulmão. Lobos pulmonares devem individualmente inflar lentamente. Não excesso de preenchimento. Para um crescimento total de mouse 0,9-1,0 ml é o máximo absoluto. 0,8 ml pode ser mais seguro. Bloquear seringa vagamente a cânula, caso contrário, é susceptível de causar danos ao tentar desengatar. </li><li> Retirar fluido a partir de pulmões. Se a resistência for encontrado (tecido sugado para dentro da cânula), prima cânula lentamente mais para dentro do pulmão e retomar a remoção. Tente também girar a cânula no lugar. Se todos os else não, retirar do caminho parte cânula, a traquéia é muito mais provável a entrar em colapso neste caso. </li><li> Retire uma seringa de cânula, depósito LBA no recipiente, e repetir 2 vezes com solução PBS fresco. </li><li> Manter a solução BAL em gelo até centrifugadas. </li><li> Use o LBA e soro para medir a IgE OVA específica utilizando comercialmente disponível do mouse IgE ELISA kits (Bioproducts MD, St. Paul, MN). </li></ol> B. contagem de células e determinar os diferenciais de <ol><li> Centrifugar a BAL fluido 5 min a ~ 600 × g, 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento de células suavemente em PBS e manter em gelo. </li><li> Coloque um hemocitômetro de Neubauer padrão com a suspensão diluída de células e contagem das células. </li><li> Remover alíquotas de 2 × 10 4 células em 10 a 40 volumes ul para cytospins. Diluir as células, se necessário. </li><li> Para cytospins, misture 2 × 10 4 células, 130 PBS ul e 10 ul FBS. Adicione a mistura de célula inteira para DOUBle cytospin funil e centrifugar 10 min a 700 rpm, utilizando cytoslides duplas para amostras em duplicado. </li><li> Permitir que as lâminas para secar à temperatura ambiente durante 1 h antes da coloração. </li><li> Coloração das lâminas usando Diff-Quick mancha (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Os resultados representativos Constrição das vias aéreas excessiva após estímulos provocativos é uma característica proeminente do clínico da asma. Descrevemos dois métodos para medir a hiper-responsividade das vias aéreas, tais à metacolina em ratinhos OVA-sensibilizadas e desafiados: corpo inteiro pletismografia (Figura 2) e oscilações forçadas utilizando o sistema de flexiVent (Figura 3). Ambos os métodos demonstram que a sensibilização OVA e desafio produz hiper-responsividade das vias aéreas em ratinhos. Eosinófilos rico inflamação das vias aéreas é outra característica marcante de ambos clínico da asma e doença alérgica das vias aéreas em ratos. Como mostrado na Figura 4 </strong&gt;, a sensibilização OVA e desafio aumenta grandemente o número total de células que podem ser recuperados a partir da vias respiratórias por BAL. Os números de eosinófilos e, em menor extensão, os neutrófilos são especialmente aumentada. Evidências indicam que os resultados das vias respiratórias alérgicas doença de excesso de anticorpos IgE a antígenos sensibilizantes. Sensibilização e desafio com OVA, utilizando os protocolos aqui descritos aumenta os níveis de IgE em ambos soro e fluido BAL de ratinhos tratados (Figura 5). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema experimental para OVA induzida asma alérgica. Ratos foram sensibilizados por duas vezes ip com 20 mg de OVA emulsionado em 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril, ou 2 mg de hidróxido de alumínio em 0,2 ml de PBS estéril sozinho, seguido no pontos de tempo indicados por isso o desafio com 0,1% de OVA ou solução de PBS estéril ou por ex diária<html> posure durante 30 minutos a nebulizada OVA a 1% em PBS ou PBS sozinho entregue através de um nebulizador ultra-sons (Buxco). Vinte e quatro horas após a exposição OVA final, responsividade das vias aéreas foi determinado. Subsequentemente, o fluido BAL, amostras de sangue, as células do pulmão, e os tecidos foram recolhidos para análise posterior. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figura 2. Ratos de avaliação de alérgeno-induzida hiperresponsividade das vias aéreas por método não invasivo. (N = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, hiper-responsividade das vias aéreas à metacolina inalado foi determinada utilizando todo o corpo pletismografia como descrito no protocolo. Penh foi determinada e expressa como Penh ratio (média Penh durante o intervalo de tempo de 8 min com metacolina, dividido pelo Penh média, durante o intervalo de 8-min com PBS). *, P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Ratos de avaliação de alérgeno-induzida hiperresponsividade das vias aéreas através de um método invasivo (oscilação forçada). (N = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, hiper-responsividade das vias aéreas a concentrações crescentes de metacolina inalado foi determinada pelo oscilações forçadas (flexiVent) Método como descrito no protocolo. A, B) a resistência das vias aéreas; C) elastância pulmonar. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figura 4. Contagem de células BAL fluido. Ratinhos (n = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, (Top) As células foram recolhidas e BAL células totais foram contadas como descrito no protocolo. (Bottom) slides citospina foram preparado e corados com Diff-Quick. Tot = total de células; Eos = eosinófilos; Neu = neutrófilos, macrófagos MAC =; LYM = linfócitos. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figura 5. OVA-IgE específica. Os ratinhos (n = 4/group) foram sensibilizados e desafiados com OVA. Vinte e quatro horas após o último desafio, IgE foi medido no fluido BAL e no soro do sangue recolhido por punção cardíaca, tal como descrito no protocolo. *, P &lt;0,05 vs PBS.

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Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo VAMC Atlanta IACUC Comissão sob o protocolo n V010-10.

Os modelos animais de doença alérgica das vias aéreas proporcionar ferramentas importantes para estudos relevantes para a asma clínica. Um certo número de modelos diferentes, empregando espécies variando e antigénios, têm sido desenvolvidos. O mouse, uma espécie de laboratório atraentes e freqüentemente usado, também oferece uma série de vantagens para os modelos de doença alérgica das vias aéreas. 9,10 Embora tais modelos não simulam asma em todos os aspectos, 11, com aspectos da doença crônica, sendo particularmente difícil de reproduzir, 12,13 confirmamos aqui que muitas das características principais são reproduzidas. Nós também mostram que, como na asma humana, estas características são associados com o aumento do antigénio IgE específica em ambos soro e fluido BAL. Apresentamos dois modelos murinos, tanto OVA empregando como o antigénio, mas utilizando técnicas de desafio diferente. Administração intratraqueal é um tanto complexo e demorado, mas oferece a vantagem de fornecer uma quantidade conhecida de antigénio directamente àpulmão. Também é possível que este método proporciona o antigénio mais profundamente no pulmão do que as alternativas fazer. Nós descrevemos um método invasivo para entrega intratraqueal, mas antigénio pode também ser entregue intratraquealmente através de um tubo ou cânula inserida através da cavidade oral. Este método é descrito em outras partes Jove. Nebulização 14 é mais simples e mais diretamente imita a rota habitual de exposição humana. A determinação quantitativa é mais variável, no entanto, e de entrega para o pulmão pode ser menos eficiente. 15 Com efeito, é provável que uma fracção considerável, mas desconhecida da dose é depositado nas vias respiratórias superiores. Uma terceira alternativa, não descritas aqui, é a entrega intranasal. Novamente, é provável que uma fracção considerável de a dose será depositado nas vias respiratórias superiores. Embora a nossa demonstração é feita utilizando camundongos C57BL / 6, evidências sugerem que certas estirpes de outros pode dar resultados mais robustos em parâmetros específicos. Na comparação de C57BL / 6 com BALB / c 16 ou com ambos BALB / c e FVB / NJ 17 camundongos, os camundongos C57BL / 6 mostrou o menor aumento em AHR. Por outro lado, os ratinhos C57BL / 6 mostraram um maior aumento da eosinofilia em um estudo de 16, mas não no outro. 17 elevações citocinas foram ambos estirpe-e-citocina específica. A estirpe preferida pode, por conseguinte, dependem do ponto de extremidade considerada como mais importante. Duas características principais da doença alérgica das vias respiratórias são vulgarmente escolhido para avaliação, a fim de determinar os efeitos de manipulações experimentais: Ahr e extensão da inflamação das vias aéreas. AHR pode ser medida por pletismografia de corpo inteiro (WBP) ou por oscilações forçadas. Em ambos os casos, metacolina é usado como o desafio provocador. WBP é uma medida funcional em vivo que permite a análise da reatividade das vias aéreas em consciente, movimentando-se livremente ou camundongos minimamente retidos sem cirurgia invasiva e anestesia. Responsividade das vias aéreas é expressa usando o&quot;Pausa maior&quot; (Penh) como um parâmetro da função das vias aéreas alterado. Penh é um parâmetro empírico que reflicta alterações no fluxo de caixa de forma de onda de inspiração e expiração e combina com a comparação do fluxo de caixa no início e final expiratório. WBP tem várias vantagens potenciais comparação com os meios invasivos para medição da resistência pulmonar, uma vez que é tecnicamente menos exigentes e permite medições de responsividade das vias aéreas a estimulantes de aerossol. Este método minimiza ambos os efeitos do stress psicológico eo tempo de preparação animal, tornando-o ideal para medições repetidas (exame do mesmo animal em pontos de tempo diferentes) e de medição ao longo de períodos longos de tempo (&gt; 24 hr), durante o qual uma variedade de aerossóis pode ser administrado de uma forma controlada e reprodutível. Os resultados fortemente relacionada com as dos métodos invasivos, mas é mais rápida e mais fácil. Dois métodos alternativos não invasivos fornecer medições que são ditasa ser mais diretamente relacionado com constrição das vias aéreas. Em duas vezes câmara de pletismografia o rato é forçado a manter a cabeça através de um furo na parte da frente da câmara de toracoabdominal. 18 Uma câmara nasal é então ajustada para a frente da câmara de toracoabdominal e uma cabeça-furo é cortada no filme de látex de vedação entre as câmaras. Este orifício é precisamente dimensionada para proporcionar uma vedação estanque ao ar entre as câmaras, sem restringir o fluxo de ar respiratório. Medições pletismográficos são então levados em ambas as câmaras e do atraso entre os fluxos de nasais e toracoabdominal são usados ​​para calcular a resistência específica das vias aéreas (sRAW). Cabeça fora pletismografia é similar, exceto que o ar flui livremente na cavidade nasal e nenhuma medida pletismográficos são feitas há 19. O parâmetro primário é calculado taxa de fluxo na fase midexpiratory (EF 50). Ambas as técnicas, como WBP, são adequados para medições repetidas ao longo de um certo número de horas, que permita a determinação de both respostas precoces e tardias. No entanto, tanto os animais requerem a ser contido, o que pode produzir resultados irregulares, a menos que os animais estão acostumados a do aparelho ao longo de vários dias. Também pode ser difícil garantir uma vedação estanque ao ar eficaz, que é essencial em ambos os casos. Além disso, uma vez que ambos Penh e sRAW têm sido mostrados para correlacionar fortemente com as medições invasivas, e Penh e sRAW têm sido mostrados para correlacionar directamente em cobaias, 20 pode ser questionada se a informação adicional obtida justifica a maior dificuldade experimental. No método de oscilações forçadas, os ratinhos profundamente anestesiados são traqueotomizado e de um ventilador está ligado ao tubo. Pressão de fluxo de medidas como o ventilador infla e desinfla o pulmão, em seguida, permitir que a medição direta da resistência e da complacência pulmonar dinâmica. Isso fornece informações sobre a mecânica das vias aéreas que não estão disponíveis com WBP. Paraoscilação ced é tecnicamente mais difícil, no entanto, e é tipicamente um procedimento terminal. Como parâmetros experimentais, os dois processos geralmente dão resultados semelhantes 19. A outra característica proeminente da asma clínica comumente usados ​​para avaliar o efeito de manipulações experimentais na doença das vias aéreas murino alérgica é uma inflamação eosinofílica. Embora outros aspectos da inflamação pode ser medido, bem como, mais comumente este envolve a determinação da extensão da célula inflamatória (especialmente eosinófilos) infiltração nas vias aéreas, do pulmão, ou ambos. O número eo tipo de células das vias respiratórias é determinada em BAL fluido: número de células Primeiro total é determinada por contagem num hemacitómetro e, em seguida tipo de célula é determinada por citocentrifugação diferencial de coloração a seguir. Embora a recolha do fluido BAL pode, em princípio, ser realizada em ratos vivos, como é em seres humanos, é mais usualmente e convenientemente realizada seguindo a eutanásia. Eosinófilosinfiltração para os pulmões é avaliada por excisão do pulmão seguido por técnicas padrão de histopatológicos. Em alguns casos, pode também ser útil para avaliar a extensão em que a sensibilização de antigénio e desafio estimula taça (produtoras de muco) a proliferação celular. Isto é facilmente conseguido através da coloração das secções de pulmão com ácido periódico de Schiff, que é específico para o muco. Antigen-IgE específica pode também ser medida em fluido BAL e soro utilizando kits prontamente disponíveis. IgE de medição pode ser importante em configurações em que o grau de sensibilização, como distinta da resposta órgão final, é um parâmetro crucial. Há uma grande variedade de outras medições, incluindo citocinas e respostas das células T, que são valiosos adjuvantes para o estudo da doença alérgica das vias aéreas em modelos animais que não tenham descrito aqui. É a grande variedade de respostas relevantes que a sensibilização de antigénio e desafio pode eliciar que tornam tais modelos valioso no pernoy desta doença.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ovalbumina </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de alumínio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetil-β methylcholine-cloreto </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Sal de sódio pentobarbital </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Pletismografia de corpo inteiro (WBP) sistema </td><td> Buxco Systems Research Wilmington, North Carolina </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Canadá </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Microscópio de luz </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, NC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick mancha </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta repetitivo </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

murine model of allergen induced asthma

A asma é uma das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo. 1 Mais de 8% da população dos EUA tem asma, com o aumento da prevalência. 2 Tal como acontece com outras doenças, modelos animais da doença alérgica das vias aéreas facilitar grandemente compreensão da fisiopatologia subjacente, ajudar a identificar potenciais alvos terapêuticos, permitindo testes pré-clínicos de possíveis novas terapias. Modelos de doença alérgica das vias respiratórias foram desenvolvidos em várias espécies animais, mas modelos murinos são particularmente atraentes devido ao baixo custo, disponibilidade, e bem caracterizadas sistemas imunitários desses animais. 3 disponibilidade de uma variedade de estirpes de transgénicos aumenta ainda mais a capacidade de atracção destes modelos. 4 Descrevemos aqui dois modelos murinos de doença alérgica das vias aéreas, tanto a ovalbumina empregando como o antigénio. Após a sensibilização inicial, por injecção intraperitoneal, um modelo emitiu qualquerers o desafio antigénio por nebulização, a outra por entrega por via intratraqueal. Estes dois modelos oferecem vantagens complementares, com cada imitando as principais características da asma humana. 5 As principais características da asma aguda incluem uma resposta das vias aéreas exagerada a estímulos, como metacolina (vias aéreas hiper-responsividade; AHR) e eosinófilos rico inflamação das vias aéreas. Estes são também efeitos proeminentes de desafio alérgeno nos nossos modelos murinos, 5,6 e nós descrevemos técnicas para a sua medição e, assim, avaliar os efeitos da manipulação experimental. Especificamente, descrevem ambas as invasivos 7 e não-invasivo 8 técnicas de medição de hiper-responsividade das vias aéreas, bem como métodos para avaliar a infiltração de células inflamatórias para as vias aéreas e do pulmão. Células das vias respiratórias inflamatórias são recolhidos por lavagem broncoalveolar enquanto pulmão histopatologia é utilizado para avaliar os marcadores de inflamação por todo o órgão. Estestécnicas fornecem ferramentas poderosas para o estudo de asma de maneira que não seria possível em seres humanos.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Nanyang Technological University

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40.0K visualizações.  Emory University and Atlanta VA Medical Center. Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

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A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Imunologia e Infecção

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses and microbial substances that induce innate immune responses. These allergen-associated microbial components play an important role in regulating the development of type 2 inflammatory conditions such as allergic asthma. However, the underlying mechanisms remain largely undefined. The protocol presented here determines the structural characteristics and in vivo activity of allergen-associated immunostimulatory RNA. Specifically, common allergens are examined for the presence of double-stranded RNA (dsRNA) species that can stimulate IFN responses in lungs and restrain&#160;the development of severe lung eosinophilia in a mouse model of HDM-induced allergic asthma. Here, we have included the following three assays: Dot blot to show the dsRNA structures in total RNA isolated from allergens including HDM species, RT-qPCR to measure the activities of HDM RNA in interferon stimulating genes (ISGs) expression in mouse lungs and FACS analysis to determine the effects of HDM RNA on the number of eosinophils in BAL and lung, respectively.

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) often contain microbial substances that activate innate immune responses to regulate allergic inflammation. The protocol presented here demonstrates the identification of dsRNA species in HDM allergens and characterization of their immunogenic activities in modulating eosinophilic lung inflammation.

Identificação e Caracterização de Espécies imunogênicas de RNA em Alérgenos HDM que modulam inflamação pulmonar eosinofílica

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Medicina

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an objective laboratory method that may help to study the CHS reaction in mice, which can be measured and quantified by various tests. To induce CHS, on day "0", mice were sensitized on a previously shaved spot by abdominal skin painting with the hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) in an acetone-ethanol mixture, whereas negative control mice were sham sensitized with vehicle alone-acetone-ethanol mixture. On day "4", the baseline ear thickness was measured with a micrometer prior to the elicitation of CHS (challenge) by painting both ears with diluted TNCB both in the test and control groups. After 24 h, the ear swelling was measured with a micrometer. CHS is an example of a T cell-mediated immune response that causes swelling in inflamed tissue, peaking 24 h after the skin challenge with the same hapten. An increase in ear edema correlated with augmented ear weight, myeloperoxidase (MPO) activity, pro-inflammatory cytokine concentration in the ear extracts, increased thickening of the edematous dermis in the histological examination, and ear vascular permeability. There was also an increase in the concentration of TNP-specific IgG1 antibodies in the sera of the test group when compared with the control mice. Additionally, CHS can be successfully transferred with the CHS-effector cells obtained from donors previously sensitized with TNCB. The CHS-effector cells were administered intravenously into na&#239;ve recipient mice, which were subsequently challenged with the same diluted hapten. Ear swelling was measured with a micrometer 24 h later.

Contact hypersensitivity (CHS) is a murine experimental model of allergic contact dermatitis (ACD). CHS is based on sensitization with reactive hapten by painting the shaved skin of the chest and abdomen, with a subsequent ear skin challenge with a diluted hapten, causing a swelling reaction that is assessed in various ways.

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes methods for the fabrication of the high platform, establishes a rat model of asthma and measures changes in respiratory function using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system.

Acupuntura em um modelo de rato de asma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Imunofluorescência Multicolorida do Tecido Nasal em Modelo de Rato com Rinite Alérgica

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), affecting approximately 10%-20% of the world's population. While immunofluorescence (IF) staining has long been a standard technique for detecting disease-specific protein expression, conventional IF techniques are limited in their ability to detect the expression levels of three or more proteins in the same sample. Consequently, multicolor IF techniques have been developed in recent years, which allow the simultaneous labeling of multiple targets in cells or tissues.
This protocol provides a comprehensive overview of the process for establishing a rat model of AR, obtaining nasal mucosal samples, and the technical procedures for multicolor immunofluorescence. All rats in the AR group exhibited typical symptoms such as sneezing, a runny nose, and an itchy nose, with behavioral observations scoring &#8805;5 points. Hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining revealed increased inflammatory cell counts and disrupted nasal mucosal integrity in the AR group. Multicolor immunofluorescence (mIF) demonstrated increased expression of ROR&#947;t and TICAM-1, while Foxp3 expression decreased in the nasal mucosa tissue of AR rats.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de rinite alérgica com imunofluorescência multicolorida

This protocol describes a multicolor immunofluorescence technique for evaluating the rat model of allergic rhinitis.

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Modelo murino de asma induzida alergénio

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A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Estudar comunidades microbianas

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o

Identificação e Caracterização de Espécies imunogênicas de RNA em Alérgenos HDM que modulam inflamação pulmonar eosinofílica

Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

Acupuntura em um modelo de rato de asma

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido