DOZ é apoiado por uma subvenção concedida à Fundação de Genebra. SN foi apoiado por uma bolsa pós-doutorado da Iniciativa Engenharia de Tecidos Pittsburgh.

1. Isolando derivadas de tecido adiposo células-tronco (ASC) Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Isolar adiposo epididimal e perirenal rato e lavar com solução de Hank estéril tamponada de sal (HBSS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), como descrito anteriormente 6. </li><li> Picar o tecido e transferir 1-2 g em 25 mL de HBSS contendo FBS a 1% para um tubo de 50 mL e centrifugação a 500 g durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Recolher o de flutuação livre camada de tecido adiposo e transferência para 125 mL balão Erlenmeyer e trata-se com 25 mL de colagenase tipo II (200 U / mL) em HBSS durante 45 min a 37 ° C num agitador orbital (125 rpm). </li><li> Cuidadosamente remover a fracção de líquido (abaixo de óleo e da camada adiposo) e filtrar sequencialmente através de um filtro 100-iM e 70 mícrons de nylon de malha. Centrifugar o filtrado a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o supernatant, e lavar a pelete duas vezes com 25 ml de HBSS. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 50 mL de meio de crescimento (Meio MesenPRO RS Basal) suplementado com MesenPRO Suplemento de Crescimento RS, antibiótico-antimicótico (100 U / mL de penicilina G, 100 ug / mL de sulfato de estreptomicina, e 0,25 ug / mL Anfotericina B) , e 2 mM de L-glutamina e as células de pipeta em 2 T75 frascos (25 ml balão /). </li><li> Cultura da ASC em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C (passagem 2-4 ASC são utilizados para todas as experiências). </li></ol> 2. Preparação de microesferas (CSM) Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> CSM são preparados por um processo de emulsificação de água-em-óleo, juntamente com uma técnica de coacervação iónica usando o nosso protocolo anterior 6. Emulsionar uma solução aquosa de quitosano (6 mL de 3% w / v de quitosano em ácido acético 0,5 M) em 100 ml de uma mistura de fase de óleo consistindo de sojaóleo, n-octanol (1:2 v / v) e 5% de sorbitano-mono-oleato de emulsionante (Span 80), utilizando sobrecarga (1700 rpm) e agitação magnética (1000 rpm), simultaneamente, em direcções opostas. Este método de dupla resultará uma mistura que micelas formadas no início antes de reticulação ocorre podem permanecer em solução e não assentam no fundo. Além disso, a barra de agitação magnética SIDA em DE-agregação de quitosano durante micela formação e rigidization. </li><li> A mistura é agitada continuamente durante aproximadamente 1 hora até uma emulsão de água-em-óleo estável é obtido. Reticulação iónica é iniciada com a adição de 1,5 mL de 1% de hidróxido de w / v de potássio em n-octanol min a cada 15 durante 4 h (24 ml no total). </li><li> Depois de se completar a reacção de reticulação, lentamente decantar a fase de óleo da mistura contendo CSM e imediatamente adicionar as esferas a 100 mL de acetona. Lave as esferas com acetona até que a fase de óleo é completamente removido. </li><li> Secam-se as esferas recuperados em um exsicador de vácuo e analyze inalterado. O tamanho médio de partícula CSM, área de superfície por miligrama e da unidade de volume cúbico foi determinada utilizando analisador de tamanho de partícula. </li><li> Para as experiências subsequentes, lavar CSM três vezes com água estéril para remover os sais residuais e esterilizar com álcool absoluto. </li></ol> 3. Determinando o número de grupos amino livres no CSM Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Determinar o número de grupos amino livres presentes na CSM após reticulação iónica usando o ensaio de ácido benzenossulfónico trinitro (TNBS), de Bubins e Ofner 7. Incubar 5 mg de microesferas com 1 mL de 0,5% de solução de TNBS em um tubo de vidro de 50 mL durante 4 h, a 40 ° C e hidrolisar com a adição de 3 mL de HCl 6N a 60 ° C durante 2h. </li><li> Arrefecer as amostras à temperatura ambiente, e extrair os TNBS livres por adição de 5 mL de água desionizada e 10 mL de acetatoéter. </li><li> Aquecer uma alíquota de 5 ml da fase aquosa para 40 ° C num banho de água durante 15 min para evaporar qualquer éter residual, arrefecer até à temperatura ambiente, e diluir com 15 mL de água. </li><li> Medir a absorvância a 345 nm com um espectrofotómetro com solução TNBS sem quitosana como em branco eo quitosano utilizado para a preparação CSM para determinar o número total de grupos amino. Estimar o número de grupos amino livres da MSC em relação ao quitosano. </li></ol> 4. Carregando ASC no CSM Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Equilibrar 5 mg de CSM esterilizado de seção 2,5 em HBSS estéril durante a noite e adicionar um poro tamanho 8 mícrons membrana inserção placa de cultura (24-bem placa). </li><li> Após o CSM se estabeleceram para a membrana, aspirar cuidadosamente os HBSS e adicionam-se 300 uL de meio de crescimento para o interior da inserção e 700 uL de meio de crescimento para the fora da pastilha. </li><li> Ressuspender o ASC na concentração apropriada (1 x 10 4 a 4 x 10 4) em 200 uL de meio de crescimento e de sementes ao longo do CSM dentro do inserto placa de cultura. O volume final de meio de cultura dentro da inserção, após a semeadura, é de 500 uL. </li><li> Incubar a seeded ASC à CSM por 24 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C. </li></ol> 5. Determinação da porcentagem de ASC Carregando e viabilidade celular em CSM Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Após a incubação, recolher o CSM ASC-carregado num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril, sem perturbar as células que migraram para a membrana de inserção. </li><li> Remover o meio residual e adicionar 250 uL de meio de crescimento fresco para o tubo. </li><li> Para cada tubo 25 uL de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]solução (5 mg / mL) e incubar durante 4 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C. </li><li> Após a incubação, o meio de remover, adicionar 250 uL de sulfóxido de dimetilo, e vórtice a mistura durante 2-5 minutos para solubilizar o formazan complexo. </li><li> Centrifugar a CSM em 2700 X g durante 5 min, e determinar a absorvância sobrenadante medida a 570 nm 630 nm, utilizando como referência. </li><li> Determinar o número de células associado com o MSC em relação ao valor de absorvância obtidos a partir de um número conhecido de ASC viável. </li></ol> 6. Caracterizando ASC-CSM-incorporado gel de colágeno Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Mistura ASC-carregado CSM (5 mg contendo ≈ 2 x 10 4 células) com colagénio de tipo 1 (7,5 mg / mL), extraído a partir de tendão da cauda de rato de acordo com o método de Bornstein 8 e fibrilam depois de ajustar o pH para 6,8 utilizando 2 N de NaOH. </li&gt; <li> Adicionar a mistura de colagénio-ASC-CSM fibrilada para uma placa de 12 poços e incubar durante 30 min a uma em 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C. </li><li> Depois de fibrilação completa, incubar os géis de colagénio-ASC-CSM-se até 14 dias, em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C. </li><li> Libertação e migração de células de CSM no gel foram observadas utilizando técnicas de microscopia padrão. </li></ol> 7. Os resultados representativos No presente estudo, nós desenvolvemos uma estratégia in vitro para proporcionar células-tronco de microesferas de quitosano (CSM) em um gel de colagénio andaime. CSM poroso de tamanho uniforme (175-225 um de diâmetro) e composição foram preparados e utilizados como transportadores de células (Figura 2). Após a incubação com a ASC CSM, as células ligado a uma concentração de 2 x 10 4 cells/5mg de MSC. As células foram capazes de espalhar sobre a microesfera, enquanto estende filopodiosnas fendas porosas do microesfera (Figura 3). Uma vez que a célula CSM-carregado foram misturadas com o gel de colagénio, as células imediatamente começou a migrar para os géis (Figura 4). <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> Tabela 1. Vantagens biológicos para o uso de quitosano e de colagénio em um sistema de entrega de células estaminais. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemático que representa a estratégia geral para a utilização dupla de ASC-CSM andaimes de colagénio carregados. Figuras 2, 3 e 4 são anotadas no interior da esquemática para auxiliar com a interpretação das imagens. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática representando o processo de semear as células estaminais para quitosano. O process envolve co-cultura com ASC CSM em um 8 - mM tamanho dos poros da membrana de inserção placa de cultura. Após 24 horas, as microesferas são removidos do inserto e estão prontos para incorporação numa matriz biomaterial. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização morfológica de CSM-carregado com ASC. O painel A representa uma micrografia de luz de ASC-carregado CSM, enquanto o painel B mostra o mesmo campo de visão, sobreposto com uma imagem obtida por microscopia de fluorescência confocal. ASC foram pré-carregado com calceína AM (verde). O painel C mostra uma imagem de uma imagem SEM de uma microesfera descarregado, enquanto o painel D mostra células carregadas no microesfera (asteriscos). A imagem MET em E painel mostra uma secção transversal de uma microesfera descarregado. Uma multidão de poros e fendas estão localizados ao longo da microesfera. Painel F mostra uma microesfera transversalmente com as células (setas) ligado e estendendo filopodia na CREvícios. Ampliações originais: A &amp; B = 70X; C = 500x, D = 2.000 x; E &amp; F = 2.500 x. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> Figura 4. A migração de ASC a partir do CSM para o colagénio tridimensional andaime. Os painéis A e B representam a CSM com células migrando do microesfera e para dentro da matriz de colagénio no dia 3 (A setas,). O painel B mostra uma cultura semelhante depois de 12 dias. Microscopia electrónica de transmissão (TEM) imagens são representadas em C, D e E. Os asteriscos em C e D mostram uma microesfera que tem sido transversalmente com as células de migrar para longe da microesfera (setas). Maior ampliação de painel D está representado na painel E, e mostra filopodia célula ligado às fibrilas de colagénio (inserção). Aumento original: A &amp; B = 100x; C &amp; D = 6.000 x; E = 20.000 x, inset = 150.000 x. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> Figura 5.Esquema representando os usos vastas CSM na medicina regenerativa e entrega da droga.

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	<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+bone,+cartilage,+tendon+and+skeletal+muscle+repair.">Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.</a> Bone. 39, 678-683 (2006).</li><li>Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+strategies+for+adipose+tissue+repair.">Tissue engineering strategies for adipose tissue repair.</a> Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).</li><li>Pountos, I., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+mesenchymal+stem+cells.">Biology of mesenchymal stem cells.</a> Injury. 36, S8-S12 (2005).</li><li>Kim, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+and+its+derivatives+for+tissue+engineering+applications.">Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications.</a> Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).</li><li>Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+chitosan+and+its+derivatives+in+regenerative+medicine.">Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine.</a> J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).</li><li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres.">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).</li><li>Bubnis, W. A., Ofner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid.">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li><li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes.">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li><li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).</li><li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability.">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li><li>Shanmuganathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+chitosan+microspheres+for+doxycycline+delivery.">Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery.</a> Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).</li><li>Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+new+microcapsule+membrane+combining+alginate,+chitosan,+polyethylene+glycol+and+poly-L-lysine+for+cell+transplantation+applications.">Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications.</a> Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).</li><li>Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells:+a+unique+hypoimmunogenic+platform+for+long-term+cellular+therapy.">Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy.</a> FASEB J. 24, 22-31 (2010).</li><li>Zielinski, B. A., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+a+matrix+for+mammalian+cell+encapsulation.">Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation.</a> Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).</li><li>Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Bo&#382;ikov, K., Barli&#231;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Adipose+Tissue+Engineering+with+Adipose-Derived+Stem+Cells+Using+Different+Scaffolds+of+Natural+Origin.">In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin.</a> Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).</li><li>Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-chitosan+complex+coacervation+for+cell+encapsulation:+effect+on+mechanical+properties+and+on+long-term+viability.">Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability.</a> Biopolymers. 82, 570-579 (2006).</li><li>Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/silk+fibroin-based+tissue-engineered+graft+seeded+with+adipose-derived+stem+cells+enhances+nerve+regeneration+in+a+rat+model.">Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).</li><li>Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-chitosan/PLGA-alginate+nanoparticle+blends+as+biodegradable+colloidal+gels+for+seeding+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells.">PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).</li><li>Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor.">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2010).</li><li>Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+biocompatibility+study+of+electrospun+chitosan+microfiber+for+tissue+engineering.">In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).</li><li>Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+channels+containing+spinal+cord-derived+stem/progenitor+cells+for+repair+of+subacute+spinal+cord+injury+in+the+rat.">Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat.</a> Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).</li><li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds.">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32, 57-64 (2011).</li><li>Altman, A. M., Gupta, V., RÃ­os, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+migration+and+mechanics+of+human+adipose-tissue-derived+stem+cells+on+silk+fibroin-chitosan+matrix.">Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix.</a> Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).</li><li>Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Human+adipose-derived+stem+cells+seeded+on+a+silk+fibroin-chitosan+scaffold+enhance+wound+repair+in+a+murine+soft+tissue+injury+model.">IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model.</a> Stem Cells. 27, 250-258 (2009).</li><li>Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+chitosan-gelatin-chondroitin+porous+scaffold+improves+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).</li></ol>

Não há interesses conflitantes financeiros existem. Alerta As opiniões ou afirmações contidas neste documento são as opiniões pessoais dos autores e não devem ser interpretadas como oficial ou refletindo as opiniões do Departamento de Defesa ou o Governo dos EUA. Os autores são funcionários do governo dos EUA, e este trabalho foi elaborado como parte das suas funções oficiais. Todo o trabalho foi apoiado pelo EUA Pesquisa Médica do Exército e do Comando de Material. Este estudo foi realizado ao abrigo de um protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Ética Médica EUA Exército e do Comando de Material Conselho de Revisão Institucional, e de acordo com o protocolo aprovado.

Um grande obstáculo na terapia de células-tronco base é o desenvolvimento de métodos eficientes para a entrega de células para as regiões especificadas para a reparação. Devido ao paciente a variabilidade do paciente, o tipo de tecido, tamanho da lesão e da profundidade, a metodologia de células estaminais entrega deve ser determinada numa base de caso-a-caso. Embora a incorporação de células-tronco dentro de uma matriz e entregá-los para o local da ferida parece ser uma abordagem lógico seguinte para a engenharia de tecidos, algumas dificuldades técnicas permanecem. Isto inclui a capacidade das células incorporados para anexar à matriz e fornecer um biocompatível circundante no qual as células pode anexar, proliferam e restabelecer um microambiente adequado antes anoikis 9-10. Este processo requer que as células upregulate sua maquinaria de remodelação da matriz, um processo que pode demorar dias para realizar antes dos processos celulares desejadas de migração, proliferação e diferenciação das células estaminais. Para contornar esses problemas, temos hav desenvolvido um método para pré-carregar as células estaminais para quitosano antes da sua incorporação em uma matriz apropriada para reparar o tecido danificado. Usando o nosso cross-linking única iónico métodos para preparar as microesferas, o protocolo é capaz de preparar&gt; 90% das microesferas para estar dentro 175-225 um de diâmetro, gerando assim um transportador de tamanho micro excelente para as células. Mais importante ainda, após reticulação, as microesferas permanecem carregados positivamente, que é altamente favorável para a fixação das células. Estas características permitem que as células-tronco de microesferas para anexar rapidamente para o CSM. Uma vez ligados, estes células estaminais microesferas carregadas são estáveis ​​e capazes de atingir arranjos espaciais dentro do andaime, tais como hidrogéis de colagénio, para imitar o tecido lesionado. Em suma, este protocolo fornece um novo método para carregar ASC em CSM e mostra que células na microesferas pode migrar preservando seu fenótipo de células-tronco. O CSM poroso descrito fornecer umamicroambiente excelente para ASC fixação e ainda permitir que as células para migrar na matriz circundante. Resumo: Etapas críticas <ul><li> Use microesferas uniforme em tamanho desde variação no diâmetro influencia directamente área de superfície disponível para a fixação de células por miligrama de microesferas. </li><li> Prepara-se uma cama uniforme de microesferas no interior da inserção de cultura de fixação uniforme óptimo das células para o MSC. </li><li> Assegurar que o volume de meio adicionado ao poço exterior do inserto de cultura de células é maior do que o menisco do interior bem. Tipicamente, uma interior: proporção em volume de 1:2 exterior é apropriado, como o que facilita células associadas à microesferas. </li><li> Distribua o celular carregado microesferas uniformemente dentro do andaime. Se a distribuição de ASC-CSM é muito densa, as células não irá migrar do seu microesferas. </li><li> A quantidade desejada de CSM e distribuiçãobuição densidade é dependente de aplicação e área de tecido lesado. </li></ul> Limitações <ul><li> Este método é limitado à área de superfície total disponível no microesferas. Se um número maior de células é desejada, microesferas mais são necessários para aumentar a área de superfície. </li><li> O processo permite que as células a serem semeadas em às microesferas pré-formado e não se destinam a fins de encapsulação de células. </li><li> As microesferas de quitosano desenvolvido neste processo pode apoiar-dependentes de ancoragem células, mas os tipos de células não outros. </li><li> Uma vez que microesferas de quitosano são desenvolvidas utilizando uma solução de ácido 0,5 M acético, emulsionado em uma mistura de óleo (o óleo de soja: n-octanol) e recuperado utilizando solvente orgânico que não permite activas terapêuticas porções vulneráveis ​​à condição acima mencionado. </li><li> O CSM são destinados principalmente para fornecer células e medicamentos em menor duração do tempo (5-10 dias), devido à sua rápida degradaçãotaxa de, ao contrário dos destinados a disponibilidade de longa duração. </li></ul> Modificações possíveis e versatilidade (Figura 5) <ul><li> Tamanho de microsferas podem ser modificados para alterar a área da superfície total. Por exemplo, o tamanho de microsferas pode ser reduzida para aumentar a área da superfície / mg de CSM, que por sua vez irá aumentar a área de superfície total eo número de células que podem ser anexados à microesferas, resultando em um aumento da célula de carga por microesfera. </li><li> Microesferas de quitosano pode ser usado como um transportador para carregar outros tipos de células (células endoteliais, pericitos, fibroblastos, etc.) </li><li> Cell-carregados esferas (ambos os tipos simples ou múltiplo de células) pode ser embutido dentro de locais específicos de andaimes. Esta estratégia vai ajudar na construção de multicelulares tecido de andaimes para a regeneração dos tecidos. </li><li> Além disso a entrega de células, as microsferas também podem ser utilizados para entregar drogas terapêuticas (isto é, os factores de crescimento, indutores de diferenciação, e / ou antibióticos). Estas microesferas droga carregada pode também ser utilizado em combinação com células de microesferas carregadas dentro de um andaime para melhorar a cura ea processos de regeneração. </li></ul> Solução de problemas <ul><li> Após a preparação do CSM, se uma grande variação no tamanho ocorre, em seguida, um número de itens podem ser ajustados para se obter o tamanho desejado CSM 11. <ul type="circle"><li> Viscosidade da solução de quitosano. Estoque preparada de fresco é preferido manter a solução sob viscosidade constante de lote para lote preparação </li><li> Ajustar o volume de agente tensioactivo (Span 80) usado para preparar a emulsão. </li><li> Assegurar a velocidade do agitador suspenso permanece constante durante todo o processo (a velocidade pode variar com flutuações de energia elétrica </li><li> Durante a agitação ar proporcionadora atmosférica pode causar turbulência e tamanho variação (isto pode ser evitado por KEep ondulação do líquido, a qual faz durante a agitação, apenas sobre as lâminas do agitador suspenso. </li></ul></li><li> Para garantir um carregamento de células óptima das microesferas, um ensaio MTT calorimétrico pode ser executada. Isto vai dar uma estimativa do número de células viáveis ​​carregado por miligrama de microesferas. </li><li> Evitar aglomeração de célula-microesferas carregadas suspendendo-os num pequeno volume de meio de cultura de células antes de misturar-las dentro de um andaime tal como um hidrogel de colagénio. </li></ul>

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Hanks BalancedSalt Solução (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14175 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Colagenase do Tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6685 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 70-iM de nylon de malha de filtro </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 100-iM de nylon de malha de filtro </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> MesenPRO Sistema Meio de Crescimento </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> T75 frasco de cultura de tecidos </td><td> BD Biosciences </td><td> 137787 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Chitosan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448869 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320099 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> N-octanol </td><td> Acros Organics </td><td> 150630025 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Sorbitano-mono-oleato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6760 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Hidróxido de Potássio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1767 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Fisher Scientific </td><td> L-4859 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270741 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Trinitro benzenossulfónico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2297 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320331 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Éter etílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472-484 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 8 m de tecido Placa Insere Cultura </td><td> BD Biosciences </td><td> 353097 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de microcentrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-408-129 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Reagente MTT </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8779 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Qtracker celular Labeling Kit (Q rastreador 655) </td><td> Sondas moleculares </td><td> Q2502PMP </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Colágeno tipo 1 </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Hidróxido de Sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> 12-Bem Cultura Pratos Tecido </td><td> BD Biosciences </td><td> 353043 </td><td> Consumível </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> New Brunswick Scienctific </td><td> C24 </td><td> Equipamento </td&gt; </tr><tr><td> Incubadora de CO umidificado com Air-5 2% </td><td> Thermo Scientific </td><td> Modelo 370 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Agitador </td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Agitador Magnético </td><td> Corning </td><td> PC-210 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Exsicador de vácuo </td><td> - </td><td> - </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Analisador de Tamanho de Partícula </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> Fisher Scientific </td><td> Isotemp210 </td><td> Equipamento </td&gt; </tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Beckman </td><td> Beckman Coulter Espectrofotômetro DU800UV/Visible </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Leitora </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectramax M2 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Luz / microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV-500 Laser Scanning microscópio confocal </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio Eletrônico de Varredura </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> Leo 435 VP </td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio eletrônico de transmissão </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> Equipamento </td></tr></tbody></table>

constructing a collagen hydrogel for the delivery of stem cell-loaded chitosan microspheres

As células estaminais multipotenciais têm sido mostrados para ser extremamente útil no campo da medicina regenerativa 1-3. No entanto, a fim de utilizar essas células eficazmente para a regeneração de tecidos, um número de variáveis ​​devem ser tidos em conta. Estas variáveis ​​incluem: o volume total e área de superfície do local de implantação, as propriedades mecânicas do tecido e do microambiente do tecido, que inclui a quantidade de vascularização e os componentes da matriz extracelular. Portanto, os materiais que estão sendo utilizados para entregar estas células deve ser biocompatível com uma composição química definida, mantendo uma força mecânica que imita o tecido hospedeiro. Estes materiais também deve ser permeável ao oxigénio e nutrientes para proporcionar um microambiente favorável para as células para anexar e proliferar. A quitosana, um polissacárido catiónico com excelente biocompatibilidade, pode ser facilmente modificada quimicamente e tem uma elevada afinidade para se ligarem a in vivo macromolecules 4-5. A quitosana imita a porção de glicosaminoglicano da matriz extracelular, permitindo-lhe funcionar como um substrato para a migração de adesão celular, e proliferação. Neste estudo, utilizam quitosano na forma de microesferas para entregar células-tronco adiposas (ASC) em uma base de colagénio tridimensional andaime 6. Uma razão de célula-a-microesfera ideal foi determinada com respeito ao tempo de incubação e densidade celular para atingir o número máximo de células que poderiam ser carregados. Uma vez ASC são semeados no microesferas de quitosano (CSM), eles são incorporados em um andaime de colagénio e pode ser mantido em cultura durante períodos prolongados. Em resumo, este estudo fornece um método para entregar precisamente células-tronco dentro de um andaime tridimensional biomaterial.

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Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Um grande obstáculo em terapias com células-tronco atuais é determinar o método mais eficaz para entregar essas células para tecidos do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método de entrega de quitosana-base que é eficiente e simples na abordagem, ao mesmo tempo permitindo que as células-tronco adiposas para manter a sua multipotency.

Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

constructing-collagen-hydrogel-for-delivery-stem-cell-loaded-chitosan

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K visualizações.  United States Army Institute of Surgical Research. Um grande obstáculo em terapias com células-tronco atuais é determinar o método mais eficaz para entregar essas células para tecidos do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método de entrega de quitosana-base que é eficiente e simples na abordagem, ao mesmo tempo permitindo que as células-tronco adiposas para manter a sua multipotency.

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Bioengenharia

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imagiologia desnaturadas colágeno Vertentes<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via foto desencadeada Hibridização do Caged Colágeno mimético Peptídeos

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Desenvolvimento de Amelogenina-quitosana Hidrogel para<em&gt; In Vitro</em&gt; Esmalte Regrowth Com uma interface Densa

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant exogenous molecular probes into cells. This work reports a microfluidic electroporation platform capable of performing multiple molecule delivery to mammalian cells with precise and molecular-dependent parameter control. The system&#8217;s ability to isolate cells with uniform size distribution allows for less variation in electroporation efficiency per given electric field strength; hence enhanced sample viability. Moreover, its process visualization feature allows for observation of the fluorescent molecular uptake process in real-time, which permits prompt molecular delivery parameter adjustments in situ for efficiency enhancement. To show the vast capabilities of the reported platform, macromolecules with different sizes and electrical charges (e.g., Dextran with MW of 3,000 and 70,000 Da) were delivered to metastatic breast cancer cells with high delivery efficiencies (&#62;70%) for all tested molecules. The developed platform has proven its potential for use in the expansion of research fields where on-chip electroporation techniques can be beneficial.

A microfluidic vortex assisted electroporation platform was developed for sequential delivery of multiple molecules into identical cell populations with precise and independent dosage control. The system&#8217;s size based target cell purification step preceding electroporation aided to enhance molecular delivery efficiency and processed cell viability.

Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Um Supramolecular hidrogel injetável e carregado com a droga para a injeção local por cateter no coração de porco

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...