Agradecemos a A. e B. Shea Tager por sua colaboração em curso, e para fornecer o tecido pulmonar utilizado para fins de demonstração aqui. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder HL-092961. Este trabalho foi realizado em parte do Centro de Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura, que é apoiado pela National Science Foundation sob NSF prêmio ECS-0335765. CNS é parte da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Harvard.

1. Faixa de tecido de pulmão Preparação <ol><li> Tecido pulmonar é altamente compatível e difícil de cortar em tiras para a caracterização AFM. Para transitoriamente estabilizar a estrutura do pulmão para o corte, inflar os pulmões do rato isolado intratraqueal com 50 ml / kg de peso corporal de 2% gel baixo ponto de agarose (preparado em PBS) aquecido a 37 ° C. Amarrar a traquéia e os pulmões inflados fresco em um banho de PBS a 4 ° C por 60 minutos. O gel de agarose vai endurecer e nos espaços gentilmente estabilizar a estrutura do pulmão durante este intervalo de 5. Maiores concentrações de agarose, de 3-4%, ou seja, podem ser usados ​​para aumentar ainda mais a estabilização de tecidos para o corte. </li><li> Corte a agarose estabilizado tecido pulmonar do rato com uma navalha ou lâmina de bisturi em tiras de 5 x 5 mm de comprimento e largura e 400 m de espessura, em seguida, lavar as tiras em um banho de PBS pré-aquecido a 37 ° C usando um de 100 ml copo de vidro em uma bancada placa aquecida mexa por 5 minutos para remover agarose residual. Para excluir grandes vias aéreas e vasos, cortar tiras de regiões distantes dos principais subpleural-tronco brônquios. Se as vias aéreas e navios de grande porte estão a ser trabalhada, cortar tiras de tecido pulmonar mais proximal ao tronco principal brônquios. </li></ol> 2. AFM Microindentation e imagens de fluorescência <ol><li> Para isolar áreas de interesse para microindentation AFM, o tecido pode ser visualizado por microscopia de contraste de fase, ou imunocoradas e visualizados por microscopia de fluorescência. Para a imunocoloração, bloco tiras de tecido com 5% de soro a partir da fonte do anticorpo secundário desejado (em PBS) por 2 horas sem fixação ou permeabilização à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as tiras de tecido com o anticorpo primário apropriado (por exemplo, de coelho anti-colágeno-I para visualizar colágeno intersticial (1:250 diluição), de coelho anti-laminina (1:250 diluição) para visualizar membrana basal) em um poço de uma placa de 12 poços em um rocker, agitando suavemente por 1 hora, lave amostra 3 vezes por 5 minutos cada com PBS, seguido pelo anticorpo secundário apropriado conjugado com etiqueta fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor 546 cabra anticorpo anti-coelho secundário (1:250 diluição)) para 1 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lave as tiras de tecido extensivamente com PBS e armazene em PBS a 4 ° C </li><li> Imediatamente antes da caracterização AFM, anexar a tira de tecido para um poli-l-lisina revestido lamínula de 15 mm, levantando as lamelas de baixo do tecido flutuante, certificando-se a tira de tecido se espalha uniformemente sobre a superfície lamela, se necessário sanduíche, a faixa com um pano limpo segundo, não revestido lamela e aplicar pressão suave para auxiliar na fixação de tecidos para a lamela poli-l-lisina-revestido. </li><li> Calibrar o sistema de AFM seguir instruções do fabricante antes de cada rodada de experimentos microindentation. Determinar dois parâmetros críticos: 1) Primavera do cantilever constante utilizando o método de flutuação térmica no ar 6, e, 2) a sensibilidade de deflexão do cantilever, que é um parâmetro usado para dimensionar o sinal de saída fotodiodo para a distância real cantilever deflexão, Δd. Calibrar a sensibilidade de deflexão pela obtenção de uma curva de força-deslocamento padrão em PBS numa lâmina de vidro limpo, então calcular a inclinação da curva força-deslocamento (Fig.1b). Na medição da curva força-deslocamento, a ponta do AFM é estendida e retraída em direção da superfície da amostra em um único local (sem rastering em direções XY), com a deflexão do cantilever, Δd, monitorizada como uma função de ponta de deslocamento, Δz . </li></ol> Recomendamos a utilização de um silício cantilever triângulo nitreto com a 5 mícrons de diâmetro esférico borosilicato ponta (Novascan). Usando sondas AFM com uma fonte constante de 0,06 N / m, temos mecanicamente caracterizada materiais macios, com módulos de cisalhamento que mede de 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Limpe a superfície inferior da lamela amostra com papel de tecido, prenda-a com uma lâmina de vidro padrão com graxa de vácuo, montar a lâmina de vidro no palco amostra AFM, e cobrir o tecido com 500 mL de PBS (temperatura ambiente). </li><li> Definir o microscópio para visualização olho peças para alinhar a ponta do AFM no centro do campo de visão, ajustando o estágio da amostra do microscópio. Escolha uma área de interesse no tecido movendo o estágio amostra AFM, em seguida, mudar para o CCD de câmera para gravar imagens de contraste de fase e / ou imagens de fluorescência do tecido, como desejado. </li><li> Realizar operação padrão engajamento AFM, movendo a ponta do AFM lentamente para baixo até que esteja em contato com a amostra. </li><li> Caracterização precisa microindentation AFM de amostras moles requer profundidades recuo pequeno para evitar grandes cepas locais que invalida o modelo de Hertz utilizado para o cálculo módulo de elasticidade. Para evitar grandes deformações, execute o recuo no modo de disparo, definindo a deflexão máxima cantilever (ponto gatilho) a 500 nm. Este limite de deflexão irá conter oforça de recuo máximo para menos de 30 nN (F = primavera cantilever deslocamento * constante, ou F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> A velocidade de recuo deve ser selecionado para ser suficientemente lento para explorar as propriedades elásticas em vez viscoelástico da amostra macio 7. A faixa de velocidade de 2-20 mM por segundo é adequado para o tecido pulmonar. <ol start="10"><li> Para uma única medição de uma área de interesse, mover a sonda de AFM para o local de interesse e realizar um recorte único para coletar uma curva força-deslocamento padrão (a sonda se move apenas na direção Z, sem varredura XY). </li><li> Para mapeamento automatizado de uma região de interesse, mude para Força-mode Map, selecione o tamanho da digitalização e pontos de amostra dentro da área selecionada. Em Força-Map modo, o rasters ponta do AFM em toda a superfície da amostra entre os movimentos de recuo, e coleta individuais curvas força-deslocamento em cada ponto em uma grade de amostragem definida. Mais pontos de amostragem irá proporcionar maior resolução espacial, mas prolongar o tempo necessário para o mapeamento. Nós achamos prático usar uma grade de 16 x amostra de 16 para mapear uma área de 80 x 80 mícrons a uma velocidade de recuo de 20 mM por segundo, que pode ser concluído em aproximadamente 10 minutos. </li></ol> 3. AFM extração de dados <ol><li> Para calcular o módulo de Young, o traçado da curva força-deslocamento para o modelo de Hertz indentação esférica utilizando mínimos quadrados não-linear montagem curva 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Equação 1" /> onde F = k c * Δ d, é a força para dobrar o cantilever, k c é a mola cantilever constante, R é raio da ponta esfera, δ = Δ z - Δ d é de recuo e υ é a proporção da amostra Poisson (υ = 0,4 para o tecido pulmonar 9). </li><li> Para avaliar a qualidade do ajuste, calcule o valor SSR, ou a soma dos quadrados da diferença entre os dados e os valores de ajuste, durante o ajuste de curva não-linear. Eliminar as medições não confiáveis ​​ou não-interpretável, descartando dados &quot;ruins&quot; as curvas com valores de SSR grande. </li><li> Se desejar, converter módulo de elasticidade (E) para módulo de cisalhamento (G), usando a relação E = 2 x (1 + υ) x G. Para visualizar padrões espaciais de rigidez coletados em Força-mode Map, os dados do gráfico de módulo no contorno mapas (por exemplo, 16 x 16 grade de amostragem cobrindo uma área de 80 x 80 mm). </li><li> Para processar uma grande quantidade de dados da curva de força, um algoritmo personalizado pode ser escrito para ajustar automaticamente as curvas força-deslocamento, o extrato de módulos e / ou elastographs trama usando os mesmos procedimentos e parâmetros, conforme descrito em 3.2 e 3.3 (por exemplo, Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 (A) Esquema de AFM microindentation de uma amostra suave em um substrato rígido usando uma sonda esférica (Reproduzido com permissão de Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Representante curva força-deslocamento coletados a partir de uma lâmina de vidro limpa em PBS para determinar a sensibilidade de deflexão do cantilever. (C) Representante curvas força-deslocamento coletados de moles (azul) e rígida (vermelho) amostras mostrando os parâmetros correspondentes a partir de (A). 4. Resultados representativos: Figura 2A mostra uma faixa parênquima pulmonar anexado em poli-l-lisina lamela revestido em PBS com uma sonda de AFM no lugar diretamente acima da região de interesse e pronto para o mapeamento microindentation. Figura 2B mostra que no tecido adequadamente cortadas e coradas, a micro-arquitetura alveolar do parênquima pulmonar está bem preservada, como pode ser observado através da coloração de imunofluorescência para laminina componente da membrana do porão sem fixação ou de permeabilização. A Figura 2 mostra a coloração CD de imunofluorescência para colágeno I em fresco nos pulmões de camundongos unfixed colhidas previamente tratados com PBS (Fig. 2C), ou tratados com bleomicina (Fig. 2D) para induzir a fibrose 10. Figura 3A mostra amostragem às forças de deslocamento de parcelas obtidas microindentation AFM. Com a mesma força aplicada, AFM ponta gera um grande recuo em uma região moles (linha azul), resultando em um relativamente &quot;flat&quot; curva de força-deslocamento versus um recuo pequeno e um &quot;steep&quot; curva de força-deslocamento para uma região mais aguerrida ( linha vermelha). A fim de obter curvas força limpo, depois de cada reentrância a ponta do AFM precisa ser retraído completamente da superfície da amostra e livre de contato antes do recuo seguinte. Este estado contato livre corresponde à região plana da curva na Figura 3A, onde a ponta traduz sem deflexão cantilever. Figura 3B mostra uma curva típica falsa sem uma região plana que ocorre quando a ponta não está completamente retraído a partir da superfície da amostra (amostra macio por exemplo, umttaches a ponta) o que torna impossível determinar o ponto de contato. Se a ponta é completamente preso em amostra suave, a curva pode parecer como mostrado na Figura 3C, sem deflexão clara, mas o ruído pequeno. A Figura 4 mostra dados de módulo de cisalhamento extraído de força-deslocamento curvas exibidas espacialmente como mapas rigidez (elastographs), as escalas onde a cor com o módulo de cisalhamento. Elastographs demonstram diferenças marcantes na faixa e distribuição de módulo de cisalhamento no tecido normal (Fig. 4A) e fibrose (Fig. 4B) parênquima pulmonar, e grandes variações espaciais no módulo de cisalhamento, especialmente dentro da amostra de pulmão fibrótico. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Micrografia contraste de fase mostrando uma sonda de AFM com um rato strip parênquima pulmonar. Barra de escala, 50 mm. (B) imunocoloração de laminina no tecido normal do mouse pulmão mostrando a micro-arquitetura alveolar de parênquima pulmonar normal. Caixa branca indica típico 80-by-80μm área de mapeamento elasticidade. Barra de escala: 20 mM. (C e D) imunocoloração de colágeno I em solução salina (C) e bleomicina (D) tratados rato parênquima pulmonar. Barras de escala, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (A) Representante interpretável curvas força-deslocamento coletados de solução salina (azul) e tratados com bleomicina (vermelho) do mouse parênquima pulmonar, respectivamente. Linhas pretas são o melhor ajuste resultante do modelo Hertz esférica e são rotulados com os seus correspondentes calculados Young moduli. (B, C) Representante un-interpretável curvas força-deslocamento. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Elastographs Representante coletados de solução salina (A) e tratados com bleomicina (B) do mouse parênquima pulmonar. As barras coloridas indicam módulo de cisalhamento em kilopascals. Rótulos dos eixos indicam escala espacial em micrômetros. Barra de escala: 20 mM

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Não há conflitos de interesse declarados.

Caracterização mecânica de tecido pulmonar usando microindentation AFM oferece resolução espacial sem precedentes (Fig. 4), proporcionando uma perspectiva única sobre as variações microescala na rigidez do tecido. Como exemplo de sua utilidade, anterior macro-escala medidas em tiras de tecido normal e fibrótica pulmonar indicaram um aumento de 2 a 3 vezes aproximado em elastância com fibrose 11,12. Em contraste, microindentation AFM revela que enrijecimento dos tecidos é extremamente localizada, com algumas regiões apresentando até ~ aumenta 30 vezes no módulo de cisalhamento acima da média observada no tecido pulmonar normal 10. Como a rigidez da matriz é agora conhecido por influenciam criticamente a função das células, estas medições locais fornecem parâmetros de valor inestimável para melhorar a biofidelity de estudo de cultura celular de células do pulmão. Várias questões práticas surgem com o uso de finas tiras de tecido pulmonar. As superfícies das tiras não são perfeitamente planas, como o perfil do tecido segue a arquitetura dos alvéolos subjacentes. O sistema ajusta automaticamente a posição AFM ponta na direção Z, durante o recuo quando a amostra variação da altura da superfície é menor do que 15 mícrons para ajudar a superar este desafio. As medições são feitas em temperatura ambiente, e não 37 ° C, por isso os desvios nas propriedades mecânicas causadas por essa variação de temperatura não pode ser avaliado, ainda que seria esperado a ser menor. A influência da arquitetura da parede alveolar subjacente sobre observado propriedades mecânicas é difícil determinar com a configuração atual microscopia de luz. Por exemplo, seria desejável para determinar se as paredes alveolares apresentam anisotropia e diferentes propriedades mecânicas quando recuado em direções alinhadas com ou transversal ao plano da parede. No entanto, os espécimes atuais são grossas e do sistema de imagem não tem capacidades 3D, portanto, não é possível determinar a orientação da parede alveolar locais em cada ponto de contato. Finalmente, a influência de constituintes celulares na medida propriedades mecânicas continua a ser totalmente elucidado. Nos métodos detalhados aqui, não são feitos esforços para remover especificamente constituintes celulares do tecido. No entanto, as células presentes na superfície disponível para o recuo é pouco provável que seja viável, dado o tempo decorrido desde a colheita de tecidos e da necessidade de cortar o tecido para ter acesso aos alvéolos. Experimentos específicos para remover as células, ou matrizes de repovoar com células viáveis, e avaliar as alterações resultantes da rigidez do tecido parece garantido. Porque o tecido unfixed fresca é necessária para estas medições, o tempo decorrido desde a colheita de tecidos para a medição deve ser minimizado e as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar alterações nas propriedades mecânicas. Atenção especial deve ser dada sempre que tiras de tecido são transferidos entre recipientes durante a lavagem ou coloração de modo que um mínimo de distorção ou dano é gerado. AFM para aplicação no estado líquido, é um passo crucial para cortar o tecido o mais plano possível e imobilizar a amostra sobre a lamínula de apoio. Se disponível, uma máquina automática de corte tal como um cortador de tecidos vibratome ou pode ser usado para cortar fatias de espessura altamente uniforme. É importante anexar tiras de tecido imediatamente antes das medidas AFM e minimizar o tempo decorrido para medições AFM como a amostra acabará por retirar do lamínulas. Uma observação útil é que tiras maiores parecem atribuir mais estável para cobrir escorrega e permanecer no local por períodos mais longos do que em PBS tiras menores. Microindentation AFM pode caracterizar amostras que abrangem uma ampla gama de 100 Pa a 50 kPa (módulo de cisalhamento) ao usar um padrão de 0,06 N / m cantilever com uma ponta de 5 mm de diâmetro esférico. Esse intervalo pode ser expandida usando sondas com constantes primavera diferente; sondas AFM com pontas de vidro esférico variando 0,6-12 m de diâmetro e primavera constantes variando de 0,01 e 0,58 N / m estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Novascan) e comumente utilizado 3. Com uma ponta esférica 5 mm, a área de contato entre a ponta teórica e tecido é de cerca de 5-9 mM 2 para o recuo 400-700 nm (Fig. 1A). Dicas menores ou maiores podem ser usados ​​para fornecer escalas menores ou maiores de resolução espacial. Dicas piramidal também têm sido utilizados na AFM microindentation 13-16, fornecendo áreas menores contato e assim aumentar a resolução espacial no mapeamento, embora ajuste dos dados é mais complexo para esta geometria da ponta. Várias limitações para este método deve ser observado. O pulmão tem sido tradicionalmente caracterizada mecanicamente não-invasiva, por exemplo, usando análise de pressão-volume 17 ou soco recuo de toda pulmões 19,20. Métodos invasivos, como a descrita aqui alterar a arquitetura pulmonar em aspectos importantes, devido à perda da int ar-líquidoerface que normalmente existe no pulmão cheio de ar ea perda de pré-esforço que mantém a inflação pulmonar parcial sobre o relaxamento dos músculos respiratórios. Estas limitações são comuns a todas as medições feitas em tiras de tecido pulmonar 18. Notavelmente, entretanto, a rigidez média medida no parênquima do tecido pulmonar normal (módulo de cisalhamento ~ 0,5 kPa) não diferem substancialmente das estimativas com base no soco recuo de pulmões intactos em volumes descansando 19,20. Enquanto o tecido pulmonar é conhecido por apresentar não-linear com rigidez a deformação crescente, não é possível testar de forma rigorosa se esta propriedade persistir até a escala micro, com os métodos empregados aqui. O modelo de Hertz assume homogeneidade da amostra. No entanto, a maioria dos materiais biológicos, incluindo parênquima pulmonar, são cada vez mais heterogénea a diminuir escalas espaciais. Heterogeneidade da amostra pode resultar em artefatos como variação do módulo de Young, dependendo da profundidade de indentação, ou seja, dependendo da camada ou componente que está deformando. A heterogeneidade no plano xy pode ser limitada por escolher cuidadosamente o tamanho da ponta esférica apropriado, dependendo da microestrutura do biomaterial, tal como proposto por Dimitriadis EK et al. 8 É muito mais difícil de prever ou corrigir o erro do modelo Hertz devido ao material heterogeneidade na direção z. Azeloglu et al. propôs recentemente um modelo híbrido computacional para caracterizar as propriedades elásticas do substrato heterogêneo com discreta inclusões embutidos 21. A nova técnica fornece um meio potencial para calcular propriedades inclusão de materiais heterogêneos superar as limitações da análise hertzianas. O modelo de Hertz também assume comportamento elástico absoluto, enquanto que materiais biológicos normalmente exibem comportamentos dependentes do tempo viscoelástico. A caracterização viscoelástica cheio de tecido pode ser obtida através da variação da velocidade de recuo usadas. Importante, testes de macro-escala anterior mecânicas do tecido pulmonar normal e fibrótico demonstra a dependência fraca frequência das propriedades mecânicas do tecido pulmonar e preservação das diferenças entre as propriedades do tecido normal e fibrótica mecânica em todas as freqüências testadas 11. Estas descobertas sugerem fortemente que a medição de propriedades mecânicas utilizando uma velocidade única, com recuo AFM capta um aspecto essencial das mudanças nas propriedades mecânicas do tecido que acompanham fibrose. O coeficiente de Poisson de 0,4 para tecido pulmonar utilizado neste trabalho é de uma medida macroscópica 9. Infelizmente, o coeficiente de Poisson em micro-escala e as alterações sob condição da doença não estão disponíveis na literatura. Como alternativas para E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (indicado a constante elástica k) 22 pode ser calculado a partir microindentation AFM e relatados quando o coeficiente de Poisson é desconhecida. Para a maioria dos biomateriais coeficiente de Poisson está na faixa de 0,4-0,5 devido ao seu alto teor de água. Dentro da faixa de 0,3-0,5, o fator 1 / (1-υ 2) varia apenas 1,10-1,33, de modo que variações razoáveis ​​em relação ao de Poisson exercem apenas efeitos modestos sobre o módulo relatados. O aumento no módulo de cisalhamento que relatório para relação tecido fibrótico ao tecido normal é várias vezes em magnitude, o que implica que os erros associados a variações no coeficiente de Poisson são relativos menores para as mudanças nas propriedades mecânicas observadas. O algoritmo de reais e código que pode ser utilizado para a análise da força-deslocamento de dados está sujeito à condição de aplicação específica e as características subseqüentes das diversas populações de força-deslocamento curvas. Se uma análise mais sofisticada é de interesse, pode-se consultar o trabalho de Lin et al. 23. Os autores compilaram uma série de estratégias sinérgicas em um algoritmo que supera muitas das complicações que já impedido os esforços para automatizar a montagem de modelos de dados Hertz recuo. Várias outras áreas estão disponíveis para desenvolvimento e exploração deste método. Nos casos em que alguém está interessado em visualizar as paredes alveolares sem rotulagem de anticorpos, ambos elastina e colágeno pode ser visualizado a partir de seu sinal autofluorescent no espectro verde. Por outro lado, uma melhor imagem, usando cortes mais finos tecidos, técnicas de imagem 3D, ou ambos, poderão aumentar a capacidade de correlacionar arquitetura do tecido subjacente com propriedades mecânicas. Embora os métodos atuais permitem coloração e visualização de componentes da matriz extracelular, como colágeno e laminina, esforços adicionais poderiam ser destinadas a coloração marcadores de superfície celular para identificar populações de células específicas e de caracterizar o microambiente mecânica nas proximidades dessas populações. Alternatively, o tecido poderia ser colhida a partir de camundongos expressando-fluorescente etiquetados marcadores de linhagem de células ou proteínas específicas para perseguir o mesmo objetivo. Finalmente, o método detalhado aqui aparece bem colocada para caracterizar outras características anatômicas do pulmão, tais como vasos que remodelar na hipertensão, e das vias aéreas que remodelar na asma. Com base em seu estado atual de desenvolvimento e potencial para reforçar ainda mais, microindentation AFM aparece pronta para produzir insights valiosos sobre as mudanças na rigidez do tecido que acompanham a progressão da doença no pulmão, e será sem dúvida de valor na caracterização de alterações espaciais e temporais na rigidez de uma variedade de outros tecidos moles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> AFM ponta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micron borosilicato talão, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-Lisina lamínulas </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 milímetros rodada No.1 de vidro </td></tr><tr><td> Agarose, Temperatura Gelificação Baixo </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-colágeno I (Rb PAB) de anticorpos </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anticorpo anti-coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Rigidez da matriz influencia fortemente o crescimento, diferenciação e função de células aderentes 1-3. Na escala macro a rigidez dos tecidos e órgãos dentro do corpo humano vão várias ordens de magnitude 4. Muito menos se sabe sobre como a rigidez varia espacialmente dentro dos tecidos, e que o escopo ea escala espacial de mudanças nos processos de rigidez são doenças que resultam na remodelação do tecido. Para entender melhor como as mudanças na matriz de rigidez contribuem para a fisiologia celular na saúde e na doença, a medida da rigidez do tecido obtido em uma escala espaciais relevantes para células residentes são necessários. Isto é particularmente verdadeiro para o pulmão, um tecido altamente compatível e elástica em que a remodelação da matriz é uma característica proeminente em doenças como asma, enfisema, hipertensão e fibrose. Para caracterizar o ambiente local mecânica do parênquima pulmonar em uma escala espaciais relevantes para células residentes, temos desenvolvido métodos para medir diretamente as propriedades locais elástica do tecido pulmonar fresco murino usando microscopia de força atômica microindentation (AFM). Com a escolha adequada de AFM indentor, cantilever, e profundidade de indentação, estes métodos permitem medições do módulo de cisalhamento locais tecido em paralelo com contraste de fase e imagens de fluorescência da região de interesse. Amostragem sistemática de tiras de tecido fornece mapas das propriedades mecânicas dos tecidos que revelam locais variações espaciais no módulo de cisalhamento. Correlações entre propriedades mecânicas e características anatômicas subjacentes e patológicos ilustrar como a rigidez varia de acordo com deposição de matriz na fibrose. Estes métodos podem ser alargada a outros tecidos moles e processos da doença para revelar como as propriedades mecânicas dos tecidos locais variam no espaço e progressão da doença.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K visualizações.  Harvard School of Public Health. A rigidez da matriz extracelular influencia fortemente os comportamentos múltiplo de células aderentes. Rigidez da matriz varia espacialmente ao longo de um tecido, e sofre modificação nas condições de várias doenças. Aqui nós desenvolvemos métodos para caracterizar as variações espaciais na rigidez do tecido normal e pulmão fibrótico do mouse usando microindentation microscopia de força atômica.

Vídeo: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Biologia

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...