Ringraziamo Tager A. e B. Shea per la collaborazione in corso, e per aver fornito il tessuto polmonare utilizzati a scopo dimostrativo qui. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concedere HL-092961. Questo lavoro è stato eseguito in parte presso il Centro per i sistemi su scala nanometrica (CNS), membro della Rete Nazionale Infrastrutture Nanotechnology, che è sostenuta dalla National Science Foundation sotto premio NSF ECS-0335765. SNC è parte della Facoltà delle Arti e delle Scienze all&#39;Università di Harvard.

1. Preparazione Striscia di tessuto polmonare <ol><li> Tessuto polmonare è altamente compatibile e difficile da tagliare a strisce per la caratterizzazione AFM. Per stabilizzare temporaneamente la struttura del polmone per il taglio, gonfiare i polmoni del mouse isolato intratracheally con 50 ml / kg di peso corporeo del 2% a basso punto di gel di agarosio (preparato in PBS) riscaldato a 37 ° C. Legare la trachea e raffreddare i polmoni gonfiati in un bagno di PBS a 4 ° C per 60 minuti. Il gel di agarosio e si irrigidiscono in spazi aerei per stabilizzare delicatamente la struttura dei polmoni durante questo intervallo 5. Concentrazioni più elevate di agarosio, ovvero il 3-4%, può essere utilizzata per migliorare ulteriormente la stabilizzazione dei tessuti per il taglio. </li><li> Tagliare il agarosio stabilizzato tessuto polmonare mouse con un rasoio o bisturi in strisce di 5 x 5 mm di lunghezza e larghezza e 400 micron di spessore, poi lavare le strisce in un bagno PBS pre-riscaldato a 37 ° C con una da 100 ml bicchiere di vetro su una panchina-top piastra mescolare riscaldato per 5 minuti per rimuovere residui di agarosio. Per escludere le grandi vie aeree e dei vasi, tagliare le strisce subpleuriche da regioni lontane dalle principali bronchi. Se vie aeree ed i vasi di grandi dimensioni devono essere ripreso, tagliare le strisce di tessuto polmonare più prossimale al principale bronchi. </li></ol> 2. AFM micropenetrazione e imaging di fluorescenza <ol><li> Per isolare le aree di interesse per micropenetrazione AFM, il tessuto può essere visualizzata mediante microscopia a contrasto di fase, o immunoistochimica e visualizzati al microscopio a fluorescenza. Per immunostaining, blocco strisce di tessuto con 5% di siero dalla sorgente dell&#39;anticorpo secondario desiderato (in PBS) per 2 ore senza fissazione o permeabilizzazione a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la striscia di tessuto con adeguate anticorpo primario (ad esempio di coniglio anti-collagene I per visualizzare collagene interstiziale (diluizione 1:250), di coniglio anti-laminina (diluizione 1:250) per visualizzare membrana basale) in un pozzetto di una 12-pozzetti su un rocker agitando delicatamente per 1 ora, lavare campione 3 volte per 5 minuti ciascuno con PBS, seguita da opportune anticorpo secondario coniugato con tag fluorescenti (ad esempio Alexa Fluor 546 capra anti-coniglio anticorpo secondario (diluizione 1:250)) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le strisce di tessuto molto con PBS e conservare in PBS a 4 ° C </li><li> Immediatamente prima caratterizzazione AFM, attaccare la striscia di tessuto di un poli-l-lisina rivestito di 15 mm coprioggetto sollevando il coprioggetto da sotto il tessuto galleggiante, assicurandosi che la striscia di tessuto si diffonde in modo uniforme sulla superficie del vetrino, se necessario, a sandwich la striscia con un panno pulito secondo, non patinati coprioggetto e applicare una leggera pressione per assistere con attaccamento al tessuto poli-L-lisina rivestite coprioggetto. </li><li> Calibrare il sistema AFM seguenti istruzioni per la fabbricazione è immediatamente prima di ogni turno di esperimenti micropenetrazione. Stabilire due parametri fondamentali: 1) la molla a sbalzo costante con il metodo termico fluttuazione in aria 6, e, 2) la sensibilità di deflessione a sbalzo, che è un parametro utilizzato per scalare il segnale di uscita fotodiodo per la distanza effettiva flessione a sbalzo, Δd. Calibrare la sensibilità flessione ottenendo uno standard di forza-spostamento della curva in PBS su un vetrino pulito quindi calcolare la pendenza della curva forza-spostamento (Fig.1B). In forza-spostamento di misura della curva, la punta AFM è teso verso di retratto e dalla superficie del campione in un unico luogo (senza raster in direzioni XY), con la deflessione del cantilever, Δd, monitorati in funzione della cilindrata punta, Δz . </li></ol> Si consiglia di utilizzare un nitruro di silicio a sbalzo triangolo con un 5-micron di diametro borosilicato estremità sferica (Novascan). Utilizzando sonde AFM con una molla costante di 0,06 N / m, abbiamo meccanicamente caratterizzato materiali morbidi con moduli di taglio si estende da 100 a 50.000 Pa. <ol start="6"><li> Pulire la superficie inferiore del coprioggetto campione con la carta velina, fissarla ad un vetrino standard con grasso per vuoto, montare il vetrino sul palco campione AFM, e coprire il tessuto con 500 microlitri di PBS (temperatura ambiente). </li><li> Impostare il microscopio per la visione oculare per allineare la punta AFM al centro del campo visivo, regolando la fase di campione microscopio. Scegli una zona di interesse sul tessuto spostando il palcoscenico campione AFM, quindi passare alla visualizzazione telecamera CCD per registrare contrasto di fase e / o immagini di fluorescenza del tessuto, come desiderato. </li><li> Eseguire standard di funzionamento impegno AFM muovendo la punta AFM lentamente verso il basso fino a quando non è in contatto con il campione. </li><li> Accurata caratterizzazione micropenetrazione AFM di campioni agevolato richiede profondità piccola rientranza per evitare grandi tensioni locali che invalidare il modello di Hertz utilizzato per il calcolo modulo elastico. Per evitare tensioni di grandi dimensioni, effettuare il rientro in modalità attiva impostando la deformazione massima a sbalzo (trigger point) a 500 nm. Questo limite sarà frenare la flessioneforza il rientro massimo a meno del 30 nN (F = molla a sbalzo * spostamento costante, o C max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> La velocità di rientro deve essere selezionato per essere sufficientemente lento per esplorare piuttosto elastico proprietà viscoelastiche del campione di morbidi 7. Una gamma di velocità di 2-20 micron al secondo è adatto per il tessuto polmonare. <ol start="10"><li> Per una singola misura da una zona di interesse, spostare la sonda AFM alla posizione di interesse ed effettuare un rientro solo per raccogliere uno standard di forza-spostamento della curva (la sonda si muove solo in direzione Z senza scansione XY). </li><li> Per la mappatura automatica di una regione di interesse, passare alla modalità di Forza-Map, selezionare il formato di scansione e punti di campionamento all&#39;interno dell&#39;area selezionata. In Forza-Map modalità, il raster punta AFM tutta la superficie del campione tra i movimenti di rientro, e raccoglie i singoli forza-spostamento delle curve in ogni punto all&#39;interno di una griglia di campionamento definito. Punti di prelievo più fornirà maggiore risoluzione spaziale, ma allungare i tempi necessari per la mappatura. Abbiamo trovato pratico utilizzare una griglia di 16 x 16 campione per mappare un 80 x 80 micron zona ad una velocità di rientro di 20 micron al secondo, che può essere completato in circa 10 minuti. </li></ol> 3. AFM Estrazione dei dati <ol><li> Per calcolare il modulo di Young, inserire la forza-spostamento della curva al modello Hertz indentazione sferica con minimi quadrati non lineare curva raccordo 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove F = k c * Δ d, è la forza di piegare il cantilever, k c è la molla a sbalzo costante, R è punta raggio della sfera, δ = Δ z - Δ d è indentazione e υ è il rapporto di Poisson del campione (υ = 0,4 per il tessuto polmonare 9). </li><li> Per valutare la qualità del fit, calcolare il valore SSR, o la somma dei quadrati delle differenze tra i dati ed i valori in forma, durante il montaggio non lineare curva. Eliminare le misurazioni inaffidabili o non interpretabili dai dati scartando da &quot;cattivo&quot; le curve con i valori SSR di grandi dimensioni. </li><li> Se lo si desidera, convertire modulo elastico (E) al modulo di taglio (G), utilizzando la relazione E = 2 x (1 + υ) x G. Per visualizzare modelli spaziali di rigidità raccolti in Forza-Map modalità, tracciare i dati nel modulo di contorno mappe (per esempio in griglia di 16 x 16 campione che copre una 80 x 80 micron-area). </li><li> Per elaborare una grande quantità di dati curva di forza, un algoritmo personalizzato può essere scritta per adattare automaticamente le curve forza-spostamento, estratto di moduli e / o elastographs trama utilizzando le stesse procedure e parametri, come indicato al punto 3.2 e 3.3 (ad esempio Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 (A) Schema di micropenetrazione AFM di un campione morbida su un substrato rigido utilizzando una sonda sferica (Riprodotto con il permesso di Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Rappresentante forza-spostamento curva raccolti da un vetrino pulito in PBS flessione per determinare la sensibilità a sbalzo. (C) Rappresentante forza-spostamento curve raccolti da morbida (blu) e rigida (rosso) i campioni che presentano i parametri corrispondenti (A). 4. Rappresentante dei risultati: Figura 2A mostra una striscia di parenchima polmonare attaccato il poli-L-lisina coprioggetto rivestito in PBS con una sonda AFM al posto direttamente sopra la regione di interesse e pronti per la mappatura micropenetrazione. Figura 2B mostra che nel tessuto opportunamente tagliati e colorati, la microarchitettura alveolare del parenchima polmonare è ben conservata, come osservato dalla colorazione per immunofluorescenza laminina componente membrana basale senza fissazione o permeabilizzazione. Figura 2 mostrano colorazione CD immunofluorescenza per il collagene I polmoni non fissate in fresco raccolto da topi precedentemente trattati con PBS (Fig. 2C), o trattati con bleomicina (Fig. 2D) per indurre fibrosi 10. Figura 3A mostra campione forza-spostamento trame ottenute da micropenetrazione AFM. Con la stessa forza applicata, AFM punta genera un grande rientro su una regione morbido (linea blu), risultando in un relativamente &quot;piatta&quot; forza-spostamento della curva contro una piccola rientranza e una &quot;ripida&quot; curva forza-spostamento per una regione più rigido ( linea rossa). Al fine di ottenere curve di spinta pulito, dopo ogni rientro la punta AFM deve essere ritirato completamente dalla superficie del campione e senza contatto prima il rientro successivo. Questo stato contatto libero corrisponde alla regione pianeggiante della curva in figura 3a, dove la punta si traduce senza flessione a sbalzo. Figura 3B mostra una tipica curva falsa senza una regione pianeggiante che si verifica quando la punta non è completamente ritirato dalla superficie del campione (per esempio, campione morbido unottaches alla punta) che rendono impossibile determinare il punto di contatto. Se la punta è completamente intrappolata nel campione morbido, la curva può apparire come mostrato nella Figura 3C, senza deflessione chiaro, ma il rumore di piccole dimensioni. La Figura 4 mostra i dati di taglio modulo estratto da forza-spostamento curve visualizzate nello spazio come mappe rigidità (elastographs), dove le scale di colore con il modulo di elasticità tangenziale. Elastographs dimostrano notevoli differenze nella gamma e distribuzione di modulo di taglio dei tessuti in condizioni normali (Fig. 4A) e fibrotica (Fig. 4B) parenchima polmonare, e grandi variazioni spaziali nel modulo di taglio, in particolare all&#39;interno del campione polmonari fibrotiche. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Micrografia contrasto di fase che mostra una sonda AFM su una striscia di parenchima polmonare del mouse. Scala bar, 50 micron. (B) immunocolorazione della laminina nel tessuto polmonare normale del mouse mostra la microarchitettura alveolari del parenchima polmonare normale. Scatola bianca indica tipico 80-by-80μm zona mappatura elasticità. Scala grafica: 20 micron. (C e D) del collagene I immunocolorazione in soluzione salina (C) e bleomicina (D) trattati topo parenchima polmonare. Barre di scala, a 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (A) Rappresentante interpretabili forza-spostamento curve raccolti da salina (blu) e trattati con bleomicina (rosso) del mouse parenchima polmonare, rispettivamente. Le linee nere sono la migliore misura ottenuta dal modello Hertz sferica e sono etichettate con il loro corrispondente calcolato moduli di Young. (B, C) Rappresentante ONU-interpretabile forza-spostamento delle curve. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Elastographs Rappresentante raccolti da salino (A) e trattati con bleomicina (B) del mouse parenchima polmonare. Le barre di colore indicano modulo di taglio in kilopascal. Etichette degli assi indicano scala spaziale in micrometri. Scala grafica: 20 micron

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare, utilizzando micropenetrazione AFM offre risoluzione spaziale senza precedenti (Fig. 4), che fornisce una prospettiva unica sulle variazioni in microscala rigidità dei tessuti. Come esempio della sua utilità, precedenti macro-scala di misurazione in strisce polmone normale e fibrotica del tessuto indicato un circa 2-3-volte più elevata elastanza con fibrosi 11,12. Al contrario, micropenetrazione AFM rivela che irrigidire il tessuto è altamente localizzata, con alcune regioni espositrici fino a ~ aumenta di 30 volte nel modulo di taglio sopra la media osservata nel tessuto polmonare normale 10. Come matrice di rigidezza è ormai noto per influenzare in modo critico la funzione delle cellule, queste misure locali forniscono parametri inestimabile per migliorare la biofidelity di studiare la cultura di cellule polmonari. Diverse questioni pratiche sorgono con l&#39;uso di sottili strisce di tessuto polmonare. Le superfici delle strisce non sono perfettamente piatte, come il profilo dei tessuti segue l&#39;architettura degli alveoli sottostante. Il sistema regola automaticamente AFM posizione della punta nella direzione Z durante indentazione quando la superficie del campione variazione altezza è inferiore di 15 micron per aiutare a superare questa sfida. Le misurazioni sono effettuate a temperatura ambiente, non 37 ° C, quindi deviazioni in proprietà meccaniche causate da questa variazione di temperatura non possono essere valutate, anche se ci si aspetterebbe di essere minorenne. L&#39;influenza dell&#39;architettura sottostante muro alveolare osservato proprietà meccaniche è difficile determinare con la configurazione attuale microscopia ottica. Per esempio, sarebbe auspicabile per determinare se le pareti alveolari presentare anisotropia e proprietà meccaniche diverse, quando rientrato in direzioni allineati con o trasversali al piano della parete. Tuttavia, i campioni attuali sono spesse e il sistema di imaging non ha capacità 3D, quindi non è possibile determinare l&#39;orientamento locale muro alveolare in ogni punto di contatto. Infine, l&#39;influenza dei costituenti cellulari su misura delle proprietà meccaniche deve essere ancora pienamente chiarito. Nei metodi disponibili a questo link, non vengono compiuti sforzi per rimuovere specificamente costituenti cellulari del tessuto. Tuttavia, le cellule presenti in superficie disponibile per l&#39;indentazione difficilmente realizzabile tenuto conto del tempo trascorso dalla raccolta dei tessuti e la necessità di tagliare il tessuto per ottenere l&#39;accesso agli alveoli. Esperimenti specifici per rimuovere le cellule, o ripopolare matrici con cellule vitali, e valutare le conseguenti modifiche delle rigidità del tessuto sembrerebbe giustificata. Perché fresco tessuto non fissato è necessario per queste misurazioni, il tempo trascorso dalla raccolta tessuto misura deve essere ridotta al minimo e campioni devono essere conservati a 4 ° C per evitare cambiamenti nelle proprietà meccaniche. Particolare attenzione deve essere prestata quando le strisce di tessuto sono trasferiti tra i contenitori durante il lavaggio o colorazione in modo che la distorsione minima o danni generati. Per applicazioni AFM in un liquido, un passo fondamentale è quello di tagliare il tessuto più piatta possibile e immobilizzare il campione sul vetrino di sostegno. Se disponibile, una macchina automatica sezionamento come un vibratome affettatrice o tessuto può essere usato per tagliare fette di spessore estremamente uniforme. E &#39;importante collegare le strisce di tessuto immediatamente prima dell&#39;inizio delle misurazioni AFM e minimizzare il tempo trascorso per misure AFM come il campione alla fine si staccano dal coprioggetto. Una osservazione utile è che le più grandi strisce sembrano dare più stabile per coprire scivola e rimane in vigore per periodi più lunghi in PBS più piccole strisce. Micropenetrazione AFM può caratterizzare campioni che abbracciano una vasta gamma da 100 Pa a 50 kPa (modulo di taglio) quando si utilizza uno standard di 0,06 N / m cantilever con un diametro di 5 micron punta sferica. Questa gamma può essere espansa utilizzando sonde con differenti costanti di primavera; sonde AFM con punte di vetro sferica che vanno dal 0,6-12 micron di diametro e costanti molla che vanno dal 0,01-0,58 N / m sono disponibili in commercio (ad esempio Novascan) e di uso comune 3. Con una punta di 5 micron sferica, l&#39;area di contatto teorico tra la punta e il tessuto è di circa 5-9 micron 2 per 400-700 nm indentazione (Fig. 1A). Punte più piccole o più grandi possono essere utilizzate per fornire scale più piccole o più grandi di risoluzione spaziale. Punte piramidali sono stati utilizzati anche in micropenetrazione AFM 13-16, offrendo aree di contatto più piccola e aumentando così la risoluzione spaziale in cartografia, anche se raccordo dei dati è più complessa di questa geometria della punta. Diversi limiti di questo metodo dovrebbe essere notato. Il polmone è stato tradizionalmente caratterizzato meccanicamente in modo non invasivo, per esempio utilizzando la pressione-volume di analisi 17 o punch-indentazione dei polmoni interi 19,20. Metodi invasivi come quello descritto qui alterare l&#39;architettura del polmone in maniera importante con la perdita del aria-liquido interface che normalmente esiste in aria piena di polmone e la perdita di pre-stress, che mantiene l&#39;inflazione parziale del polmone sul rilassamento dei muscoli respiratori. Queste limitazioni sono comuni a tutte le misurazioni effettuate in strisce tessuto polmonare 18. In particolare, tuttavia, la rigidità media misurata nel parenchima del tessuto polmonare normale (modulo di taglio ~ 0.5kPa) non differisce sostanzialmente da stime basate su punch-indentazione dei polmoni intatti a volumi di riposo 19,20. Mentre il tessuto polmonare è noto per esibire non lineare irrigidimento con deformazione crescente, non è possibile testare in modo rigoroso se questa proprietà persiste fino alla micro-scala con i metodi qui. Il modello di Hertz assume l&#39;omogeneità del campione. Tuttavia, la maggior parte dei materiali biologici, tra cui parenchima polmonare, sono sempre più eterogenei a ridurre scale spaziali. L&#39;eterogeneità del campione può causare difetti come la variazione di modulo di Young a seconda della profondità di indentazione, cioè a seconda del livello o componente che è deformante. L&#39;eterogeneità del piano xy può essere limitato a scegliere con cura la dimensione appropriata estremità sferica a seconda della microstruttura del biomateriale come proposto dal Dimitriadis EK et al. 8 E &#39;molto più difficile da prevedere e correggere l&#39;errore Hertz modello a causa di materiale eterogeneità nella direzione z. Azeloglu et al. recentemente proposto un modello ibrido di calcolo per caratterizzare le proprietà elastiche del substrato eterogeneo con inclusioni discrete incorporate 21. La loro nuova tecnica offre un potenziale strumento per calcolare le proprietà inserimento di materiali eterogenei superare i limiti di analisi hertziane. Il modello di Hertz si assume altresì assoluto comportamento elastico, mentre i materiali biologici tipicamente display del tempo-dipendente comportamenti viscoelastico. Una caratterizzazione viscoelastica completa del tessuto può essere ottenuto variando la velocità di rientro usato. Importante, precedente macro-scala prove meccaniche del tessuto polmonare normale e fibrotica dimostra la dipendenza debole frequenza delle proprietà meccaniche del tessuto polmonare, e la conservazione delle differenze tra le proprietà dei tessuti normali e fibrotico meccanica su tutte le frequenze testate 11. Questi risultati suggeriscono fortemente che la misura delle proprietà meccaniche con una velocità di solo rientro con AFM coglie un aspetto essenziale dei cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei tessuti che accompagnano la fibrosi. Il rapporto di Poisson di 0,4 per tessuto polmonare utilizzati in questo lavoro è di una misura macroscopica 9. Purtroppo, il rapporto di Poisson in micro-scala e qualsiasi cambiamento in condizioni di malattia non sono disponibili in letteratura. Come alternative alla E, E / (1-υ 2) o (1-υ 2) / πE (indicata la costante elastica k) 22 può essere calcolata da micropenetrazione AFM e segnalato quando il rapporto di Poisson è sconosciuta. Per la maggior parte dei biomateriali rapporto di Poisson è nel range di 0,4-0,5 a causa del loro alto contenuto di acqua. All&#39;interno della gamma 0,3-0,5, il fattore 1 / (1-υ 2) varia solo 1,10-1,33, tali che le variazioni ragionevoli in rapporto di Poisson hanno soltanto effetti modesti sul modulo riportato. L&#39;aumento del modulo di taglio che riportiamo di tessuto fibrotico rispetto al tessuto normale è diverse volte in grandezza, il che implica che gli errori associati a variazioni nel rapporto di Poisson sono minimi rispetto ai cambiamenti nelle proprietà meccaniche osservato. L&#39;algoritmo attuale e codice che può essere utilizzato per l&#39;analisi della forza-spostamento dati è soggetto alla condizione specifica applicazione e le caratteristiche delle successive diverse popolazioni di forza-spostamento curve. Se più sofisticate analisi è di interesse, si può consultare il lavoro di Lin et al. 23. Gli autori hanno compilato una serie di strategie sinergiche in un algoritmo che risolve molte delle complicazioni che hanno precedentemente ostacolato gli sforzi per automatizzare il montaggio di modelli di dati Hertz rientro. Diverse altre aree sono disponibili per l&#39;ulteriore sviluppo e valorizzazione di questo metodo. Nei casi in cui uno è interessato a visualizzare le pareti alveolari senza etichettatura di anticorpi, sia elastina e collagene possono essere visualizzati dal loro segnale autofluorescenti nello spettro verde. D&#39;altra parte, una migliore immagine, usando sezioni di tessuto più sottile, le tecniche di imaging 3D, o entrambi, potrebbe migliorare la capacità di correlare l&#39;architettura dei tessuti con proprietà meccaniche di base. Mentre i metodi attuali consentono colorazione e la visualizzazione dei componenti della matrice extracellulare come collagene e laminina, ulteriori sforzi potrebbero rivolgersi a colorazione marcatori di superficie delle cellule per identificare popolazioni di cellule specifiche e per caratterizzare la microambienti meccanica nelle vicinanze di queste popolazioni. Alternatively, il tessuto potrebbe essere raccolto da topi che esprimono fluorescente-tagged lignaggio o marcatori delle cellule proteine ​​specifiche per perseguire lo stesso obiettivo. Infine, il metodo dettagliato appare qui ben si adatta a caratterizzare le altre caratteristiche anatomiche del polmone, come ad esempio le navi che rimodellare nell&#39;ipertensione, e le vie respiratorie che rimodellare in asma. In base al suo stato attuale di sviluppo e potenzialità di ulteriore potenziamento, micropenetrazione AFM sembra pronto a dare preziose informazioni i cambiamenti nella rigidità dei tessuti che accompagnano la progressione della malattia nei polmoni, e sarà senza dubbio di valore nel caratterizzare i cambiamenti spaziali e temporali nel la rigidità di una varietà di altri tessuti molli.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> AFM punta </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 micron borosilicato tallone, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina coprioggetto </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 millimetri rotonda No.1 vetro </td></tr><tr><td> Agarosio, gelificanti bassa temperatura </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-collagene I (Rb PAB) anticorpi </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 di capra anti-coniglio di anticorpi </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-laminina </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Matrice di rigidezza influenza fortemente la crescita, la differenziazione e la funzione delle cellule aderenti 1-3. Su scala macro la rigidità dei tessuti e organi nel corpo umano arco di diversi ordini di grandezza 4. Molto meno si sa su come la rigidità varia spazialmente all&#39;interno di tessuti, e ciò che la portata e la scala spaziale dei cambiamenti rigidità sono in processi patologici che provocano rimodellamento del tessuto. Per capire meglio come i cambiamenti nella matrice di rigidezza contribuire alla fisiologia cellulare in salute e malattia, la misurazione della rigidità tessuti ottenuti su scala territoriali attinenti alle cellule residenti sono necessari. Ciò è particolarmente vero per il polmone, un tessuto altamente compatibile ed elastico in cui rimodellamento della matrice è una caratteristica importante in malattie come l&#39;asma, enfisema, ipertensione e fibrosi. Per caratterizzare l&#39;ambiente locale meccaniche del parenchima polmonare in una scala territoriali attinenti alle cellule residenti, abbiamo sviluppato metodi per misurare direttamente le proprietà elastiche del locale fresco tessuto polmonare murino utilizzando microscopia a forza atomica (AFM) micropenetrazione. Con la scelta appropriata di AFM penetratore, a sbalzo, e la profondità di indentazione, questi metodi consentono misure di modulo di taglio del tessuto locale in parallelo con contrasto di fase e di imaging di fluorescenza della regione di interesse. Campionamento sistematico delle strisce di tessuto fornisce mappe delle proprietà meccaniche del tessuto locale, che rivelano le variazioni spaziali nel modulo di elasticità tangenziale. Correlazioni tra proprietà meccaniche e caratteristiche anatomiche sottostanti e patologiche illustrare come la rigidità varia con deposizione di matrice nella fibrosi. Questi metodi possono essere estesi ad altri tessuti molli e processi di malattia di rivelare come le proprietà meccaniche del tessuto locale variano tra lo spazio e la progressione della malattia.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

La rigidità della matrice extracellulare influenza fortemente i comportamenti multipli di cellule aderenti. Matrice di rigidezza varia spazialmente in tutto un tessuto, e subisce modifiche nelle condizioni patologiche diverse. Qui sviluppare metodi per la caratterizzazione variazioni spaziali della rigidità nei tessuti del mouse normale e fibrotica del polmone mediante microscopia a forza atomica micropenetrazione.

Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Views.  Harvard School of Public Health. La rigidità della matrice extracellulare influenza fortemente i comportamenti multipli di cellule aderenti. Matrice di rigidezza varia spazialmente in tutto un tessuto, e subisce modifiche nelle condizioni patologiche diverse. Qui sviluppare metodi per la caratterizzazione variazioni spaziali della rigidità nei tessuti del mouse normale e fibrotica del polmone mediante microscopia a forza atomica micropenetrazione.

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Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Ricerca

Biologia

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d&#39;oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...