Agradecemos fundos de inicialização de Wayne State University (MJA), uma bolsa da Fundação Americana para Aging Research (SMV), e um Caminho para a Independência Award Transição de Carreira (R00EB007129) do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia do Instituto Nacional da Saúde (MJA).

1. Metalation usando LnCl três sais <ol><li> Dissolver o ligante na água para produzir uma solução de 30-265 mM. O ligante 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-ácido dietileno pentaacetic (p-SCN Bn-DTPA) foi usado neste vídeo a uma concentração de 73 mM. </li><li> Ajustar o pH da solução do ligante para entre 5,5 e 7,0 pela adição de 1 M NH 4 OH. Neste vídeo, 0,2 mL de NH M 1 4 OH solução foi usado. </li><li> Dissolver 02/01 equivalentes de LnCl 3 em água para produzir uma solução com uma concentração de 5000-1000 mM. Neste vídeo, EuCl 3 e GdCl 3 foram usados ​​em concentrações de 111 mM. Um excesso de metal é usado frequentemente para conduzir o metalation até a conclusão e, consequentemente, simplificar a purificação. </li><li> Adicionar a solução de LnCl 3 para a solução de ligante, agitando. </li><li> Após a adição de LnCl 3, ajustar o pH da mistura de reação resultante para entre 5,5 e 7,0 pela adição de 0,2 M NH 4 OH. Um total de 0,5 mL de NH 4 M 0,2 solução de OH foi usado neste vídeo. Se o seu ligante contém ácido-sensíveis grupos funcionais, ajustar o pH várias vezes durante esta etapa. ATENÇÃO - Se a solução torna-se demasiado básica, qualquer base sensível grupos funcionais, como o isotiocianato, serão inutilizados para a conjugação. </li><li> Monitorar a reação via medições de pH. A reação é completa quando o pH se mantém constante. </li></ol> 2. Workup pH Raising (não incluído neste vídeo, mas bom para ligantes sem base sensível grupos funcionais) <ol><li> Adicionar concentrada NH 4 OH à mistura de reação para ajustar o pH a ≥ 11. Esta etapa irá precipitar os metais não complexada como o hidróxido insolúvel. </li><li> Filtrar o sobrenadante através de um filtro M 0,2. Se a mistura de reação entope o filtro, centrifugação e decantação antes de filtragem é recomendado. </li><li> Se a diálise não será realizada, remover solvente sob pressão reduzida (evaporação rotativa ou liofilização é recomendado). </li><li> 2,1-2,3 passos podem ser repetidos se lantanídeos livre permanece. </li></ol> 3. Diálise workup <ol><li> Corte o tubo de diálise com um comprimento adequado (siga as orientações do fabricante) para manter o volume de amostra, deixando comprimento extra (aproximadamente 10% do volume da amostra). Neste vídeo, um 100-500 dalton de peso molecular de corte de membrana (MWCO) foi usado, mas maiores tubos MWCO pode ser usado como apropriado se conjugação é realizada antes da metalation. Além disso, cassetes de diálise pode ser usado como uma alternativa ao tubo de diálise, se desejar. </li><li> Se for o caso com base em orientações do fabricante, mergulhe o tubo de diálise corte em água por 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Encher um reservatório de diálise (um copo de L 1 foi usado neste vídeo) com água (efluente). O volume de dialisato deve ser de aproximadamente 100 vezes a da amostra. </li><li> Uma extremidade do tubo vezes duas vezes e garantir a porção dobrada do tubo com uma pinça de fechamento de diálise. Enrole a ponta do encerramento com um elástico para garantir que ele permanece fechado durante a diálise. </li><li> Filtrar a mistura de reação através de um filtro 0,2 m, e carregar o filtrado para a extremidade aberta do tubo com cuidado para não rasgar o tubo. Certifique-se de deixar espaço de cabeça o suficiente para fechar a tubulação. </li><li> Dobre a outra extremidade aberta do tubo de duas vezes, segura com um fechamento, e enrole o fechamento com um elástico como no passo 3.4. </li><li> Anexar um frasco de vidro contendo ar, ao grampo em uma extremidade do tubo de diálise utilizando um elástico. Anexar um frasco contendo areia para a braçadeira outros. Esses frascos garantir que a tubulação fica imerso no dialisado. </li><li> Coloque a tubulação cheia no reservatório de diálise que contém dialisado. </li><li> Agitar o dialisado usando uma placa de agitação magnética a uma velocidade lenta (sem vórtice) à temperatura ambiente. </li><li> Alterar o dialisato 3x ao longo de um dia (neste vídeo, o dialisato foi alterada de 2,5, 6,5 e 11,5 h), e então permitir que a diálise para continuar durante a noite (para um total de 20-28 h de diálise). </li><li> Remova o tubo de diálise do dialisato e abra cuidadosamente um fechamento para remover a amostra. Lave o tubo de diálise 3x com água e combinam as lavagens com a amostra. </li><li> Retire a água sob pressão reduzida. Liofilização é usada neste vídeo. </li></ol> 4. Avaliação da presença de metal livre <ol><li> Dissolver o complexo de metal em tampão acetato (preparação buffer: Dissolver 1,4 mL de ácido acético em 400 mL de água, ajustar o pH para 5,8 com 1 M NH 4 OH, e acrescentar água para produzir um volume total de 500 mL) e adicione o xilenol indicador de laranja (16 mM em tampão pH 5,8). Neste vídeo, 0,3 mg do complexo foi dissolvida em 0,3 mL de tampão e 3 mL da solução do indicador foi adicionado. </li><li>Detectar a presença de metal livre através de observação de uma mudança de cor do indicador de amarelo para violeta. </li><li> Se desejar, a quantidade de metal livre pode ser quantificado através da criação de uma curva de calibração 1. Alternativamente, o corante arsenazo III pode ser usado em vez de xilenol laranja 2. Se o metal livre permanece, a amostra deve ser purificado utilizando diálise, uma coluna de dessalinização, ou cromatografia líquida (HPLC), antes da caracterização. </li></ol> 5. Determinação de água coordenação-número (q) <ol><li> Prepare uma solução para o Eu-III contendo complexo (~ 1 mm), em H 2 O e outra solução de mesma concentração em D 2 O. Antes da análise, a solução de D 2 O deve ser evaporada e dissolvida em D 2 O três vezes para remover residual H 2 O. </li><li> Adicionar a solução de água para uma cuvete limpa, e coloque a cubeta em um espectrofluorímetro. </li><li> Realizar exames de excitação e emissão para determinar os máximos para cada (~ 395 nm e ~ 595 nm, respectivamente). </li><li> Realizar um experimento de tempo de decaimento-fosforescência usando os seguintes parâmetros: excitação e emissão de comprimentos de onda determinado a partir do passo 5.3, de excitação e de emissão larguras de fenda (5 nm), flash count (100), atraso inicial (0,01 ms), prazo máximo (13 ms) e incremento de atraso (0,1 ms). Estas condições são apropriadas para a maioria dos complexos, mas o atraso máximo e os valores de incremento pode ser aumentada ou diminuída para espécies com tempos de decaimento muito longo ou muito curto. </li><li> Repita o passo 5,4 com a solução D O 2 preparada no passo 5.1. </li><li> A partir dos dados de luminescência de decaimento obtida em 5.4 e 5.5, o enredo do log natural de intensidade versus tempo. A inclinação dessas linhas são as taxas de decaimento (τ -1) (Figura 2). Neste vídeo, Microsoft Excel 2007 foi utilizado para gerar os gráficos log natural a partir dos dados brutos. Use as taxas de atenuação na equação desenvolvida por Horrocks e colegas de trabalho (eq 1) 3. Se o seu ligante contém OH ou NH grupos coordenados ao metal, então a equação deve ser modificada antes de utilizar 3. </li></ol> eq 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Equação 1" /> 6. Medições de relaxação <ol><li> Selecione o modo de aplicação desejada no analisador tempo de relaxamento: T 1 (tempo de relaxamento longitudinal) ou T 2 (tempo de relaxamento transversal). </li><li> Preparar uma série de amostras que contêm diferentes concentrações de D-us III contendo complexos em um solvente aquoso. Neste vídeo, a água era utilizada como solvente e soluções de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 e 0 mM foram preparadas. Outros solventes aquosos ou buffers poderia ser usado, mas é importante usar o solvente como o branco. O volume final da amostra é específico para o instrumento que está sendo usado. </li><li> Colocar a amostra no instrumento e deixe descansar por 5 min para equilibrar a temperatura do instrumento (37 ° C neste vídeo). </li><li> Determinar o tempo de relaxamento (em unidades de s), ajustando os parâmetros do software para obter uma curva suave exponencial para T 1 ou T 2 (curvas representativas para T 1 e T 2 são mostrados na Figura 3). </li><li> Repita os passos 6.3 e 6.4 para todas as amostras, incluindo o espaço em branco. </li><li> Calcule o inverso da medida T 1 ou T 2 valores em unidades de s -1. </li><li> Plotar a T 1 -1 ou T 2 -1 contra D&#39;us valores de concentração III (em unidades de mM). Devido à natureza de D&#39;us III higroscópico contendo complexos, confirmar a concentração de D-us III usando espectrofotometria de absorção atômica ou indutivamente acoplado a espectrometria de massa de plasma. Fit a trama com uma linha reta. Uma parcela representativa é mostrado na Figura 4. </li><li> A inclinação da linha ajustada é a relaxação (r 1 ou r 2 para T 1 e T 2, respectivamente) e tem unidades de mM -1 s -1. </li></ol> 7. Resultados representante Dados representativos para as etapas deste protocolo foram incluídos na seção de tabelas e figuras. Além de o número de coordenação de água e caracterização relaxação descrito no protocolo, é importante para caracterizar produtos finais utilizando técnicas químicas padrão. A identidade do composto pode ser obtido por espectrometria de massa, e espectros de massa representante mostrando os padrões de isótopos de diagnóstico para D&#39;us III - Eu e III contendo complexos são mostrados na Figura 5. Além disso, para não-Gd III </sup&gt; lantanídeos contendo complexos, espectroscopia de RMN pode ser utilizada para a identificação do produto. Para caracterizar a pureza do complexo, HPLC ou análise elementar ou ambos podem ser usados. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Esquema geral para metalation e purificação:. Esquema representando o procedimento geral para metalation e razões para escolher rotas diferentes de purificação. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 Luminescência intensidade parcela:. Enredo Representante do log natural de intensidade versus tempo da seção 5. As inclinações das linhas geradas a partir de curvas similares adquiridos para água e soluções de D 2 O são usados ​​com um eq para caracterizar o número de coordenação de água Eu III contendo complexos. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 curvas de relaxamento deterioração do tempo:. Dados Representante para (esquerda) e T 1 (direita) T 2 de aquisição. Desvios relativamente a estas formas de curva seria produzir dados confiáveis. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 determinação relaxação:. A parcela representativa de 1 / T 1 versus a concentração de D-us III. A inclinação da linha é equipada relaxação e tem unidades de mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5 espectros de massa:. Espectros Representante em massa, mostrando os padrões de isótopos de diagnóstico para (esquerda) Gd III contendo complexos e (direita) Eu III contendo complexos. Os picos preto Gaussian representam a distribuição dos isótopos teóricos e as linhas vermelhas são os dados reais.

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K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#243;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado o número crescente de publicações que incluem agentes de contraste à base de lantanídeos 14/04, é importante que seja tomado cuidado na preparação, purificação e caracterização de produtos para garantir resultados reprodutíveis e comparáveis. Estes complexos são muitas vezes considerados desafiadores para purificar e caracterizar moléculas orgânicas em relação ao devido à sua natureza paramagnética ea sensibilidade de qualquer grupo funcional que pode ser usado para bioconjugation. Nós descrevemos métodos comuns para a síntese, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos. No entanto, ao escolher um destes métodos é importante considerar o sistema específico que está sendo estudado. Em reações de complexação, uma variedade de sais metálicos que estão comercialmente disponíveis podem ser utilizados, ea seleção de sal depende do objectivo do estudo. Por exemplo, uma vantagem de usar o cloreto de (ou triflate ou nitrato) sais é que as condições relativamente suaves são necessários com relação à temperatura. No entanto, estes métodos requerem monitoramento cuidadoso do pH e produção de sais como subprodutos. Se o sistema em estudo é particularmente sensível às mudanças no pH, em seguida, um cuidadoso monitoramento e controle do pH deve ser realizada. Além disso, se os subprodutos de sal seria prejudicial ao sistema a ser estudado, eles devem ser removidos ou uma síntese alternativa deve ser usada. Com o hidróxido de lantanídeos ou (óxido de) matérias-primas, temperaturas mais altas devem ser usados ​​por causa da baixa solubilidade destas espécies, mas o único subproduto da metalation é a água. Este método é ideal para as reações que seria difícil para dessalinizar, mas não iria trabalhar para sistemas sensíveis à temperatura. Também é importante ressaltar que essas reações metalation são extremamente robustos no que diz respeito às concentrações de metal e ligante. A concentração intervalos listados em parte uma extensão da gama de concentrações que nós poderíamos encontrar na literatura. Além da seleção cuidadosa de material metálico de partida, é importante ressaltar que tanto o metal e ligante provavelmente intimamente associada moléculas de água e solvente, mesmo que eles parecem estar seco. Estas moléculas adicionais são muitas vezes suficiente para distorcer muito a estequiometria de uma reação. Por isso, é útil ter bem caracterizado matérias-primas (análise elementar) para que quantidades precisas desses materiais são utilizados na reação. Neste artigo, enfatizamos a importância de manter o pH da mistura de reação. Este controle de pH é crítico por causa das múltiplas vertentes da reação que pode falhar se o pH é permitido desviar-se perto neutro. Para a reação metalation a ocorrer, os ácidos carboxílicos sobre o ligante deve ser desprotonado (perto de pH neutro ou superior), enquanto o íon lantanídeo deve permanecer solúvel (perto de pH neutro ou inferior). Se o pH é muito alto, complexos de hidróxido insolúvel do íon lantanídeo irá precipitar e parar a reação. Alternativamente, se o pH é muito baixo, os ácidos carboxílicos protonados e continuará a ser o ligante não irá coordenar ao metal. Além disso, em valores de pH extremos, grupos funcionais reativos irá se decompor e tornar o complexo de inertes para reações bioconjugation subseqüentes. Para complicar ainda mais, como a reação metalation ocorre, o pH da mistura de reação é reduzido como ácidos carboxílicos desprotonado. Enquanto o ato de equilíbrio do pH metalation pode parecer complexo, pode ser facilmente controlada com a adição cuidadosa de base. Há muitas estratégias para metalation com diferenças sutis. Neste artigo optou-se por descrever o uso de metais em excesso. Também é aceitável a utilização de ligante em excesso ou quantidades equivalentes de ligante e metal (com base na análise elementar de matérias-primas). Há vantagens e limitações de cada rota. A principal vantagem de usar o excesso de metal é que o ligante é muitas vezes o material mais caro de partida, e este método pode economizar dinheiro. No entanto, quando o metal é usado em excesso, a remoção do excesso de metal é de fundamental importância, pois qualquer metal livre pode influenciar dramaticamente propriedades importantes, incluindo a relaxação e toxicidade. Se a diálise contra água é insuficiente para remover o excesso de metal, diálise contra tampão citrato pode ser realizada seguida de diálise com água para remover tampão citrato. Alternativamente, uma coluna de dessalinização ou HPLC pode ser usado, desde que seja tomado cuidado para garantir que a neutralidade do pH da fase móvel é usado. Quando o ligante é usado em excesso, não há mais a necessidade crítica para remover o excesso de metal e ligante em excesso provavelmente não vai influenciar relaxação, no entanto, ligante livre permanecerá. Para reações bioconjugation subseqüentes, este ligante em excesso pode ser problemático e resultar em conjugados não homogêneo que são difíceis de separar. Para remediar esta questão, metal complexes pode ser precipitado de éter etílico anidro ou HPLC pode ser usado para separar complexo de metal do ligante em excesso. Idealmente, ligante e metal seria utilizado na proporção de 1:1, resultando em subprodutos não-metal ou ligando-based. Contudo, a análise elementar para ambos os materiais de partida é necessária antes de cada reação, e se há um ligeiro desvio a partir de uma relação de 1:1 ligante-metal, então a reação cairá tanto o ligante em excesso ou metal- em excesso de categorias, resultando na necessidade de purificação. Nós demonstramos metalation onde o complexo resultante está pronto para bioconjugation 15-17. Uma alternativa a esta estratégia é a conjugação de ligante e biomolécula primeiro, seguido por metalation 18,19. Com esta estratégia conjugada-then-metalate, os mesmos fatores precisam ser levados em consideração ao decidir sobre uma rota metalation (pH sensibilidade e sensibilidade à temperatura da biomolécula, bem como a capacidade de purificar produto a partir de sais).

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagentes e Equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203254-5G </td></tr><tr><td> p SCN-Bn-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> hidróxido de amônio </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Celulose Ester (CE) Membrana de Diálise - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG Unidades Filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xilenol laranja tetrasodium sal </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> depurador de água </td><td> ELGA </td><td> PURELAB Ultra </td></tr><tr><td> cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analisador de tempo de relaxamento </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro UV-vis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> liofilizador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> medidor de pH </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> espectrofluorímetro </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Versão Calculadora Peso Molecular 6,46 por Matthew Monroe, baixado 17 out, 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculadora de Peso Molecular </td></tr></tbody></table>

preparation, purification, and characterization of lanthanide complexes for use as contrast agents for magnetic resonance imaging

Polyaminopolycarboxylate baseado ligantes são comumente usados ​​para quelar íons lantanídeos, e os complexos resultantes são úteis como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI). Muitos ligantes disponíveis comercialmente são especialmente úteis porque contêm grupos funcionais que permitem rápido, de alta pureza e alto rendimento conjugação de macromoléculas e biomoléculas através de amina-reativo ésteres ativados e grupos isotiocianato ou tiol-reativa Maleimidas. Enquanto metalation desses ligantes é considerada o conhecimento comum no campo da química bioconjugation, diferenças sutis em procedimentos metalation devem ser levados em consideração na seleção de materiais metálicos de partida. Além disso, várias opções para a purificação e caracterização de existir, e seleção do procedimento mais eficaz depende em parte da seleção de matérias-primas. Essas diferenças sutis são muitas vezes negligenciados nos protocolos publicados. Aqui, nosso objetivo é demonstrar os métodos comuns para metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos que podem ser usados ​​como agentes de contraste para ressonância magnética (Figura 1). Esperamos que esta publicação irá permitir que os cientistas biomédicos para incorporar as reações de complexação lantanídeos em seu repertório de reações comumente utilizados, facilitando a seleção de matérias-primas e métodos de purificação.

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Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Demonstramos a metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos. Os complexos descrito aqui pode ser conjugado com macromoléculas para habilitar o rastreamento destas moléculas usando ressonância magnética.

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K visualizações.  Wayne State University. Demonstramos a metalation, purificação e caracterização de complexos de lantanídeos. Os complexos descrito aqui pode ser conjugado com macromoléculas para habilitar o rastreamento destas moléculas usando ressonância magnética.

Vídeo: Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Biologia

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

Automated interação hidrofóbica Seleção coluna de cromatografia para uso na purificação de proteínas

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantificar mistura usando Ressonância Magnética

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Geração e Purificação de INO80 cromatina remodelação Complexos Humanos e subcomplexos

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...