Este trabalho foi financiado pelo NIH concede DE018304, R01DE018281. KT é apoiada por GM07092 T32-34 e por uma concessão para a University of North Carolina em Chapel Hill do Howard Hughes Medical Institute (HHMI) através do Med em Grad Initiative. PC é suportado pelo T32 CA009156.

A qPCR arrays pré-miRNA perfil pode ser configurado como totalmente automatizada com uma liberdade Tecan Evo robô (A) ou à mão com a pipeta multicanal Matrix eletrônico (B). 1) Prepare a mistura principal, placas primer e amostras. <ol><li> Primer placas contendo 186 pares de primers em formato de 96 poços (total de 2 placas) em 12:05 devem ser armazenadas a -80 ° C. Placas descongelar em temperatura ambiente, vortex e centrifugar brevemente antes de usar. </li><li> Para preparar o mix master, descongelar SYBR Green 2x Mix PCR em temperatura ambiente. Cada reação usa master mix 8ul com primer 2ul. A composição do mix de mestre por reação é mix SYBR 4ul, 3ul água grau PCR e 10-20 ng de DNA da amostra ou cDNA. </li><li> Para a configuração de cada placa cartilha de 96 poços, quatro tubos master mix serão necessários. Amostras pode ser executado quatro amostras por chapa (singlicate), 2 amostras por placa (duplicata) ou uma única amostra em quadruplicado. </li><li> Prepare master mix, combinando água SYBR, e amostra em cada um dos tubos de 4 2ml Eppendorf. Cada tubo deve conter master mix suficiente para cerca de 100 reações, permitindo que o excesso de resíduos de pipetagem. Vortex para misturar. </li></ol> A. Configuração de ensaio pré-miRNA usando o Freedom Tecan Evo robô. <ol><li> Após a inicialização do robô e carregamento do programa Evoware, lave três vezes com cada 30mls para limpar sistema de bolhas de ar que irá interferir com pipetagem precisão. </li><li> Instalação da plataforma do robô para incluir o seguinte: <ul><li> Rotulados placa de 384 poços </li><li> De 96 poços da placa primer (1) </li><li> Mestre mistura </li><li> A calha contendo lixívia 2% </li><li> Um recipiente cheio de líquido do sistema </li><li> Recipiente vazio </li></ul></li><li> Começar a executar robô automatizado, selecionando &quot;Run&quot; duas vezes. </li><li> No final do programa, remova 384 prato e bem-selo com LightCycler folha de selagem 480 e centrifugar brevemente. Lugar selado placa de 384 poços na posição 1 do hotel. </li><li> Vá para o passo 2.2 e repita para placa de primer 2 com mixes novo mestre e um novo prato de 384 poços. <ol><li> Coloque placa colada na posição 2 do hotel. </li></ol></li><li> Abra o programa Evoware novo para carregar o LightCycler do hotel e selecione &quot;Run&quot; duas vezes. <ol><li> Liberdade Evo carregará automaticamente cada placa no LightCycler e executar o seguinte SYBR verde-I / HRM programa de ciclos: Pre (1 ciclo): 50 ° por 5 minutos a taxa de aumento de 4,8 ° / seg 95 ° por 5 minutos a taxa de aumento de 4,8 ° / seg Amp (45 ciclos): 95 ° por 15 segundos a taxa de rampa de 4,8 ° / seg 62 ° por 30 segundos a uma taxa de rampa de 2,5 ° / seg (Aquisição de dados único durante esta etapa) Curva de fusão: 95 ° por 5 segundos a taxa de rampa de 4,8 ° / seg 60 ° para 1 minuto a taxa de aumento de 2,5 ° / seg 95 ° contínua a taxa de aumento de 0,11 ° / seg com 5 aquisições por ° C Cool: 50 ° por 30 segundos a uma taxa de rampa de 25 ° / seg </li></ol></li></ol> B. Instalação de ensaio pré-miRNA usando o Matrix pipeta multicanal electrónica: <ol><li> Conteúdo lugar de mestre tubo misture 1 em um reservatório. </li><li> Definir a pipeta eletrônica para aspirar 16ul de mix master com 2-8ul dispensar passos seguidos por uma etapa de purga. </li><li> Para mestre misture 1, dispensar 8ul em todos os outros bem da placa de 384 poços (conjunto de 384 bem-espaçamento ponta), começando bem A1. (Ie poços A1, C1, E1, etc) Para o segundo 8ul dispensar, mover para a coluna 3 (ie poços A3, C3, E3, etc), então purge ao longo de um recipiente de resíduos e dicas dispor. </li><li> Siga este padrão para os restantes 5 ciclos até chegar bem A23. </li><li> Repita o procedimento para mestre mix 2, (começando com A2 bem, C2, E2, etc); mestre mix 3 (início em B1 bem, D1, F1, etc); mestre mix 4 (início em B2, D2, F2, etc .). </li><li> Para aliquotting de placa primer, conjunto pipeta eletrônica para aspirar e dispensar 2ul 2ul com um seguinte passo de purga. Dispense 2ul de primers da coluna 1 de 96 poços da placa primer (AH) na placa de 384 poços, poços A1, C1, E1, etc Purge ao longo de um recipiente de resíduos e dicas dispor. Repita o procedimento para poços A2, C2, E2, B1, D1, F1 e B2, D2, F2, etc </li><li> Repita para as linhas 2-12 de primers de 96 poços, deslocando-se a cada 2 colunas para cada coluna primer, até placa de 384 poços completo foi aliquotado. </li><li> Placas de vedação com uma folha de selagem LightCycler e centrifugar brevemente. </li><li> Placas em um lugar LightCycler 480 e ciclo das placas de acordo com as seguintes configurações utilizando o SYBR Green I / HRM formato de detecção: Pre (1 ciclo): 50 ° por 5 minutos a taxa de aumento de 4,8 ° / seg 95 ° por 5 minutos a taxa de aumento de 4,8 ° / seg Amp (45 ciclos): 95 ° por 15 segundos a taxa de rampade 4,8 ° / seg 62 ° por 30 segundos a uma taxa de rampa de 2,5 ° / seg (Aquisição de dados único durante esta etapa) Curva de fusão: 95 ° por 5 segundos a taxa de rampa de 4,8 ° / seg 60 ° para 1 minuto a taxa de aumento de 2,5 ° / seg 95 ° contínua a taxa de aumento de 0,11 ° / seg com 5 aquisições por ° C Cool: 50 ° por 30 segundos a uma taxa de rampa de 25 ° / seg </li><li> Repita usando placa de primer 2, aliquotting em uma placa nova de 384 poços usando mistura mestre preparados na hora. </li></ol> Segredos para o sucesso: Uma característica importante ao projetar matrizes PCR é que todos os 186 pares de primers têm a mesma temperatura de recozimento, de modo que o prato pode ser executado no mesmo ideal PCR configurações do programa ser executado. Cada nova matriz deve ser verificado utilizando três controles antes de amostras em execução. Esses controles são: Uma execução de todos os primers executar com água ou 0,1 x TE para impedir a contaminação primer. 1 execução do alternando água / TE e controle positivo, para garantir que nenhum reporte. 3 é executado usando o mesmo controle positivo, para garantir a reprodutibilidade entre as execuções. Mestre mistura deve ser preparada, e as placas devem ser executados dentro de 24 horas para melhores resultados Folha de chapa de primer deve ser removido lentamente a reduzir o risco de contaminação entre poços. Ao usar um robô com pontas fixas, lave bleach 2% é necessário lavar as pontas entre cada etapa de pipetagem, seguido por uma lavagem de água. Isso evita que e elimina transição, que poderiam contaminar os dados e levar a resultados inconclusivos. Depois de uma placa é executado através do LightCycler, não deve ser aberta novamente na sala de configuração PCR. Isso ajuda a evitar a contaminação da PCR. Resultados representativos: qPCR resultados normalmente são representados por valores CT como determinado a partir do software de análise LightCycler. A temporada de sucesso geralmente consiste de uma série de CTs para amostras, geralmente entre 20-35 para as amostras que são positivas. As amostras de água em uma boa corrida estão sempre em um CT de&gt; 40 e quaisquer amostras ou poços específico com um CT mais de 37 são considerados negativos ou não detectado. Como regra geral, as amostras produzindo um CT de &lt;10 também são confiáveis ​​e estão excluídos da análise posterior. Existem várias maneiras de analisar os dados qPCR ea inclusão de controles internos em nosso teste ajuda a controlar a variação de entrada de amostra. A matriz pré-miR inclui uma cartilha controle U6, que é frequentemente usado como um gene de referência para normalizar valores CT a partir de amostras diferentes. Este valor normalizado é referido como o delta CT valor (DCT). Resultados são representadas graficamente como o CT-primas, o valor DCT ou pode ainda ser analisada a valores padronizados. Na Figura 1, a análise da matriz de pré microRNA-cheia de quatro amostras diferentes de um experimento timecourse é apresentado em formato de mapa de calor. A expressão relativa de cada pré-microRNA é mostrado e três grandes, grupos distintos surgiram. A maioria dos pré-Mirs analisados ​​foram submetidos a mudanças pequenas e insignificantes como esperado (Figura 1A). No entanto, uma pequena parte da pré-microRNAs foram significativamente menores (Figura 1B) ou aumentaram dramaticamente (Figura 1C) durante todo o experimento timecourse. Níveis de expressão de cada pré-microRNA foram normalizados para o ponto no tempo 0h (amostra 1) como um nível basal. Em alguns casos, você pode notar que alguns dos pré-cluster microRNAs também se agrupam na análise heatmap (ex: deixe-7a Figura 1B). Dependendo do experimento, os clusters podem surgir que são dependentes de infecção viral, a expressão de células tipo específico de pré-microRNAs ou pré-Mirs que são regulados por uma molécula comum ou via de sinalização. O ensaio de pré-microRNA que temos desenvolvido também inclui uma série de conhecidos viral pré-microRNAs e genes codificados pelo sarcoma de Kaposi Associated Herpesvirus (KSHV) e Epstein Barr (EBV), para além do humano pré-Mirs. Estes podem ser utilizados como controle positivo ou negativo, dependendo da linha de celular e status viral das amostras utilizadas. Na Figura 2, os TCs média de uma amostra KSHV-negativos executado em quatro vias são mostrados. Importante, KSHV LANA não foi detectado nesta amostra pela matriz qPCR altamente sensível. No entanto, U6 - nossos controles internos e deixe-7a - uma altamente expressa humana pré-microRNA, foram expressas em níveis detectáveis. Finalmente, como esperado, o controle negativo da PCR grau água não deu um produto qPCR. Outro indicador de uma corrida qPCR de sucesso é uma boa análise da curva de fusão, que pode dar dicas sobre possível contaminação nas amostras. Para estabelecer uma temperatura de fusão, a placa é aquecida lentamente após a PCR é completa. Como as fitas de DNA separadas, SYBR green é liberada, e sinal de fluorescência diminui. A temperatura na qual este drop ocorre é gráfico, e é conhecida como a temperatura de fusão da amostra. Dependendo da seqüência de DNA, as amostras de derreter em temperaturas diferentes uns dos outros e do controle da água negativa, o que não deve ter uma temperatura de fusão já que nenhum DNA está presente. Os produtos de PCR de cada par de primer deve derreter em temperaturas semelhantes. Por exemplo, a Figura 3 mostra uma análise da curva de fusão por dois primers diferentes, utilizando a mesma amostra em duplicata. É claro que a temperatura de fusão é diferente para os dois pares de primers, mas a amostra está derretendo na temperatura exata mesma para cada repetição. Sinais de uma amostra ruim ou potencialmente contaminados podem incluir vários picos de fusão, sugerindo a presença de duas fontes diferentes de entrada. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pré-microRNA assinaturas emergir através de perfis usando um qPCR baseado romance matriz. O deltaCTU6 média foi calculada e os valores padronizados foram carregados no software ArrayMinerTM, gerando três grupos distintos exibido como heatmaps. (A) Pré-microRNAs com pequenas alterações na expressão são mostrados. Pré-microRNAs cujos níveis foram significativamente menores (B) ou aumentada (C) também são mostrados. Azul corresponde aos níveis mais baixos de expressão enquanto o vermelho representa o aumento dos níveis de expressão. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Inclusão de controles internos na qPCR baseado conjunto pré-microRNA. Os valores brutos CT por 3 genes diferentes e um modelo de controle não são mostradas. U6 é usado como um controle interno positivo, enquanto PCR H2O serve como nosso controle negativo. Deixe-7-1-1 é um microRNA normalmente expressa em muitos tipos diferentes de células, enquanto KSHV LANA pode ser usado como um controle positivo ou negativo, com base no status viral da linha de célula ou tecido usado. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Melting análise do pico de microRNA pré-primers e falta de contaminação da amostra. Curvas de fusão foram obtidos utilizando a análise chamando Tm no software LightCycler. Dois primers diferentes (Primer A e B) para a mesma amostra executado em duplicado são mostrados. A temperatura de fusão para cada primer é distinta. No entanto, a amostra tem apenas um pico, demonstrando a falta de contaminação da amostra.

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

QPCR é um método altamente sensível que pode ser usado para comparar os níveis de expressão gênica entre as amostras em estudo, bem como para determinar a positividade no caso de vírus. A vantagem de usar arrays qPCR é a capacidade de executar muitos primers (no nosso caso, 186 pares de primers) para cada amostra em um curto período de tempo. Usando um robô de pipetagem, como o Freedom Tecan Evo, a quantidade de tempo necessário para definir um experimento up ainda pode ser reduzido, ea precisão ea consistência do robô pode reduzir e eliminar erros de pipetagem. Aqui demonstramos como usar um Tecan Freedom Evo para configurar uma matriz microRNA, bem como um método alternativo utilizando uma pipeta multicanal Matrix eletrônicos, que podem ser implementadas para laboratórios que não têm acesso a um robô de pipetagem. qPCR arrays também são benéficos porque todos os genes podem ser normalizados para um único conjunto de genes de referência executado no mesmo prato, reduzindo o custo e número de reações. Como mencionado, há várias características que são necessárias ao projetar uma tal variedade. Uma vez que todas as amostras na placa de PCR será executado em condições idênticas, é fundamental para primers de design que funcionam na mesma temperatura e configurações, ou algum pares de primers falhará. Ao projetar primers, as seqüências devem sempre ser verificadas pela pesquisa BLAST para garantir que não há homologia com o seu gene de interesse e não outros genes. Ao executar a matriz, é fundamental que o ambiente é estéril e livre de contaminantes PCR que podem resultar em falsos positivos. Se possível, PCR deve ser criado em uma capa de trabalho estéril ou uma sala separada limpo, onde os produtos PCR nunca são usadas. Bancos devem ser lavadas com Eliminase, água e etanol, e submetidas à luz UV, pelo menos, uma hora após a corrida é completa. O benefício desta técnica é que essa mesma estratégia se aplica para qualquer conjunto de genes a ser perfilado simplesmente substituindo a matriz miRNA com uma matriz contendo um conjunto diferente par primer. Nosso laboratório atualmente contém matrizes para a pré-miRNAs, KSHV, EBV, p53, NFkB e - tudo o que pode ser executado em um método idêntico ao mostrado. A flexibilidade deste ensaio permite que o nosso laboratório para realizar high-throughput perfil genético de forma rápida e confiável para qualquer pares de primers que desejamos para a tela. Aqui, descrevemos a matriz usando cDNA a partir de linhas de células humanas para níveis perfil de expressão de miRNA após a ativação por um período de tempo. Além de caracterizar linhagens de células, a matriz também pode ser usada para analisar amostras clínicas. Após o isolamento do RNA, síntese de cDNA podem ser realizadas, e os cDNA pode ser executado usando essa matriz para caracterizar a expressão do gene. Isto pode ser útil para determinar a positividade viral, ou perfis de expressão gênica de melhor caracterizar os genes que são upregulated em amostras de pacientes infectados. Em resumo, qPCR automatizado baseado em arrays são ensaios reprodutíveis e confiáveis ​​que permitem a detecção altamente sensível de uma grande variedade de genes a partir de tecidos e linhas celulares em tempo hábil.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

Quantitativas PCR em tempo real (qPCR) surgiu como uma ferramenta precisa e valiosa em perfis níveis de expressão de genes. Uma de suas muitas vantagens é um limite inferior de detecção em comparação com outros métodos de perfil de expressão gênica durante o uso de quantidades menores de entrada para cada ensaio. QPCR configuração automatizada tem melhorado neste campo, permitindo maior reprodutibilidade. Sua configuração conveniente e rápida permite high-throughput experimentos, permitindo a caracterização de muitos genes diferentes simultaneamente em cada experimento. Este método, juntamente com os controles internos da placa também reduz variáveis ​​experimentais comuns a outras técnicas. Recentemente, desenvolveu um ensaio de qPCR para o perfil de pré-microRNAs (pré-miRNAs), utilizando um conjunto de 186 pares de primers. MicroRNAs surgiram como uma nova classe de pequenos RNAs não-codificadores com a capacidade de regular as metas mRNA muitos ao nível pós-transcricional. Estes pequenos RNAs são transcritos primeiro pela RNA polimerase II como um miRNA primário (pri-miRNA) transcrição, que é então clivada para o miRNA precursor (pré-miRNA). Pré-miRNAs são exportados para o citoplasma, onde Dicer cliva o loop de hairpin para produzir miRNAs maduros. Aumento dos níveis de miRNA pode ser observado em ambas as precursor do miRNA maduro e níveis e perfis de ambas as formas podem ser úteis. Existem vários testes disponíveis comercialmente para miRNAs maduros, no entanto, seu alto custo pode dissuadir os pesquisadores a partir dessa técnica de perfil. Aqui, discutimos um custo-benefício, confiança, método qPCR SYBR baseada em perfis pré-miRNAs. Mudanças nos níveis pré-miRNA muitas vezes refletir as mudanças miRNA maduro e pode ser um indicador útil de expressão de miRNA maduro. No entanto, o perfil simultânea de ambos os pré-miRNAs e miRNAs maduros pode ser ótimo como eles podem contribuir com informações não redundantes e fornecer informações sobre processamento de microRNA. Além disso, a técnica descrita aqui pode ser expandido para englobar a caracterização de conjuntos de outra biblioteca para vias específicas ou patógenos.

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Vamos demonstrar a configuração e análise de microRNA pré-96 também matrizes para QPCR usando um robô, bem como à mão com uma pipeta multicanal Thermo Scientific Matrix.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K visualizações.  University of North Carolina at Chapel Hill. Vamos demonstrar a configuração e análise de microRNA pré-96 também matrizes para QPCR usando um robô, bem como à mão com uma pipeta multicanal Thermo Scientific Matrix.

Vídeo: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Biologia

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

Gravação em tempo real na Vivo de Arabidopsis sinais de cálcio durante a alimentação de insetos usando um biossensor fluorescente

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...