Agradecemos aos Ciências Naturais e Engenharia Research Council (NSERC) e da Sociedade Canadense do Câncer de apoio financeiro. Graças SCCS NSERC e VNL graças a Ontario Graduate Scholarship programa (OGS) para bolsas de pós-graduação. ARW agradece ao CRC para uma Cátedra de Investigação do Canadá.

Parte 1: Fabricação de Dispositivos <ol><li> Limpar substratos de vidro em solução Piranha (3:1 ácido sulfúrico concentrado:. Peróxido de hidrogênio 30%). Deixe a substratos em solução Piranha para 10 min com agitação freqüente. </li><li> Após lavagem em água deionizada (DI) e secagem dos substratos com gás N 2, coloque os substratos dentro da câmara de feixe de elétrons para o cromo deposição (espessura de 250 nm). </li><li> Para desidratar o substrato revestido de cromo, enxágüe em isopropanol e depois assar em uma placa quente por 5 min a 115 ° C. </li><li> Secar a substratos e privilegiada, com hexametildissilazano (HMDS) por revestimento rotacional (30 s, 3000 rpm). Spin-coat novamente (usando parâmetros idênticos) com Shipley fotorresiste S1811. </li><li> Pré-assar o substrato em uma placa quente (100 ° C, 2 min), então o padrão de fotorresiste por exposição à radiação ultravioleta (UV) por 5 s através de uma fotomáscara. </li><li> Desenvolver os substratos UV exposta em Shipley MF 321 developer por 3 min e lavar em água DI. Pós bake-em uma placa quente a 100 ° C por 1 min. </li><li> Cromo o Etch expostos por imersão em cromo etchant por 30 s. Enxágüe com água DI, então mergulhe no removedor AZ300T por 10 min para remover o fotorresiste restantes. Enxágüe em água DI e seca com gás N 2. </li><li> Depósito 2-5 mM deposição Parileno-C (um polímero isolante) por vapor químico em um substrato tendo modelado cromo. Depósito de 50 nm de Teflon-AF (para fazer o hidrofóbico superfície) através de spin-coating uma solução (1% wt / wt em Fluorinert FC-40) a 2000 rpm por 60 s. Pós bake-em uma placa quente (160 ° C, 10 min). </li><li> Para formar a chapa de topo, um casaco. Un-padrão óxido de estanho índio (ITO) substratos de vidro de 50 nm Teflon-AF, como acima </li><li> Pós-bake ambos os substratos em um prato quente (160 ° C, 10 min). </li></ol> Parte 2: Dispositivo de Set-up e Automação <ol><li> Em digital dispositivos microfluídicos operado em &quot;dois-placa&quot; de configuração, um gotículas são posicionados entre um substrato de fundo (com eletrodos padronizados) e um substrato de topo (com um eletrodo, contíguo transparente, geralmente formado a partir de ITO). </li><li> Para definir o dispositivo acima, remover revestimentos de polímero das pastilhas de contato de um substrato de fundo, raspando gentil com um bisturi. O casal expostas almofadas do substrato de fundo com 40 pinos (Figura 1a). </li><li> Power-on um computador com LabView (National Instruments, Austin, TX), uma casa construída caixa de controle (com uma série de relés de alta tensão que são controlados por sinais de uma National Instruments DaqPad), um gerador de função, e um amplificador . A caixa de computador / controle facilita o controle do usuário sobre aplicação de 100 V RMS / 18 kHz sinais para o dispositivo através dos conectores de 40 pinos. </li><li> Montar o dispositivo de posicionamento por dois pedaços de fita dupla face (140 mM espessura total) nas bordas do substrato e completa com slides unpatterned ITO (placa superior). </li><li> Para inicializar o sistema de controle, execute o programa de calibração LabView (escrito in-house) para calibrar o controle feedback. </li><li> Carga da amostra e reagentes para os reservatórios apropriada (ver secção 3, abaixo) e colocá-los sob o substrato superior (Teflon revestido virado para baixo). Ligue o conector de terra para o substrato superior. </li><li> Carregar o código de atuação em LabView (escrito in-house) e executar o programa para iniciar atuação gota. </li></ol> Parte 3: Preparação de amostras e reagentes <ol><li> Prepare-tampão de trabalho (WB): 100 mM TrisHCl (pH 7,8) e 0,08% PLURONIC F127 w / v. </li><li> Dissolver proteína (s) a serem analisados ​​na amostra WB e pipeta no reservatório de 1 (R-1) no dispositivo, como mostrado na Figura 1b. </li><li> Prepare precipitante, 20% de ácido tricloroacético (TCA) em água DI e pipeta no R-2. </li><li> Prepare o tampão de lavagem, 70/30 Clorofórmio / acetonitrila (ACN) e pipeta no R-4. </li><li> Prepare tampão resolubilizing, 100 Bicarbonato de Amônio mM (pH 8,0) e 0,08% PLURONIC F127 w / v, e pipeta no R-5. </li><li> Dissolver redutor, tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), às 10 mM na WB e pipeta no R-6. </li><li> Dissolver agente alquilante, iodoacetamida (IAM), com 12 mM na WB e pipeta no R-7. </li><li> Dissolver tripsina na WB em uma concentração igual para 1 / 5 da concentração da amostra de proteína total (ver 3.1, acima) e pipeta no R-8. </li></ol> Parte 4: Processamento Digital Amostra microfluídicos <ol><li> O procedimento a seguir é executado automaticamente por meio de código escrito em LabView-house. O volume das gotas dispensadas dos reservatórios é definido pelas dimensões dos eletrodos (neste caso, as gotas são dispensados ​​~ 600nL). </li><li> Dispensar uma gota de proteínas contendo amostra do R-1 e uma gota de precipitante de R-2 (Figura 2, Quadro 1). Mesclar as duas gotas e permitir que a gota combinados para incubar por 5 min, resultando na precipitação de proteins sobre a superfície (Figura 2, Quadros 2-3). Accionar o sobrenadante longe da proteína precipitada para o reservatório de resíduos, R-3 (Figura 2, Quadro 4). </li><li> Dispensar três gotas de solução de lavagem a partir de R-4 e conduzi-los através da proteína precipitada para o reservatório de resíduos, R-3 (Figura 2, Quadro 5). </li><li> Permitir que o precipitado para secar, e dispensar uma gota de tampão resolubilizing de R-5 à proteína. Permitir que o buffer para incubar por 20 min até que o precipitado foi dissolvido (Figura 2, Quadro 6). </li><li> Dispensar uma gota de redutor de R-6 e mesclá-lo com a gota de amostra. Misture a gota combinado acionando-lo ao longo de 6 eletrodos em um padrão circular. Permitir a gota para incubar por 1 hora a temperatura ambiente em câmara úmida (Figura 3, Quadros 1-2). </li><li> Dispensar uma gota de agente alquilante de R-7 e mesclá-lo com a gota da amostra, seguida de mistura (como em 4.5). Permitir a gota para incubar por 15 min à temperatura ambiente em câmara úmida, protegido da luz (Figura 3, Quadros 2-3). </li><li> Dispensar uma gota de tripsina de R-8, e mesclá-lo com a gota da amostra, seguida de mistura (como em 4.5). Permitir a gota para incubar por 3 horas a 37 ° C em câmara úmida sobre uma chapa quente (Figura 3, Quadros 3-4). </li></ol> Parte 5: Pós-Processamento Preparação da Amostra <ol><li> Remover substrato superior e reação saciar a digestão pela adição de 0,6 mL de 2,5% de ácido trifluoroacético na água. </li><li> Purify produto da reação extinto usando ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) de acordo com instruções do fabricante. </li><li> Diluir em água purificada amostra DI para um volume final de 100 mL. </li></ol> Parte 6: Espectrometria de Massa <ol><li> Avaliar a amostra processada em um nano-HPLC acoplado a um espectrômetro de massa em tandem. O sistema de HPLC usado aqui é a partir Technologies Eksigent e está equipado com uma coluna de armadilha (3 mm de diâmetro. Contas C18, 150 ID M x 2,5 cm) e uma coluna de separação de fase reversa (3 mM dia. Contas C18, 75 mM ID x 15 cm). O espectrômetro de massa usada aqui é um LTQ da Thermo Fisher Scientific-. </li><li> Carregar uma amostra 2 mL para a coluna na armadilha 5μL/min em uma fase móvel composta de acetonitrila 5% em água. Separado da amostra na coluna de fase reversa em 0.5μL/min usando um gradiente linear de acetonitrila 20% a 80% acetonitrila mais de 25 min. Continuar a funcionar com 80% de acetonitrila por mais 10 min. </li><li> Analisar as bandas de eluição fora da coluna por espectrometria de massa em tandem. No trabalho aqui relatado, o eluente é amostrado no espectrômetro de massa através de um emissor nanoelectrospray (20 mM ID reduzida para 10 ID mm) de NewObjective. </li><li> Identificar as proteínas da amostra usando um programa de pesquisa de banco de dados, tais como SEQUEST. Neste trabalho, foi utilizada a versão do SEQUEST incorporadas Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), e proteínas identificadas tiveram escores probabilidade de menos de 1.0E-03 (equivalente a 99,9% intervalo de confiança), e coberturas na seqüência de pelo menos 30% (Figura 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> Figura 1. (A) Uma imagem de um dispositivo acoplado a DMF 40 pinos para atuação gota automatizado. (B) Um esquema de um dispositivo que descreve o posicionamento de amostra e reagentes necessários para um workup proteômica. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> Figura 2. Quadros de um filme retratando a extração automatizada e purificação da BSA no TCA 20% (precipitante) e acetonitrila% 70/30 clorofórmio / (Solução de lavagem). No quadro 6, a proteína é precipitado redissolvido em uma gota de bicarbonato de amônio 100 mM. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> Figura 3. Quadros de um filme ilustrando redução seqüencial, alquilação e digestão de uma gota de proteína ressolubilizam. Nesta figura, os reagentes são tingidos com corantes para maior clareza, na prática, os reagentes não são coloridos. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> Figura 4. Cromatograma MS de uma amostra de albumina bovina processada por microfluídica digital. 25 peptídeos distintos foram identificados (99,9% intervalo de confiança) correspondente seqüência de uma cobertura de 44%.

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	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

A falta de manuseio de amostras e processamento padronizados em proteômica é uma grande limitação para o campo. Além disso, o manuseamento da amostra convencional macroescala envolve vários containers e transferências de solução, que pode levar à perda de amostra e de contaminação. Uma solução potencial para estes problemas é a forma de sistemas integrados para o processamento da amostra depender digitais microfluídica 1 (DMF). Em trabalhos anteriores, DMF mostrou-se útil para a remoção eficiente de contaminantes indesejados no heterogêneo de proteínas contendo soluções. 2 Da mesma forma, DMF mostrou-se compatível com a integração das várias etapas de processamento de solução de fase (alquilação, redução e digestão), em um sistema integrado dispositivo. 3 Aqui, nós demonstramos um sistema totalmente integrado com controle automatizado para a extração de gotículas de proteína por precipitação seguido pela solução de fase de processamento. Nós especulamos que, se tais métodos como estes são amplamente adotado, o erro humano inerente ao processamento das amostras proteômica pode ser largamente eliminada, resultando em análises com melhor reprodutibilidade. Em resumo, propomos que DMF tem o potencial para ser útil para um amplo leque de aplicações, como as condições podem ser precisamente duplicado em qualquer laboratório do mundo.

digital microfluidics for automated proteomic processing

Proteômica clínica surgiu como uma disciplina nova e importante, prometendo a descoberta de biomarcadores que serão úteis para o diagnóstico precoce e prognóstico da doença. Enquanto os métodos clínicos proteômica variam muito, uma característica comum é a necessidade de (i) extração de proteínas a partir de fluidos extremamente heterogênea (ou seja, soro, sangue total, etc) e (ii) o tratamento extensivo bioquímicos antes da análise. Aqui, nós relatamos uma nova digitais microfluídica (DMF) método baseado integrar várias etapas de processamento utilizado em proteômica clínica. Isto inclui a extração de proteínas, resolubilization, redução, alquilação e digestão enzimática. Digital microfluídica é uma técnica de manipulação de fluidos em microescala em que gotículas nanolitros-microlitro empresas são manipulados em uma superfície aberta. Gotículas são posicionados no topo de uma série de eletrodos que são revestidas por uma camada dielétrica - quando um potencial elétrico é aplicado para a gota, as cargas se acumulam em cada lado do dielétrico. As taxas servem como alças eletrostática que pode ser usado para controlar a posição das gotas, e por uma seqüência de polarização de eletrodos em série, as gotas podem ser feitas para dispensar, mover, fundir, misturar e dividir na superfície. Portanto, DMF é um ajuste natural para a realização rápida, de várias etapas, seqüencial, miniaturizados automatizado ensaios bioquímicos. Isto representa um avanço significativo em relação aos métodos convencionais (contando com pipetagem manual ou robôs), e tem o potencial para ser uma ferramenta útil em proteômica nova clínica. Mais J. Jebrail, Vivienne N. Lucas e Steve CC Shih contribuíram igualmente para este trabalho. Endereço atual Sergio LS Freire é da Universidade de Ciências da Filadélfia localizado na 600 South 43 Street, Philadelphia, PA 19104.

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

A microfluídica Digital é uma técnica caracterizada pela manipulação de gotículas discretas (~ nL - mL) em uma matriz de eletrodos pela aplicação de campos elétricos. É bem adequado para a realização rápida, seqüencial, miniaturizados automatizado ensaios bioquímicos. Aqui, nós relatamos uma plataforma capaz de automatizar várias etapas de processamento proteômica.

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K visualizações.  University of Toronto. A microfluídica Digital é uma técnica caracterizada pela manipulação de gotículas discretas (~ nL - mL) em uma matriz de eletrodos pela aplicação de campos elétricos. É bem adequado para a realização rápida, seqüencial, miniaturizados automatizado ensaios bioquímicos. Aqui, nós relatamos uma plataforma capaz de automatizar várias etapas de processamento proteômica.

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Biologia

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Estudos de Quimiotaxia bacteriana Usando microfluídica - Entrevista

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Aplicando a microfluídica Eletrofisiologia

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Desenvolvimento de novas aplicações terapêuticas Usando microfluídica

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Análise immunoblot

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Coloração Proteínas em Gel

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...