Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

A técnica aqui descrita pode ser usada para identificar isoformas específicas da cadeia pesada de miosina (MHC) em segmentos de fibras musculares individuais usando dot blotting, doravante referido como detecção de cadeia pesada de Myosin por Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Este protocolo descreve o processo de liofilização do músculo esquelético humano e o isolamento de segmentos de fibras musculares únicas. Usando MyDoBID, as fibras do tipo I e II são classificadas com anticorpos MHCI- e IIa-específicos, respectivamente. As fibras classificadas são então combinadas em amostras específicas do tipo de fibra para cada biópsia.

A proteína total em cada amostra é determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e tecnologia de gel ativado por UV. O tipo de fibra das amostras é validado usando western blotting. A importância de realizar a normalização da carga proteica para melhorar a detecção de proteínas-alvo em vários western blots também é descrita. Os benefícios da consolidação de fibras classificadas em amostras específicas do tipo de fibra em comparação com as blots ocidentais de fibra única incluem versatilidade da amostra, maior rendimento da amostra, menor investimento de tempo e medidas de economia de custos, tudo isso enquanto retém informações valiosas específicas do tipo de fibra que são frequentemente negligenciadas usando amostras musculares homogeneizadas. O objetivo do protocolo é obter a identificação precisa e eficiente de fibras tipo I e tipo II isoladas de amostras de músculo esquelético humano liofilizado.

Essas fibras individuais são posteriormente combinadas para criar amostras específicas do tipo I e do tipo II de fibras. Além disso, o protocolo é estendido para incluir a identificação de fibras do tipo IIx, usando Actina como marcador para fibras negativas para MHCI e MHCIIa, que são confirmadas como fibras IIx por western blotting. Cada amostra específica do tipo de fibra é então usada para quantificar a expressão de várias proteínas-alvo usando técnicas de western blotting.

O músculo esquelético é um tecido heterogêneo, com propriedades metabólicas e contráteis celulares distintas que dependem se a célula (fibra) é de contração lenta (tipo I) ou contração rápida (tipo II). O tipo de fibra pode ser identificado examinando-se as isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC), que diferem entre si de várias maneiras, incluindo tempo de contração, velocidade de encurtamento e resistência à fadiga¹. As principais isoformas de MHC incluem tipo I, tipo IIa, tipo IIb e tipo IIx e seus perfis metabólicos são oxidativos (tipo I e IIa) ou glicolíticos (IIx, IIb)¹. A proporção desses tipos de fibras varia no tipo muscular e entre as espécies. O tipo IIb é amplamente encontrado no músculo de roedores. A musculatura humana não contém fibras do tipo IIb e é constituída predominantemente pelas isoformas MHC do tipo I e IIa, com pequena proporção de fibras IIx². Os perfis de expressão proteica variam entre os diferentes tipos de fibras e podem ser alterados com o envelhecimento³, exercício ^4,5 e doença 6.

A medição das respostas celulares em diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas é frequentemente negligenciada ou não é possível devido ao exame de homogeneizados musculares (uma mistura de todos os tipos de fibras). O western blot de fibra única permite a investigação de múltiplas proteínas em fibras musculares individuais⁷. Esta metodologia foi previamente utilizada para produzir características novas e informativas de monofibra que não foram possíveis de obter usando preparações homogeneizadas. No entanto, existem algumas limitações da metodologia original de western blot de fibra única, incluindo a natureza demorada, a incapacidade de gerar réplicas de amostra e o uso de reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) caros e sensíveis. Se o tecido fresco está sendo usado, este método é ainda mais limitado devido às restrições de tempo da necessidade de isolar fibras individuais dentro de um período de tempo limitado (ou seja, 1-2 h). Felizmente, essa restrição é atenuada pelo isolamento de segmentos monofibrosos do tecido liofilizado⁸. No entanto, a coleta de fibras de amostras liofilizadas é limitada pelo tamanho e qualidade do tecido biopsiado.

A identificação do tipo de fibra usando o método dot blotting⁹ foi significativamente elaborada e expandida neste protocolo abrangente. Previamente, foi demonstrado que apenas ~2-10 mg de tecido muscular de peso úmido é adequado para liofilização e análise de proteína de isoforma MHC de fibra única⁹. Christensen et ^al.9 utilizaram 30% de um segmento de fibra de ~1 mm para detectar a isoforma MHC presente por dot blotting, o que foi confirmado por western blotting. Este trabalho mostrou que, ao substituir o western blotting pelo dot blotting, os custos totais foram reduzidos em ~40 vezes (para 50 segmentos de fibra). As fibras foram então "agrupadas" em amostras do tipo I e tipo II, o que permitiu a replicação experimental⁹. No entanto, uma limitação foi que apenas duas amostras específicas do tipo de fibra foram obtidas: tipo I (MHCI positivo) e tipo II (MHCII positivo), com amostras do tipo II contendo uma mistura de MHCIIa e MHCIIx ^6,10. Notavelmente, o protocolo atual demonstra como as fibras do tipo IIx puras podem ser identificadas e fornece um fluxo de trabalho altamente detalhado (resumido na Figura 1), incluindo estratégias de solução de problemas para problemas comuns de protocolo.

Amostras de músculo humano foram obtidas do vasto lateral de n = 3 (2 homens, 1 mulher), com idade entre 70 e 74 anos, em condições estéreis, utilizando-se anestesia local (xilocaína) e agulha de Bergstrom modificada para sucção manual^11,12. As amostras foram um subconjunto de um estudo prévio aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Victoria University (HRETH11/221) e conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque¹³. Os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar deste estudo. Todos os detalhes de todos os materiais necessários para este protocolo são mostrados na Tabela de Materiais. Além disso, uma lista de estratégias de solução de problemas que abordam problemas comuns de protocolo é fornecida na Tabela 1.

1. Liofilização

1. Enquanto mantém as amostras musculares biopsiadas congeladas em gelo seco, pesar e amarrar um tubo congelado vazio na balança.
2. Pesar rapidamente um mínimo de 10 mg de tecido congelado de peso úmido. Registre o peso com uma casa decimal.
3. Deposite o tecido no tubo de microcentrífuga pré-resfriado que teve 3-4 furos perfurados na tampa e coloque-o em um pequeno copo com 2-3 pellets de gelo seco.
4. Siga as instruções de operação do fabricante do liofilizador.
5. Certifique-se de que todas as válvulas do liofilizador estão fechadas e ligue o liofilizador.
6. Use o painel de controle para verificar se o ponto de ajuste de vácuo está programado para condições ideais de liofilização para o tecido humano, 0,12 milibar (mBar) (Figura 2).
7. Pressione manualmente no liofilizador e aguarde até que a câmara tenha esfriado a -40 ^oC.
8. Uma vez que a câmara tenha atingido essa temperatura, remova a tampa, depois a câmara de vidro e coloque o copo (com amostra muscular) no palco de metal.
9. Substitua a câmara de vidro e a tampa. Feche a válvula de liberação de vácuo na tampa e aguarde até que a luz da balança de vácuo fique verde para garantir que o secador esteja selado a vácuo.
10. Liofilizar as amostras musculares por 48 h. Quando a liofilização estiver concluída, desligue a bomba de vácuo pressionando o botão de vácuo e abra a válvula de liberação de vácuo na tampa.
11. Retire a tampa da câmara e recolha a amostra liofilizada. Pese o tecido e registre o peso com uma casa decimal.
12. Calcular a porcentagem de perda de peso; ~75% de diminuição no peso indica que o tecido é liofilizado com sucesso (neste trabalho, média ± DP, 76 ± 9%, n = 11 amostras musculares).
13. Pressione AUTO para desligar a bomba de vácuo e o freezer. Permita que a unidade atinja a temperatura ambiente.
14. Limpe as bobinas de resfriamento de acordo com as instruções do fabricante e escorra o líquido acumulado do coletor.
    NOTA: A coleta de fibra pode começar imediatamente. Quando o tecido não estiver sendo usado para isolamento de fibras, mantenha a amostra liofilizada a -80 °C em um recipiente selado com esferas de exsicador.  CUIDADO: O gelo seco é perigoso (Classe 9); consulte a FISPQ para obter o manuseio seguro recomendado.

2. Coleta de fibras

1. Preparação da coleta de fibras
   1. Rotular um mínimo de 50 tubos de microfuga (Fibra 1 a 50) e pipetar 10 μL de tampão desnaturante para cada tubo.
   2. Preparar a área de coleta com dois pares de pinças dissecadoras de tecido fino, tecido sem fiapos, lâmpada de bancada, estereomicroscópio (com o estágio preto para cima), vórtice e centrífuga de bancada.
   3. Coloque a amostra de músculo liofilizado em uma tampa de placa de Petri. Coloque a tampa no palco do microscópio dissecante.
   4. Assista ao vídeo da dissecção de fibra única. Pratique o protocolo completo desde a coleta de fibras até a identificação do tipo de fibra única pelo menos duas vezes antes de iniciar um estudo.
   5. Antes da coleta de fibras, calcule o volume total necessário para uma amostra do tipo fibra de cada biópsia da seguinte maneira. Por exemplo, se o volume inicial de 1 fibra = 10 μL e o volume restante após MyDoBID for (1 fibra × 10 μL) - 1 μL usado para dot blotting = 9 μL (volume de amostra), calcule o volume total de amostra necessário multiplicando o volume de amostra (μL) pelo número total de western blots que serão executados e dobre esse valor para explicar a redundância: (9 μL × 4 western blots) × 2 = 72 μL. Calcule o número de fibras necessárias por amostra tipada dividindo o volume final de amostra necessário (μL) pelo volume de amostra por amostra específica do tipo de fibra (por exemplo, 72 μL ÷ 9 μL = 8 fibras por amostra específica do tipo de fibra). Para que isso seja alcançado, colete um total de 50 fibras.
      NOTA: O volume de amostra necessário é a concentração mínima de proteína necessária para executar o MyDoBID e o western blotting se a quantidade de proteína carregada for equivalente a uma fibra de ~3 mm (~12 μg de peso úmido) para cada amostra (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes). No entanto, esse volume não leva em consideração se géis repetidos são necessários para uma determinada proteína.  CUIDADO: As pinças são afiadas; Manuseiá-los com cuidado para evitar o risco de perfuração da pele.
2. Isolamento de fibra única
   1. Em um pequeno pedaço de papel de 5 cm x 1 cm, use uma régua para desenhar uma linha de 1 cm. Marque a cada 1 mm nessa linha.
   2. Inserir sob a tampa da placa de Petri como guia para estimar o comprimento das fibras coletadas.
   3. Colocar a amostra de músculo liofilizado sob o estereomicroscópio em pequena magnificação (x 7,5). Use um par de pinças dissecadoras de tecido fino para manter o músculo liofilizado no lugar e com o outro comece a separar pequenos feixes de fibras (como visto no vídeo).
   4. Isole um feixe de fibras e continue a separar até que segmentos únicos de fibra sejam isolados do feixe.
   5. Coletar um mínimo de 50 fibras que tenham pelo menos ~1 mm de comprimento.
   6. Mova a fibra para um espaço vazio na placa de Petri. Inspecione segmentos de fibra única sob maior ampliação (x 50). Certifique-se de que é uma única fibra, separando ainda mais a fibra na extremidade. Se a fibra quebra em vez de se separar, é uma única fibra.
3. Desnaturação de fibras
   1. Usando pinças, colete suavemente a fibra e coloque-a diretamente no tampão desnaturante aliquotado (não deixe a pinça encontrar o tampão).
   2. Verifique a pinça sob o microscópio para garantir que a fibra foi removida com sucesso. Feche o tubo e bata firmemente o fundo do tubo no banco três vezes para garantir que a fibra se mova para o tampão.
   3. Limpe a pinça usando tecido sem fiapos antes de passar para a próxima fibra. Repita esse processo até que todas as fibras sejam coletadas.
   4. Vórtice as amostras de fibra e centrifugue brevemente por 5 s a 2.500 × g para puxar a amostra para o fundo do tubo.
      NOTA: A duração da centrifugação (5 s) é cronometrada desde o início (0 × g) até que a velocidade atinja ~2.500 × g.
   5. Deixar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h. Conservar a -80 °C para utilização futura. Congelar e depois descongelar as amostras antes de usar.

3. Ponto blotting

1. Preparo e ativação de membranas
   1. Meça, rotule e corte para dimensionar uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (tamanho de poro de 0,2 μm) para caber 50 amostras (~10,5 cm x 5,5 cm).
   2. Marque a borda esquerda numericamente de cima para baixo (1 a 10) e a borda superior em ordem alfabética da esquerda para a direita (A a E) espaçada 1 cm de distância.
   3. Prepare quatro folhas de papel filtro com as dimensões de 12,5 cm x 7,5 cm.
   4. Amontoe duas folhas para formar uma pilha. Pré-mergulhe a pilha de papel de filtro em 1x buffer de transferência.
   5. Coloque a membrana em um recipiente. Despeje etanol 95% sobre a membrana, com volume suficiente para imergir totalmente a membrana (10-15 mL). Agite no balancim por 1 min.
   6. Recolha novamente o etanol, mergulhe a membrana em 1x tampão de transferência (~15 mL) e rocha por mais 2 min.
      NOTA: Tanto o etanol quanto o tampão de transferência podem ser reutilizados para futuros experimentos de dot blotting até que a sedimentação se forme (mudança após seis usos).
   7. Coloque a pilha de papel de filtro embebida em buffer de transferência em uma superfície plana móvel, como uma tampa grande, e achate com o rolo. Posicione a membrana de PVDF na pilha usando um liberador de gel ou uma pinça.
   8. Coloque uma única folha de papel de filtro seco sobre a membrana e mova o rolo sobre o papel de filtro para absorver qualquer excesso de tampão na superfície da membrana. Retire o papel de filtro superior sem esfregar a membrana.
      CUIDADO: O metanol (Classe 3, sub-risco 6.1) e o etanol (Classe 3) são perigosos. Consulte a ficha de dados de segurança do material (FISPQ) para obter recomendações de manuseio seguro.
2. Absorção da amostra para a membrana
   1. Descongelar as amostras de fibras, efectuar uma breve centrifugação (5 s) à temperatura ambiente como no passo 2.3.4 e misturar bem a amostra.
   2. Sem tocar a membrana com a ponta da pipeta, deposite lentamente uma gota de ~1 μL de cada amostra na membrana na área designada. As dimensões da área designada por amostra de fibra são ~1 cm x 1 cm. Procure identificar a amostra no centro desta área.
   3. Deixe as gotículas da amostra de molho através da membrana por pelo menos 15 min. Certifique-se de que nenhum buffer de amostra permaneça e seja completamente absorvido.
   4. Usando pinças de plástico, levante cuidadosamente a membrana da pilha de papel de filtro úmida, coloque-a em uma única folha seca de papel de filtro e desidrate a membrana por pelo menos 5 minutos.
   5. Quando os pontos da amostra ficarem completamente brancos, reative a membrana.
3. Reativação e bloqueio da membrana
   1. Reactivar a membrana repetindo os passos 3.1.5 e 3.1.6.
   2. Coloque a membrana em tampão de lavagem e enxágue por 5 min com balanço. Descarte o tampão de lavagem.
   3. Incubar a membrana em tampão de bloqueio por 30 min enquanto balança.
   4. Enxágue a membrana 3x com tampão de lavagem até que o tampão não esteja mais turvo.
   5. Deixe a membrana na lavagem final no balancim.

4. Imunomarcação

1. Detecção de MHCIIa
   1. Diluir o anticorpo primário MHCIIa a 1 em 200 em 10 mL de tampão de albumina de soro bovino (BSA).
   2. Descarte o tampão de lavagem da membrana e, em seguida, despeje o anticorpo MHCIIa diluído na membrana.
   3. Coloque o recipiente (com a membrana em MHCIIa) no balancim à temperatura ambiente durante 2 h ou a 4 °C durante a noite.
   4. Recolher novamente o anticorpo MHCIIa e armazená-lo a 4 °C. Lave a membrana com tampão de bloqueio por 2 min no balancim.
      NOTA: Todos os anticorpos primários podem ser reutilizados até cinco vezes mais, desde que o tampão permaneça limpo.
   5. Enxágue mais duas vezes; 5 min de cada vez; três lavagens no total.
   6. Diluir o anticorpo secundário da Imunoglobulina G Horseradish Peroxidase (IgG-HRP) de camundongo a 1 em 20.000 em 10 mL de tampão de bloqueio e adicionar à membrana.
   7. Descarte o tampão de lavagem e incube a membrana em camundongo IgG-HRP secundário com balanço por 1 h.
   8. Descarte o secundário e lave a membrana em tampão de lavagem (2, 5, 5 min).
   9. Deixe a membrana de molho na lavagem final até ficar pronta para a aquisição de imagens.
   10. Ligue o imageador de gel, aguarde 15 minutos até que o imageador atinja a temperatura de operação necessária e, em seguida, abra o software de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
   11. Na janela do software, clique em New Single Channel Protocol (Novo protocolo de canal único ) (Figura 3A). Para uma imagem de luz branca da membrana, em Aplicações | Manchas | clique em Colorimétrico (Figura 3B).
   12. Clique na área do gel; Cada opção é programada para dimensões específicas para se ajustar ao tamanho de vários tipos de gel. Selecione a opção apropriada para melhor se ajustar às dimensões da membrana (Figura 3C).
   13. Preparar a LCE combinando reagentes de luminol e peroxidase na proporção de 1:1. Faça um volume suficiente de mistura de ECL para cobrir toda a membrana, normalmente um volume total de 800-1.000 μL é necessário.
   14. Coloque a membrana em uma grande bandeja de plástico transparente e disperse a mistura de ECL na membrana.
   15. Coloque a membrana sobre a placa de imagem.
   16. Clique em Position Gel (botão amarelo) para uma visualização ao vivo da câmera. Clique em segurar e arraste o botão de zoom para maximizar a área de imagem da membrana. Neste ponto, endireitar a posição da membrana, se necessário.
   17. Clique em Executar protocolo (botão verde) e aguarde até que uma imagem colorimétrica da membrana seja produzida. Salve esta imagem para ajudar a combinar os pontos com a amostra de fibra correspondente.
   18. Sem mover a membrana, altere o aplicativo no software clicando na opção para um binning 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Figura 3D).
   19. Em Exposição de imagem e software, otimize o tempo de exposição, clique em Bandas fracas (Figura 3E) | Modo de Acumulação de Sinais.
   20. Em Setup, digite 1 s para a primeira imagem, 30 s para a última imagem e 30 imagens totais (Figura 3F).
   21. Clique em Executar protocolo.
   22. Salve uma imagem nos seguintes estágios: antes da saturação do sinal (todos os pontos visíveis são pretos), saturação inicial do sinal (alguns pontos começam a saturar) e pontos supersaturados (todos os pontos com sinal forte detectado estão saturados).
   23. Salve todas as imagens necessárias antes de terminar o acúmulo de sinal. Retire a membrana do imageador.
   24. Usando o liberador de gel, coloque a membrana de volta no recipiente com o tampão de lavagem.
2. Detecção de MHCI
   1. Deite o tampão de lavagem e trate a membrana com tampão de remoção durante 30 minutos a 37 °C (certifique-se de que a membrana está completamente imersa).
   2. Recolha novamente o tampão de decapagem e lave a membrana em tampão de lavagem durante 5 minutos com balanço.
      NOTA: O buffer de remoção pode ser reutilizado 10x antes de descartar.
   3. Despeje o tampão de lavagem e, desta vez, aplique o anticorpo primário MHCI diluído em uma concentração inicial de 1 em 200 (intervalo: 1 em 200 a 1 em 500). Balançar a membrana à temperatura ambiente por 1 h.
   4. Após incubar no anticorpo primário MHCI, recolher novamente o anticorpo e lavar a membrana como nos passos 4.1.4 e 4.1.5.
   5. Diluir o anticorpo secundário HRP IgM de camundongo no tampão de bloqueio a 1 em 20.000. Despeje o tampão de bloqueio da membrana e incube na IgM secundária do camundongo como na etapa 4.1.7.
   6. A lavagem e captura de imagens detectou MHCI como nas etapas 4.1.8 a 4.1.24.
      CUIDADO: O tampão de decapagem contém Organo Phosphine 3-5% (Classe 8). Consulte a FISPQ para obter recomendações de manuseio seguro.
3. Detecção de MHCIIx potencial usando Actina
   1. Retire novamente a membrana (passos 4.2.1 e 4.2.2).
   2. Repetir a secção 4.1, desta vez aplicando o anticorpo primário Actin diluído a 1 em 500 em tampão BSA e, em seguida, o anticorpo secundário HRP de coelho diluído a 1 em 20.000 em tampão de bloqueio.

5. Identificação do tipo de fibra

1. Análise de sinais MHCI, MHCIIa e Actin
   1. Familiarize-se com o painel de intensidade de sinal (Figura 4A). Anote as etapas 5.1.2 a 5.1.4.
   2. Uma intensidade de sinal saturada qualitativamente indica que a detecção de proteínas é forte.
   3. Um moderado indica que a proteína-alvo está presente em um nível médio.
   4. Um sinal fraco indica que pouca proteína alvo está presente.
   5. Use o painel de intensidade de sinal para categorizar as fibras com intensidade de sinal 'saturada', 'moderada' ou 'fraca' (Figura 4A).
   6. Realizar a identificação do tipo de fibra comparando primeiro os resultados de MHCIIa e MHCI (Figura 4B, borrões esquerdo e médio).
   7. Registrar fibras com intensidade de sinal saturada ou moderada de apenas uma isoforma do MHC.
   8. Se o sinal da isoforma MHC for "fraco", deixe a fibra sem marcação (ver Figura 4B).
   9. Por fim, quando a actina for observada (intensidade de sinal moderada ou saturada) nas fibras sem MHCI ou IIa detectadas, registe-a como uma potencial fibra do tipo IIx (Figura 4B, right blot).
   10. Registrar fibras com fraco sinal de isoforma MHC, mas Actina detectada (intensidade moderada ou saturada) como não identificada.
   11. Descarte amostras com detecção fraca ou nenhuma (nenhuma fibra coletada) para as três proteínas-alvo (Figura 4C).
   12. Grave qualquer fibra onde os sinais MHCI e MHCII são detectados com um sinal "saturado" ou moderado. Essas amostras não são para uso em preparação específica do tipo de fibra.
2. Preparação de amostras específicas do tipo de fibra
   1. Preparar uma amostra separada do tipo I e do tipo II para cada biópsia. Para uma amostra do tipo II, combinar o número mínimo necessário de fibras (calculado no passo 2.1.5) em que o MHCIIa é detectado em níveis saturados ou moderados.
   2. Em um tubo separado marcado como tipo I, repita esse processo para as fibras nas quais MHCI é detectado (Figura 4D).
   3. Use fibras com intensidade de sinal moderada se não houver fibras suficientes com sinais saturados.
   4. Combine quaisquer fibras IIx potenciais.
   5. Use imediatamente amostras específicas do tipo de fibra para western blotting ou armazene-as a -80 °C para uso futuro.

6. Confirmação do tipo de fibra Western blot

1. Utilizar 10 μL de cada amostra específica do tipo de fibra (o volume mínimo de amostra necessário, ver passo 2.1.5).
2. Separe as amostras usando o gel pré-moldado especificado via SDS-PAGE de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Use um imageador de gel para detectar a proteína no gel de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Coloque o gel em tampão de transferência frio de 1x por 10 min.
5. A umidade transfere as proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Após a transferência, lave brevemente a membrana com H₂O ultrapuro em um recipiente. Despeje a água ultrapura.
7. Adicionar 10 mL de solução intensificadora de sinal de anticorpos à membrana e rocha à temperatura ambiente por 10 min.
8. Recolher a solução potenciadora de sinal de anticorpos e lavar 5x (5 s por lavagem) com H₂O ultrapuro.
   NOTA: A solução realçadora de sinal de anticorpos pode ser usada 5x antes de descartar.
9. Despeje a última lavagem, adicione a solução de bloqueio e agite em temperatura ambiente por 1 h.
10. Use uma lâmina de bisturi ou tesoura limpa para cortar horizontalmente a membrana a um peso molecular que garanta que as proteínas com 180 kDa ou acima estejam na seção superior da membrana.
11. Use esta seção superior para confirmação adicional do tipo de fibra.
12. Use a porção abaixo de 180 kDa para detectar diferentes proteínas-alvo.
13. Na secção superior da membrana, siga a secção 4.1 com MHCIIx primário e anticorpo secundário HRP para a imunoglobulina M (IgM) em ratinhos.
14. Retirar a membrana (conforme descrito nas secções 4.2.1 e 4.2.2) antes de repetir o processo com o anticorpo MHCIIa IgG primário e o anticorpo secundário IgG HRP de ratinho.
15. Retirar mais uma vez e, finalmente, aplicar o anticorpo MHCI IgM primário e o anticorpo secundário IgM HRP de camundongo.
    NOTA: Esta etapa é qualitativa e, portanto, qualquer perda de proteína devido à remoção de membrana não é uma preocupação.
16. Comparar o sinal detectado nas diferentes isoformas do MHC (como visto na Figura 5B). Quando a intensidade de sinal for detectada em níveis moderados a saturados na amostra esperada (MHCI - tipo I, MHCIIa - tipo II e MHCIIx - tipo IIx) as amostras específicas do tipo fibra serão registradas como confiáveis para uso em estudos futuros.
17. Registrar a amostra como não confiável quando mais de uma isoforma MHC é igualmente detectada em uma amostra.
    CUIDADO: Solução potenciadora de anticorpos contém hidróxido de sódio a 50%. Consulte a FISPQ para obter recomendações de manuseio seguro.

Identificação de fibras musculares MHCI, MHCIIa e MHCIIx individuais usando dot blotting
Uma característica do MyDoBID é a categorização da variação da intensidade de sinal MHC e Actina em uma dada fibra (Figura 4A). O tipo de fibra foi identificado pela presença ou ausência das isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras não apresentaram detecção de MHC ou actina, indicando que não houve coleta de fibras. Os resultados desse dot blot específico foram a identificação de 22 fibras do tipo II, 7 fibras do tipo I e 3 potenciais fibras do tipo IIx; 2 amostras não identificadas e 6 amostras foram classificadas como 'Sem Fibra' coletadas (Figura 4B, C). Fibras que ainda não apresentavam nenhum sinal MHCI ou MHCIIa detectável foram positivas para Actina foram identificadas como potenciais fibras do tipo IIx por um processo de eliminação. Usando o painel de intensidade de sinal para classificar a intensidade do sinal MHCI e IIa, fibras "moderadas" ou "saturadas" foram combinadas para produzir amostras do tipo I ou II, respectivamente. As fibras não identificadas ou com desmaio ou ausência de actina não foram incluídas nas análises subsequentes e descartadas (Figura 4D).

Confirmação de tipagem de fibra usando western blotting
As amostras específicas do tipo de fibra foram validadas usando western blotting e anticorpos MHC-específicos (Figura 5). Amostras de fibras tipo I e tipo II de uma biópsia individual foram realizadas juntamente com uma amostra tipo IIx, que foi uma amostra de fibras potenciais do tipo IIx de dois indivíduos, devido ao baixo número de fibras tipo IIx presentes em cada biópsia. Os dados do Western blot confirmaram que a identificação do tipo de fibra foi bem-sucedida.

Figura 1: Resumo do fluxo de trabalho descrevendo a preparação da amostra, a tipagem de fibras e a confirmação da especificidade da fibra por western blot . (A) O tecido humano é liofilizado por 48 h. (B,C) Segmentos de fibra única são isolados em microscópio dissecante. (D) As fibras são desnaturadas e (E) após 1 h, armazenadas a -80 °C. (F) Ordem de incubação de anticorpos primários. (G) As fibras foram dot blotted e o tipo de fibra identificado usando MHCIIa (tipo II), MHCI (tipo I) e actina (IIx?, potencial fibra tipo IIx). (H) As fibras foram então agrupadas. (I) Amostras específicas do tipo de fibra juntamente com uma curva de calibração são analisadas via SDS PAGE e western blotting. (J) Validação da identificação do tipo de fibra por western blotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Tela de exibição e painel de controle do sistema de liofilização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Configurações do imageador para captura de luz branca da membrana seguida de detecção quimioluminescente de proteínas-alvo. Para obter imagens da membrana sob luz branca, (A) selecione Novo Canal Único seguido de (B) Blots | aplicação colorimétrica . (C) Com base no tamanho do gel usado, selecione a área de imagem apropriada e, em seguida, obtenha uma imagem de luz branca pressionando Run Protocol. (D) Sem mover a membrana, repita o passo B , mas desta vez, escolhendo Blots | Chemi Hi Resolução. Antes de pressionar executar, escolha (E) Exposição de imagem para otimizar para bandas fracas e (F) configure o modo de acumulação de sinal e, em primeira instância, defina o tempo de exposição para cada segundo para um total de 30 s com pixels saturados de realce marcados. Pressione Executar protocolo e permita que a execução seja concluída antes de selecionar as melhores imagens para salvar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Identificação do tipo de fibra. (A) Os tipos de fibras foram identificados em relação a todas as outras fibras na membrana, categorizados pelo painel de intensidade de sinal para cada isoforma MHC detectada (por exemplo, sinal MHCI: Saturado, Moderado e Fraco). (B) Usando o painel em (A), o anticorpo MHCIIa identificou fibras do tipo II (azul, left blot) e, após a remoção da membrana, o anticorpo MHCI identificou fibras do tipo I (vermelho, middle blot). O anticorpo actina foi usado para identificar potenciais fibras IIx se um sinal positivo de actina fosse detectado em fibras onde nenhum sinal MHCI ou IIa prévio foi detectado (verde, right blot). As fibras que não seguiram essas orientações são destacadas em roxo (não identificadas). Por fim, amostras negativas para o sinal de Actina indicaram que nenhuma fibra havia sido coletada ('No Fiber'). (C) Tabela que mostra a marcação das fibras correspondente à posição da amostra nos pontos mostrados em (B). (D) Esboço da seleção de fibras para a preparação de amostras específicas do tipo de fibra. O objetivo foi coletar 10 fibras saturadas para cada tipo de fibra. Aqui, para as fibras do tipo II, oito fibras saturadas foram identificadas e agrupadas. Para as fibras do tipo I, menos de 10 fibras saturadas estavam presentes, de modo que fibras com moderada intensidade de sinal também foram selecionadas. Para as fibras do tipo IIx, duas fibras foram identificadas e agrupadas. Se menos de 10 fibras (saturadas e moderadas) forem identificadas, pode ser necessária uma coleta adicional de fibras.  NOTA: O sinal de Actina mostrado em (B) não atingiu a saturação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Confirmação do Western blot da identificação do tipo de fibra. A identificação do tipo de fibra foi realizada conforme Figura 4 para gerar amostras do tipo I (~10 fibras) e do tipo II (~10 fibras). Como não foram identificadas fibras IIx a partir de uma mesma biópsia, a amostra IIx aqui apresentada foi produzida a partir de mais de uma amostra muscular (n = 2 indivíduos). Uma pequena alíquota de cada amostra específica de fibra é analisada por western blotting para confirmar a identificação do tipo de fibra. Marcadores de peso molecular (kDa) são indicados à esquerda, captados sob luz branca sem movimentação da membrana. As proteínas-alvo são detectadas na sequência de MHCIIx, MHCIIa e MHCI, com a miosina do gel ativado por UV indicando visualmente a quantidade de proteína carregada por amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Estratégias de solução de problemas para problemas comuns de protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Cálculo da massa de fibras liofilizadas utilizando uma curva de calibração. Clique aqui para baixar este arquivo.

Coleção de fibras
Com base em vários anos de experiência, a maioria dos pesquisadores pode dominar essa técnica; no entanto, a prática leva a uma coleta de fibra mais rápida e eficiente para análises a jusante. Para poder isolar 30 segmentos de fibra única de qualidade para pooling, recomenda-se que sejam coletados 50 segmentos de fibra por amostra. Estudar o vídeo de coleta de fibras cuidadosamente e depois de realizar duas sessões de prática (~50 fibras por sessão) é recomendado para alcançar um padrão razoável. Todas as fibras coletadas passam pelo MyDoBID para identificar o tipo de fibra, o que revelará a eficácia da técnica está sendo realizada. Isto seria visto como um baixo número de sinal MHC "sem fibra" ou "fraco" detectado em amostras de fibra (ver secção 5.1 do protocolo).

Sabe-se que o músculo pode conter fibras híbridas, onde tanto MHCI e MHCIIa estão presentes, ou MHCIIa e IIx ^2,14. Uma limitação do MyDoBID é que a presença de uma fibra híbrida não pode ser determinada porque uma amostra positiva para ambos os anticorpos MHCI e MHCIIa poderia ser uma fibra híbrida ou que duas fibras foram coletadas. Além disso, MyDoBID não pode detectar MHCIIa separadamente dos híbridos MHCIIa/IIx, pois o anticorpo primário MHCIIa detectaria a presença de MHCIIa em fibras IIa e IIa/IIx. Por esses motivos, não foi realizada a identificação e o preparo de amostras de fibras híbridas, sendo descartadas amostras que apresentassem sinais MHCI e MHCIIa fora das faixas descritas no painel de intensidade de sinal (Figura 4A). Outra limitação é que a proporção de tipos de fibras musculares em uma amostra não pode ser determinada usando MyDoBID, e a aplicação de análises imunoistoquímicas convencionais é necessária para determinar a distribuição do tipo de fibra².

Mancha de pontos
O painel de intensidade de sinal e o ID do tipo de fibra dependem de toda a amostra ser representada no pequeno volume aplicado à membrana dot blotting. Para conseguir isso, a amostra é completamente misturada por agitação antes de carregar na membrana. Todas as fibras com apenas uma isoforma MHC passam para a próxima etapa de pooling. Nesta fase, é importante que qualquer fibra com mais de um MHC não proceda a esta próxima etapa de combinação de amostras. Se uma amostra estiver contaminada, toda a amostra agrupada precisa ser descartada e o pesquisador deve voltar à coleta de fibras e repetir as etapas de isolamento de fibras e dot blotting.

Imunomarcação
Anteriormente, foi relatado que 5 min é um tempo adequado para bloquear sítios inespecíficos na membrana para a detecção de MHCI e MHCIIa⁹. O avanço da técnica para MyDoBID requer o uso de um anticorpo Actina. Verificou-se que o tempo de bloqueio de 5 min precisou ser aumentado para 30 min, conforme relatado⁶, para obter uma membrana com fundo mínimo, já que o bloqueio de 5 min resultou em um fundo de membrana mais escuro. O tempo de bloqueio é uma consideração em qualquer técnica de imunodetecção, como western blotting ou imunohistoquímica, e deve ser modificado conforme apropriado.

Remoção da membrana
O stripping não pode ser usado para análises quantitativas¹⁵ porque também remove proteínas de interesse, mas pode ser usado no MyDoBID por ser um ensaio qualitativo. O objetivo da remoção é remover os anticorpos ligados da superfície da membrana, permitindo que um novo anticorpo seja usado com interferência mínima do anticorpo anterior. No MyDoBID, há a opção de aplicar a amostra através de duas membranas, onde as diferentes isoformas do MHC são detectadas em membranas separadas. Se esta abordagem for preferida, evite manusear o tubo de amostra mais do que uma vez, carregando os pontos ao mesmo tempo. Isso garantirá que o tempo de secagem entre cada ponto de amostra seja semelhante (~5 s de diferença) e as etapas subsequentes sejam executadas simultaneamente em recipientes separados. Deve-se notar que essa opção aumentaria o tempo, a amostra e o consumo de consumíveis.

Os anticorpos são aplicados para detectar primeiro as fibras MHCIIa, seguidas pelo MHCI, porque o anticorpo MHCI sempre dá um sinal muito brilhante, que seria mais difícil de remover do que o MHCIIa. A actina é expressa homogeneamente nas fibras musculares esqueléticas e é usada para confirmar que uma porção da fibra foi aplicada com sucesso na membrana, como descrito acima.

Imagem, identificação do tipo de fibra e preparação de amostras específicas do tipo de fibra
Uma nova ferramenta foi desenvolvida neste protocolo para auxiliar na identificação do tipo de fibra e seleção de amostras para criar amostras específicas do tipo de fibra (Figura 4A). O exemplo mostrado no painel de intensidade de sinal é usado para definir a intensidade do sinal MHCI como: (i) saturada, (ii) moderada ou (iii) fraca. Para agrupar fibras em amostras específicas do tipo de fibra, as fibras que apresentam intensidade de sinal saturada são selecionadas primeiro e, se necessário, fibras com intensidade de sinal moderada são adicionadas. Ao preparar amostras do tipo I e II, normalmente há fibras "saturadas" e "moderadas" suficientes para que as fibras categorizadas como "fracas" ou não identificadas possam ser descartadas.

Novidade do uso de Actina em vez de anticorpo MHCIIx para identificar fibras puras do tipo IIx
Anteriormente, para identificar fibras IIx puras, o sinal MHCIIx foi subjetivamente comparado com o sinal MHCI e MHCIIa em um dot blot e, por um processo de eliminação, as fibras sem sinal MHCI ou IIa, mas com sinal MHCIIx, foram identificadas como IIx puro. No entanto, podem surgir problemas ao usar dois anticorpos primários IgM de camundongo (MHCIIx e MHCI) na mesma membrana. Apesar de retirar a membrana entre os anticorpos primários, o sinal residual de anticorpos pode ser detectado. A utilização do anticorpo primário anti-Actina do coelho evita que esse problema ocorra. Aqui usamos Actina para confirmar que uma fibra foi coletada e, na ausência de MHCI e MHCIIa, indica que uma fibra IIx estava presente. As fibras IIx potenciais são então confirmadas por western blotting usando o anticorpo MHCIIx-específico (ver Figura 5 neste artigo e Figura 2 em⁹). Foi demonstrado que o anticorpo 6H1¹⁶ detecta a banda eletroforeticamente separada correspondente a MHCIIx no músculo esquelético de ratos e marca fibras do tipo IIx em cortes transversais de músculos de camundongos, ratos e humanos².

Confirmação do tipo de fibra Western blot
É uma boa prática executar todas as amostras específicas do tipo de fibra da mesma biópsia no mesmo gel. Com o anticorpo MHCI exigindo o mesmo anticorpo secundário que MHCIIx, as amostras do tipo I e IIx devem ser separadas por pelo menos uma faixa em um determinado gel, como mostrado na Figura 5. Como o conteúdo de proteína varia entre amostras específicas do tipo de fibra devido ao tamanho variável da fibra, o primeiro gel deve ser usado para determinar o volume de amostra que precisa ser carregado em séries de gel subsequentes para obter quantidades semelhantes de proteína em todas as amostras. Para fazer isso, a proteína total em uma determinada amostra é determinada usando a tecnologia de imagem de gel ativado por UV para visualizar todas as bandas de proteína que foram separadas no gel por SDS-PAGE antes da transferência. A proteína total em cada amostra é determinada a partir da imagem em gel e usada para corrigir cargas desiguais no próximo western blot run, desde que uma curva de calibração de várias massas conhecidas de tecido muscular esquelético seja executada ao lado das amostras específicas do tipo de fibra 3,4,6,17. Também não há necessidade de usar uma proteína "housekeeping", como a Actina, para determinar a proteína total, o que também exigiria sua própria curva de calibração¹⁵. Esta tecnologia é um método preciso e de economia de tempo para determinar a proteína total e pode ser realizada com muito pouca amostra (ou seja, ~1/5^th de uma fibra⁹) sem a necessidade de reagentes adicionais ou padrões de proteína, maximizando todas as seções da membrana para detectar proteínas de interesse.

Quando se trata de imunomarcação durante a etapa de western blot, o anticorpo MHCIIx é aplicado primeiro devido à abundância relativamente baixa de MHCIIx em comparação com as outras isoformas de MHC. Uma vez que a membrana está pronta para a detecção de anticorpos MHCI, ela teria passado por duas etapas de remoção (ou seja, pós-detecção MHCIIx e MHCIIa). Consequentemente, a detecção de MHCI deve ser detectada primariamente em uma amostra do tipo I, com mínimo sinal residual detectado a partir de anticorpos MHC prévios (Figura 5). O Western blotting é usado para confirmar a pureza de cada amostra específica do tipo de fibra usando todos os três anticorpos MHC na mesma porção de membrana. No entanto, a necessidade de remoção seria eliminada se os anticorpos MHCI ou MHCIIx fossem criados em uma espécie hospedeira diferente, como coelho ou cabra.

Aplicativos
A metodologia aqui descrita pode ser utilizada para tipagem de segmentos de fibra única de músculo esquelético fresco ou liofilizado para examinar a expressão de proteínas específicas do tipo de fibra no músculo esquelético humano. Além disso, pode-se utilizar amostras de músculo fresco, fibras intactas ou mecanicamente esfoladas⁶. O uso de uma fibra esfolada permite um exame mais aprofundado da expressão de proteínas em compartimentos subcelulares, como aqueles nos compartimentos citosol e membrana. Essa aplicação já foi utilizada para medir a quantidade de glicogênio ligado versus não ligado em segmentos de fibras mecanicamente peledas de indivíduos saudáveis e^{diabéticos 6}. É importante ressaltar que o MyDoBID é benéfico para experimentos que utilizam apenas amostras desnaturadas e não seria apropriado para estudos que exigem proteínas em seu estado nativo. Embora seja possível que outras análises, como ensaios enzimáticos ou abordagens proteômicas em solução, possam ser realizadas em condições nativas, uma otimização adicional seria necessária para que uma parte da fibra pudesse ser removida para identificação da isoforma MHC usando MyDoBID.

Em resumo, o tipo I, o tipo II e o tipo IIx podem ser identificados com sucesso pela aplicação de uma técnica simples com consumíveis prontamente disponíveis comumente usados para western blotting. Incluímos extensas informações práticas, onde após a conclusão bem-sucedida produziremos amostras específicas do tipo de fibra que são da melhor qualidade, integridade e confiabilidade possíveis para estudos futuros. Esta técnica é a abordagem prática e preferida para a realização de análises bioquímicas do músculo esquelético específico para fibras.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os anticorpos contra MHC I (A4.840) e MHCIIa (A4.74) utilizados neste estudo foram desenvolvidos pelo Dr. H. M. Blau e o anticorpo contra MHCIIx (6H1) foi desenvolvido pelo Dr. C. A. Lucas e obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), graças aos auspícios do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas (Iowa City, IA). Agradecemos a Victoria L. Wyckelsma por fornecer as amostras de músculo humano para este estudo. A maioria das imagens da Figura 1 provinha de BioRender.com.

Financiamento:
Este estudo não recebeu financiamento externo.