Inspeção rápida da qualidade do índigo naturalis por espalhamento múltiplo de luz

Aqui, apresentamos um método de avaliação da qualidade baseado em uma técnica de espalhamento múltiplo de luz para avaliar a qualidade do Indigo Naturalis.

O controle de qualidade da medicina fitoterápica chinesa é um componente crucial da pesquisa e desenvolvimento da medicina fitoterápica chinesa. Diante dos desafios da modernização e internacionalização da fitoterapia chinesa, é urgente estabelecer procedimentos completos e eficazes para a identificação da qualidade da fitoterapia chinesa, e há uma necessidade urgente de novas técnicas analíticas e de teste que sejam eficientes, precisas e ambientalmente corretas.

O espalhamento múltiplo de luz é um método analítico e de ponta que pode avaliar com precisão e rapidez a qualidade da fitoterapia chinesa sem alterar a natureza ou o estado da amostra ou usar reagentes orgânicos. Indigo Naturalis é considerado um bom remédio para hipertermia pediátrica, psoríase, leucemia e colite ulcerosa. Neste estudo, o processo de adição do pó de Indigo Naturalis em água foi registrado precisamente usando um instrumento de espalhamento múltiplo de luz.

As medidas qualitativas e quantitativas do instrumento podem ser usadas para capturar com precisão a trajetória geral e o comportamento de afundamento do pó de Indigo Naturalis em água e para estabelecer um método de avaliação rápida da qualidade do Indigo Naturalis com espectrogramas de transmissão e retroespalhamento da amostra como indicadores qualitativos e índice de estabilidade como indicador quantitativo. A técnica analítica baseada em espalhamento múltiplo de luz fornece um método rápido, preciso, ecológico e ecológico para a avaliação da qualidade do Indigo Naturalis e apoia o desenvolvimento e a transformação do Indigo Naturalis de alta qualidade.

Na medicina tradicional chinesa, durante o curso do tratamento da doença, a eficácia clínica dos medicamentos e a segurança do curso do tratamento são diretamente impactadas pela qualidade da medicina fitoterápica chinesa. Utilizando tecnologia de identificação de ponta, pode-se avaliar a eficácia da fitoterapia chinesa e garantir a segurança do usuário. O método de teste de água fitoterápico chinês refere-se à imersão das ervas em água ou solvente, determinando rápida e precisamente a autenticidade do medicamento, observando as mudanças de cor, tamanho e forma¹.

Foi originalmente uma boa escolha para a identificação da medicina chinesa. No entanto, a desvantagem do método tradicional de teste de água é que a precisão e a sensibilidade de distinguir a autenticidade da medicina chinesa são baixas devido à subjetividade da observação a olho nu². Um dos principais materiais medicinais utilizados no método de teste da água é o Indigo Naturalis, considerado um remédio eficaz para hipertermia pediátrica, psoríase, leucemia e retocolite ulcerativa³. O índigo Naturalis genuíno flutua na superfície da água, e a água não fica azul escuro depois de tremer. No entanto, o falso Indigo Naturalis tem partículas que afundam, e a água ficará azul escuro depois de tremer⁴. Seu princípio é devido ao índigo, indirrubina e outros componentes orgânicos hidrofóbicos e facilmente flutuáveis de alta qualidade Indigo Naturalis. Pelo contrário, devido à baixa matéria orgânica, grande quantidade de cal e textura pesada, algumas partículas dopadas com falso Indigo Naturalis afundarão rapidamente⁵. No entanto, este método é apenas uma simples identificação qualitativa, e limita a rápida identificação da autenticidade da medicina fitoterápica chinesa e falha em revelar as mudanças de Indigo Naturalis na água.

A tecnologia de espalhamento múltiplo de luz é uma tecnologia que pode medir a varredura de sinal de luz multiângulo com base em um laser que passa pela amostra. A luz incidente será espalhada quando penetrar na amostra ou encontrar partículas. Se a luz espalhada penetrar através da amostra, forma-se um sinal luminoso de transmissão; Se a concentração da amostra for alta, a luz será refletida pelas partículas, formando um sinal de retroespalhamento luminoso. As mudanças na intensidade da luz refletem as mudanças na concentração e no tamanho das partículas na preparação líquida⁶. Os múltiplos instrumentos de espalhamento de luz podem analisar com rapidez e precisão fenômenos como emulsificação, floculação, precipitação e ruptura de suspensão, emulsão e espuma líquida por tecnologia de espalhamento múltiplo de luz, bem como analisar quantitativamente características como a taxa de ocorrência dos fenômenos acima.

A tecnologia de espalhamento múltiplo de luz demonstrou benefícios significativos no monitoramento da estabilidade de partículas⁷, clarificação de vinho tinto⁸ e controle de qualidade da fermentação do leite⁹. Usando essa tecnologia, o método tradicional de teste de água da Indigo Naturalis pode ser intuitivo, quantitativo e científico. Portanto, com base no princípio da tecnologia de espalhamento múltiplo de luz, este estudo estabeleceu um método rápido de avaliação da qualidade do Indigo Naturalis, tomando o índice de estabilidade (IST) de Turbiscan da amostra como índice de controle de qualidade (Figura 1).

1. Preparação da amostra de ensaio

1. Configure quatro lotes diferentes de pó de ervas Indigo Naturalis para o teste. Passar cada amostra pela sétima peneira e nona peneira sucessivamente e coletar a amostra entre a sétima e a nona peneira⁵.
   NOTA: O tamanho médio da abertura da sétima peneira é de 125 μm ± 5,8 μm. O tamanho médio da abertura da nona peneira é de 75 μm ± 4,1 μm.
2. Pesar com precisão 0,2 g da amostra (pó Indigo Naturalis) em um papel de pesagem e reserve-a.

2. Adição da amostra

1. Construa um suporte de ferro e coloque um anel de ferro com um funil de 5 cm de diâmetro.
2. Use uma pipeta para adicionar 20 mL de água pura ao frasco de vidro da amostra (diâmetro inferior 2,6 cm, altura 6 cm). Coloque o frasco de vidro de amostra diretamente sob o funil para que a borda inferior do funil fique nivelada com a boca do frasco.
   NOTA: Limpe o exterior do frasco para injetáveis de vidro de amostra com uma toalha de papel limpa e não abrasiva e inspecione a superfície de vidro em busca de marcas visíveis. Se houver, troque o frasco de vidro. Tenha cuidado para não derramar ao adicionar líquido.
3. Solte a amostra a uma altura de 80 cm da borda inferior do funil para que ela possa deslizar livremente ao longo do funil para dentro do frasco de amostra.

3. Operação do instrumento

1. Ligue o instrumento Turbiscan Lab e aqueça-o por 30 min.
2. Crie o arquivo. Clique no botão Criar arquivo no menu superior (ou na função Novo arquivo no menu Arquivo) para criar um novo arquivo de medição vazio. Defina seu nome e salve o local (por padrão, a pasta de dados está localizada em: "C:/users/admin/Formulaction/FAnalyser/Data".
3. Clique no botão Mostrar temperatura do laboratório de turbiscan no menu superior para definir a temperatura alvo do instrumento para 25 °C.
   NOTA: A temperatura do instrumento é influenciada pela temperatura ambiente, por isso tenha cuidado para ajustar a temperatura ambiente.
4. Clique em Verificação de programas no menu superior para entrar no programa de análise de instalação. Adicione o programa à lista e, na barra de tarefas, adicione 30 s como um ciclo e 21 varreduras à sequência de análise. Selecione este programa de análise para todas as medições subsequentes.
5. Mova o frasco para injetáveis de amostra preparado para o sistema de medição. Depois de configurar o programa, clique em Iniciar para iniciar a medição.
   NOTA: Tenha cuidado para não agitar a garrafa de vidro ao se mover e apenas movê-la ligeiramente.
6. Após a aquisição dos dados, clique na lista de parâmetros calculados para calcular automaticamente a ETI.

As figuras 2A-D correspondem a S1, S2, S3 e S4 do Indigo Naturalis, respectivamente. A é de alta qualidade Indigo Naturalis, mostrando a mesma transmitância de luz em qualquer altura dentro de 0-10 min, que é muito estável. B é o Indigo Naturalis comum, e sua transmitância de luz flutua ligeiramente com a mudança do tempo e é geralmente estável. C e D são produtos falsificados e inferiores. Pode haver duas condições nos espectrogramas de transmissão do falso Indigo Naturalis, a saber, a luz de transmissão em C diminuiu rapidamente no primeiro momento da medição, e a luz de transmissão na parte inferior do frasco de amostra foi significativamente menor do que a luz no topo, indicando que a deposição ocorreu no frasco de amostra na primeira vez, e o depoimento foi muito rápido. No entanto, a luz de transmissão em D é estável no tempo zero e depois diminui lentamente com o prolongamento do tempo. Em comparação com C, indica que há sedimentação lenta no frasco da amostra.

As figuras 3A-D correspondem a S1, S2, S3 e S4 do Indigo Naturalis, respectivamente. A partir dos dados espectrais da luz de retroespalhamento, pode-se inferir aproximadamente que os dados da amostra são consistentes com a luz de transmissão. Nenhuma ou pequenas flutuações (Figura 3A e Figura 3B, respectivamente) indicam que a amostra está estável. Figura 3C, D pode ser turva devido à sedimentação da amostra, e a flutuação aumenta, o que leva à instabilidade da amostra.

Comparando o espectrograma de transmissão (Figura 2) e os espectrogramas de retroespalhamento (Figura 3) dos quatro Indigo Naturalis com os instantâneos de início e fim dos vídeos (Figura 4) e do Vídeo Suplementar S1, Vídeo Suplementar S2, Vídeo Suplementar S3 e Vídeo Suplementar S4 capturados pelo instrumento de espalhamento múltiplo de luz, a autenticidade do Indigo Naturalis pode ser rápida e grosseiramente identificada.

Com a extensão do tempo de medição, os espectrogramas de transmissão e retroespalhamento do Indigo Naturalis de alta qualidade devem flutuar pouco ou nada, e os espectrogramas de transmissão e retroespalhamento do pseudo ou inferior Indigo Naturalis podem diminuir gradual ou acentuadamente. O Vídeo Suplementar S1, o Vídeo Suplementar S2, o Vídeo Suplementar S3 e o Vídeo Suplementar S4 também refletiram claramente esse resultado. Os valores da ETI reflectem a acumulação das mudanças de intensidade da luz de transmissão ou da luz de retroespalhamento em comparação com a medição anterior durante o tempo de medição, e é também a alteração global da concentração volumétrica e do tamanho das partículas da amostra durante todo o período de varredura. A qualidade dos quatro tipos de Indigo Naturalis pode ser distinguida com precisão contrastando seu TSI em 10 min (Figura 5 e Tabela 1). Quanto maior o valor do ETI, mais instável será o sistema e maior será o intervalo de variação da amostra de¹⁰. Se o valor da ETI for <10 durante o período de análise, a amostra será considerada estável. Portanto, o protocolo atual mostra um método de identificação rápida de Indigo Naturalis de boa qualidade baseado em TSI em um instrumento de espalhamento múltiplo de luz.

Figura 1: Princípio de avaliação da qualidade do Indigo Naturalis por espalhamento múltiplo de luz. Índigo e indirrubina são as principais razões para a forte hidrofobicidade do índigo naturalis. O conteúdo de índigo e indirrubina determina a velocidade de sedimentação das partículas. Com esta característica, um instrumento de dispersão de luz múltipla pode distinguir diferentes qualidades do Indigo Naturalis. O instrumento de espalhamento múltiplo de luz tem tecnologia de espalhamento de luz múltipla, e sua sonda de medição consiste em uma fonte de luz infravermelha próxima pulsada (λ = 880 nm) e dois detectores síncronos. Um deles é um detector de luz de transmissão, que é usado para receber a luz que passa através do frasco da amostra (0° com a luz incidente) e para determinar a amostra clara. O outro é um detector de luz de retroespalhamento, que é usado para receber a luz de retroespalhamento da amostra (45° da luz incidente) e para determinar a amostra de alta concentração. A sonda de medição varre toda a célula de amostra de baixo para cima, uma vez a cada 40 μm, e coleta os dados de luz de transmissão (T) e luz de retroespalhamento (BS). Ao definir os tempos de medição e o tempo de varredura, a amostra será escaneada repetidamente, e o sinal e a aquisição de dados serão processados pelo conversor corrente-tensão para obter um atlas representando as características de estabilidade da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Espectrogramas de transmissão de quatro Indigo Naturalis no instrumento de espalhamento múltiplo de luz. A-D correspondem a S1, S2, S3 e S4 do Indigo Naturalis, respectivamente. (A) Indigo Naturalis estável e de alta qualidade, mostrando a mesma transmitância de luz em qualquer altura dentro de 0-10 min. (B) O Indigo Naturalis comum e sua transmitância de luz flutuam ligeiramente com a mudança do tempo e geralmente são estáveis. (C, D) Produtos falsificados e inferiores. (C) A luz de transmissão na parte inferior do frasco de amostra foi significativamente menor do que na parte superior, indicando que a deposição ocorreu no frasco de amostra em um estágio inicial, e a deposição foi muito rápida. (D) No entanto, a luz de transmissão é estável no tempo zero e depois diminui lentamente com o tempo. Em comparação com C, indica que há sedimentação lenta no frasco da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Espectrogramas de retroespalhamento de quatro Indigo Naturalis no instrumento de espalhamento múltiplo de luz. A-D correspondem a S1, S2, S3 e S4 do Indigo Naturalis, respectivamente. A partir dos dados espectrais da luz de retroespalhamento, pode-se inferir aproximadamente que os dados da amostra são consistentes com a luz de transmissão. (A) Sem flutuação, indicando que a amostra é muito estável. (B) A flutuação é pequena, indicando que a amostra é relativamente estável. (C, D) A turbidez é devida à sedimentação da amostra, e a flutuação aumenta, o que leva à instabilidade da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Instantâneos de início e fim dos vídeos do processo de sedimentação de quatro Indigo Naturalis no instrumento de espalhamento múltiplo de luz. A-D correspondem a S1, S2, S3 e S4 do Indigo Naturalis, respectivamente. Nos resultados, comparando-se as fotos digitalizadas de 0 min e 10 min, pode-se observar que A (Supplemental Video S1) e B (Supplemental Video S2) são muito claros em todo o processo. C (Supplemental Video S3) é parcialmente turvo no início, e depois completamente turvo finalmente. D (Vídeo Suplementar S4) muda gradualmente de clarificação para turbidez. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: TSI de quatro Indigo Naturalis de 0 min a 10 min. O gráfico mostra a curva do TSI com o tempo de varredura. De acordo com a variação da curva do ETI, S4 tem a maior inclinação e o valor do IST muda de forma particularmente significativa. Em seguida, a inclinação de S3 também é relativamente grande, e o valor do TSI tem aumentado lentamente. No entanto, as inclinações de S1 e S2 são próximas de zero, e os valores do TSI mudam menos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: TSI de quatro Indigo Naturalis aos 10 min (n=3). De acordo com a forte hidrofobicidade do Indigo Naturalis, pode-se inferir que o teor de índigo e indirrubina do Indigo Naturalis determina sua qualidade. Quando o teor de índigo e indirrubina é alto, a amostra flutua quase completamente na superfície da água, resultando em pequenos valores de ETI. Em 10 min, a sequência TSI de cada lote é S4 > S3 > S2 > S1. Para S1 e S2, o valor do TSI é bastante pequeno, o que reflete que as amostras são relativamente estáveis e de boa qualidade. Para S3 e S4, o valor do TSI é extremamente grande, o que também reflete a instabilidade da amostra e a qualidade é inferior.

Vídeo Suplementar S1: Vídeo de animação do processo de sedimentação de um Indigo Naturalis de boa qualidade no instrumento de dispersão de luz múltipla. Em todo o vídeo de animação, pode-se ver que S1 está quase inalterado, indicando que é relativamente estável. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S2: Vídeo de animação do processo de sedimentação do Indigo Naturalis comum no instrumento de dispersão de luz múltipla. Em todo o vídeo de animação, pode-se ver que o S2 está quase inalterado, indicando que é relativamente estável. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S3: Vídeo de animação do processo de sedimentação do falso Indigo Naturalis no instrumento de dispersão de luz múltipla. Em todo o vídeo de animação, pode-se ver que o S3 está turvo no terceiro minuto de varredura, indicando instabilidade. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S4: Vídeo de animação do processo de liquidação do falso Indigo Naturalis no instrumento de dispersão de luz múltipla. Em todo o vídeo de animação, pode-se ver que S4 é turvo no terceiro minuto de varredura, indicando instabilidade. Clique aqui para baixar este arquivo.

De acordo com a medicina tradicional chinesa, Indigo Naturalis tem o poder de limpar o calor e desintoxicação, resfriar o sangue, eliminar manchas, purgar o fogo, e parar a convulsão. Baseado em ensaios clínicos randomizados duplo-cegos controlados^11,12,13, o Indigo Naturalis é eficaz no tratamento da psoríase, retocolite ulcerativa e leucemia promielocítica aguda, além de seu tratamento tradicional de tosse e catarro, sintomas hemorrágicos, feridas e inchaços^, calor hepático e epilepsia. Devido à variedade do Indigo Naturalis, a diferença de qualidade é grande e o processo de detecção de conteúdo é complicado. Por um lado, as fontes de Indigo Naturalis incluem Strobilanthes cusia (Nees) Kuntze, Persicaria tinctoria (Aiton) Spach, e Isatis tinctoria L., o ambiente geográfico, e várias épocas de colheita levam às diferenças de qualidade inerentes¹⁴. Por outro lado, o processo de preparação do Indigo Naturalis requer etapas como fermentação de imersão, anil batendo cal, refino de mosca d'água, etc. No entanto, é provável que este processo produza diferentes qualidades de Indigo Naturalis, e o conteúdo de Indigo Naturalis varia de lote para lote. Atualmente, vários estudos têm mostrado que a taxa de qualificação do conteúdo dos componentes do índice de Indigo Naturalis é baixa. Produtos falsificados e inferiores causam grandes problemas de qualidade, o que torna extremamente difícil o uso clínico do Indigo Naturalis^15,16,17. Portanto, é urgente e indispensável que a Indigo Naturalis desenvolva um método padronizado de controle de qualidade.

Uma etapa fundamental no processo descrito é que o frasco de vidro que contém a amostra deve ser movido para dentro do tanque de amostra o mais rápido possível, evitando agitar o frasco. Caso contrário, o manuseio inconsistente pode produzir resultados enganosos. Em segundo lugar, a temperatura ambiente terá um impacto na temperatura definida do instrumento. Quando a temperatura ambiente exceder 30 °C e a temperatura do instrumento for inferior à temperatura ambiente, a temperatura do instrumento aumentará. Vale ressaltar que a temperatura ambiente deve ser controlada abaixo da temperatura do instrumento.

Embora o espalhamento múltiplo de luz tenha vantagens únicas sobre os métodos tradicionais, ele também tem suas limitações. Primeiro, o espalhamento de luz multiplex não pode produzir definitivamente o conteúdo exato de uma amostra, mas só pode identificar a autenticidade e um intervalo aproximadamente determinado. Em segundo lugar, sem uma maior identificação da medicina fitoterápica chinesa, atualmente é relevante apenas para a avaliação rápida da qualidade do Indigo Naturalis. Em terceiro lugar, os critérios da pesquisa contemporânea de avaliação da qualidade estão longe de ser atendidos por depender de múltiplas metodologias de espalhamento de luz e múltiplos instrumentos de espalhamento de luz.

Em comparação com o método de ensaio de água existente, a importância do método de espalhamento múltiplo de luz reside nos seguintes pontos. Primeiro, tem alta sensibilidade e confiabilidade. A sensibilidade e a resolução são muito maiores do que a da observação a olho nu. O dispositivo de dispersão de luz múltipla pode capturar como a solução muda ao longo do tempo e criar um vídeo animado de todo o processo. Em segundo lugar, pode ser analisado qualitativa e quantitativamente. Através da medição sem contato, o instrumento pode determinar automaticamente a estabilidade da amostra usando suas características ópticas (luz de transmissão, luz de retroespalhamento, TSI e tamanho de partícula).

No futuro, acreditamos que este método acabará por ser útil no campo do controlo de qualidade da medicina tradicional chinesa, particularmente na avaliação da autenticidade. Este estudo apoiou a validade e a precisão da abordagem de espalhamento múltiplo de luz na avaliação rápida da qualidade da medicina chinesa usando Indigo Naturalis como exemplo. Consequentemente, à medida que os equipamentos e a tecnologia de aplicação avançam continuamente, várias tecnologias de espalhamento de luz serão combinadas com outras técnicas de detecção para complementar umas às outras, que têm um maior impacto no controle de qualidade dos fitoterápicos chineses no futuro.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O trabalho deseja agradecer o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82173976), Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave (No. 2018YFC1707205) e Laboratório Chave Estadual de Medicamentos Inovadores e Equipamentos Farmacêuticos de Alta Economia de Energia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Jiangxi (No. GZSYS202003).