Caracterização do Interactome do Lisossomo Neuronal com Proteômica de Marcação de Proximidade

Um protocolo proteômico de marcação de proximidade de lisossomos neuronais é descrito aqui para caracterizar o microambiente lisossômico dinâmico em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Proteínas de membrana lisossômica e proteínas que interagem com lisossomos (estável ou transitoriamente) podem ser quantificadas com precisão neste método com excelente resolução espacial intracelular em neurônios humanos vivos.

Os lisossomos frequentemente se comunicam com uma variedade de biomoléculas para alcançar a degradação e outras funções celulares diversas. Os lisossomos são críticos para a função cerebral humana, pois os neurônios são pós-mitóticos e dependem fortemente da via autofagia-lisossomo para manter a homeostase celular. Apesar dos avanços na compreensão de várias funções lisossômicas, capturar as comunicações altamente dinâmicas entre lisossomos e outros componentes celulares é tecnicamente desafiador, particularmente de uma forma de alto rendimento. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para o método proteômico de marcação de proximidade de lisossomos endógenos (knock-in) recentemente publicado em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC).

Tanto as proteínas da membrana lisossômica quanto as proteínas que envolvem os lisossomos dentro de um raio de 10-20 nm podem ser identificadas com confiança e quantificadas com precisão em neurônios humanos vivos. Cada etapa do protocolo é descrita em detalhes, ou seja, cultura de neurônios hiPSC, marcação de proximidade, colheita de neurônios, microscopia de fluorescência, enriquecimento de proteínas biotiniladas, digestão de proteínas, análise de LC-MS e análise de dados. Em resumo, este método único de proteômica de marcação de proximidade lisossômica endógena fornece uma ferramenta analítica robusta e de alto rendimento para estudar as atividades lisossômicas altamente dinâmicas em neurônios humanos vivos.

Os lisossomos são organelas catabólicas que degradam macromoléculas através da via lisossômica-autofagia¹. Além da degradação, os lisossomos estão envolvidos em diversas funções celulares, como transdução de sinalização, detecção de nutrientes e secreção ^2,3,4. Perturbações na função lisossômica têm sido implicadas em distúrbios de armazenamento lisossômico, câncer, envelhecimento e neurodegeneração 3,5,6,7. Para neurônios pós-mitóticos e altamente polarizados, os lisossomos desempenham papéis críticos na homeostase celular neuronal, liberação de neurotransmissores e transporte de longa distância ao longo dos axônios 8,9,10,11. No entanto, investigar lisossomos em neurônios humanos tem sido uma tarefa desafiadora. Avanços recentes nas tecnologias de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) permitiram a cultura de neurônios humanos vivos que antes eram inacessíveis, preenchendo a lacuna entre modelos animais e pacientes humanos para estudar o cérebro humano^12,13. Particularmente, a avançada tecnologiaⁱ³Neuron integra de forma estável o fator de transcrição da neurogenina-2 no genoma da iPSC sob um promotor induzível por doxiciclina, levando as iPSCs a se diferenciarem em neurônios corticais puros em 2 semanas^14,15.

Devido à atividade lisossômica altamente dinâmica, capturar interações lisossômicas com outros componentes celulares é tecnicamente desafiador, particularmente de forma de alto rendimento. A tecnologia de marcação de proximidade é adequada para estudar essas interações dinâmicas devido à sua capacidade de capturar interações proteicas estáveis e transitórias/fracas com excepcional especificidade espacial^16,17. A peroxidase modificada ou a biotina ligase podem ser geneticamente fundidas à proteína da isca. Após a ativação, radicais de biotina altamente reativos são produzidos para rotular covalentemente proteínas vizinhas, que podem então ser enriquecidas por esferas revestidas com estreptavidina para proteômica descendente de baixo para cima via cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) plataformas 17,18,19,20,21.

Um método proteômico de marcação de proximidade lisossômica endógena foi recentemente desenvolvido para capturar o microambiente lisossômico dinâmico em i³neurônios²². A ascorbato peroxidase modificada (APEX2) foi batida no terminal C da proteína de membrana associada lisossômica 1 (LAMP1) em iPSCs, que podem então ser diferenciadas em neurônios corticais. A LAMP1 é uma proteína abundante da membrana lisossômica e um marcador lisossômico clássico²³. A LAMP1 também é expressa em endossomos tardios, que amadurecem em lisossomos; esses lisossomos endossomáticos tardios e lisossomos não degradativos são todos referidos como lisossomos neste protocolo. Esta sonda endógena LAMP1-APEX, expressa a nível fisiológico, pode reduzir a deslocalização da LAMP1 e os artefactos de sobreexpressão. Centenas de proteínas da membrana lisossômica e interatores lisossômicos podem ser identificados e quantificados com excelente resolução espacial em neurônios humanos vivos.

Aqui, um protocolo detalhado para proteômica de marcação de proximidade de lisossomos em neurônios humanos derivados de iPSC é descrito com melhorias adicionais do método recentemente publicado²². O fluxo de trabalho geral é ilustrado na Figura 1. O protocolo inclui cultura de neurônios derivados de hiPSC, ativação de marcação de proximidade em neurônios, validação da atividade do APEX por microscopia de fluorescência, determinação de uma ótima relação entre contas de estreptavidina e proteína de entrada, enriquecimento de proteínas biotiniladas, digestão de proteínas em contas, dessalinização e quantificação de peptídeos, análise de LC-MS e análise de dados proteômicos. Diretrizes de solução de problemas e otimizações experimentais também são discutidas para melhorar o controle de qualidade e o desempenho da rotulagem de proximidade.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de biossegurança e ética da Universidade George Washington. As composições de meios e buffers utilizados neste protocolo estão apresentadas na Tabela 1. As informações comerciais do produto usadas aqui são fornecidas na Tabela de Materiais.

1. Cultura de neurônios derivados de iPSC humana

1. Cultura de iPSC humana e integração da sonda LAMP1-APEX (7 dias)
   1. Descongelar a solução-mãe de Matrigel num balde de gelo a 4 °C durante a noite, alíquota de 500 μL da solução em tubos estéreis frios e conservar as alíquotas a -80 °C. Preparar 50 ml de solução de revestimento adicionando 500 μL da calda de Matrigel em 49,5 ml de meio DMEM/F12 frio.
      NOTA: Mantenha o Matrigel frio e use tubos cônicos pré-resfriados e pontas de pipeta para evitar a polimerização. A solução de revestimento pode ser armazenada a 4 °C durante 2 semanas.
   2. Revestir uma placa de cultura celular de 10 cm com 4 mL de solução de revestimento por 1 h em incubadora de 37 °C.
      NOTA: A vitronectina pode ser uma solução de revestimento alternativa na concentração de 5 μg/mL e revestimento de 2 h para cultura de iPSC. A vitronectina (componente proteico único) é mais cara do que o Matrigel, mas tem menos variações de lote e sinais de fundo mais limpos do que o Matrigel, que é extraído de tumores de camundongos com numerosas proteínas da matriz extracelular. A placa de cultura de tecidos não tratada é necessária para o revestimento de vitronectina. O revestimento Matrigel funciona para placas de cultura de tecidos tratadas e não tratadas.
   3. Descongelar e apagar 1-3 milhões de hiPSCs em cada prato revestido de 10 cm pré-carregado com 8 mL de meio completo Essential E8 suplementado com inibidor de ROCK (concentração final de 10 μM Y-27632 ou 50 nM Chroman1).
      NOTA: A adição de inibidor de ROCK (Y-27632 ou Chroman1) ao meio de cultura de células-tronco minimiza a apoptose induzida por dissociação após a divisão e a preservação criogênica. O Chroman1 demonstrou recentemente ser mais potente que o Y-27632 na inibição do ROCK1 e do ROCK2²⁴.
   4. Mudança para 10 mL de meio E8 completo sem inibidor de ROCK após as iPSCs formarem colônias, tipicamente após 1-2 dias. Mantenha a cultura iPSC em meio E8 completo e substitua o sobrenadante por meio fresco a cada dois dias.
   5. Integrar a enzima de marcação de proximidade, ascorbato peroxidase modificada (APEX2), no terminal C do gene endógeno LAMP1 pela engenharia do genoma CRISPR. Para obter etapas detalhadas para gerar uma linhagem celular estável projetada, consulte o método publicado anteriormente (Frankenfield et al). ²².
2. Diferenciação iPSC-neurônio humano (3 dias)
   1. Revestir uma placa de cultura celular de 10 cm durante a noite com 4 mL de solução de revestimento Matrigel em uma incubadora de 37 °C antes da diferenciação.
   2. Mantenha as hiPSCs até ~70% de confluência. Lave suavemente as hiPSCs com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 2x para remover as células mortas. Aspirar o PBS e adicionar 3 ml de Accutase ao prato de 10 cm de células. Agitar a placa para uma distribuição uniforme e incubar durante 8 min numa incubadora a 37 °C.
   3. Adicione 2 mL de PBS para lavar e levantar as células da placa e colete toda a solução celular em um tubo cônico de 15 mL. Pellet as células por centrifugação a 300 × g durante 5 min. A placa 2-4 × 10⁶ hiPSCs em uma placa revestida de Matrigel pré-carregada com 8 mL de meio de indução de neurônios quentes (Tabela 1). Distribua uniformemente as células e coloque numa incubadora de 37 °C.
      NOTA: A diferenciação de neurônios é impulsionada por um fator de transcrição induzível por doxiciclina, a neurogenina-2 (NGN2), que foi superexpresso nesta linhagem celular estável de hiPSC¹⁵.
   4. Lave as hiPSCs suavemente com PBS no dia 1 de diferenciação para remover os detritos das células mortas. Substitua por 10 mL de meio de indução quente sem inibidor de ROCK.
   5. Mude com meio de indução quente sem inibidor de ROCK todos os dias até o dia 3 de diferenciação.
      NOTA: Os neurônios estão prontos para serem revestidos em meio neuronal.
3. Placar neurônios e manter a cultura de neurônios (10 dias)
   1. Preparar solução de revestimento de Poli-L-Ornitina (PLO) 0,1 mg/mL em tampão borato (Tabela 1).
   2. Revestir uma placa de cultura celular com a solução de revestimento PLO numa incubadora a 37 °C durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes do chapeamento de neurónios do dia 3. Lave o prato com 4 mL de água estéril três vezes e deixe secar completamente dentro do armário de biossegurança.
   3. Dissociar os neurônios do dia 3 de cada prato de 10 cm com 3 mL de Accutase e placa de 8-10 milhões de células em cada prato revestido de OLP de 10 cm pré-carregado com meio de neurônio cortical quente (Tabela 1).
   4. Realize uma mudança de meio meio médio a cada 2-3 dias com meio neurônio quente até que os³neurônios i atinjam a maturação em 2 semanas após a diferenciação.

2. Marcação de proximidade in situ e lise de neurônios (2 h)

1. Preparar a solução-mãe de biotina-fenol (BP) a 500 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) e conservar a -20 °C. No dia da marcação de proximidade, diluir a solução-mãe da PA com meio neurónio quente e tratar os neurónios a uma concentração final de 500 μM durante 30 minutos numa incubadora a 37 °C.
   NOTA: A doxiciclina é adicionada no meio neurônio, o que ativará a expressão da enzima APEX. A doxciclina precisa ser adicionada pelo menos 24 horas antes do experimento de rotulagem de proximidade.
2. Iniciar a reação de marcação adicionando H 2 O₂a uma concentração final de 1 mM na cultura de neurônios e incubar por exatamente 1 min. Aspirar imediatamente o meio e enxaguar 3 vezes com tampão de têmpera (Tabela 1).
   NOTA: A solução de H₂O₂ deve ser fresca antes da reacção de rotulagem. A ativação deH 2 O 2 precisa ser exatamente 1 min para reduzir a variação experimental e minimizar o estresse oxidativo causado pelo tratamento prolongado com H₂O₂.
3. Incline a placa para aspirar todo o tampão residual. Adicionar tampão de lise celular gelado (Tabela 1) diretamente na placa do neurônio. Use 100 μL de tampão de lise celular por 1 milhão de neurônios. Gire a placa para lise celular suficiente e coloque no gelo.
4. Raspe os lisados celulares em tubos frios de 1,5 mL. Sonicate em um banho de água gelada usando um sonicator de banho (>100 W) por 15 min com ciclos alternados de 40 s on, 20 s off.
   NOTA: A solução proteica suficientemente lisada deve ser límpida sem pellets ou bolhas excessivas. A sonicação suficiente do lisado celular é crucial para cisalhar os ácidos nucleicos e reduzir a viscosidade do lisado celular para reduzir a ligação inespecífica em procedimentos a jusante. Um sonicator de sonda também pode ser usado para fornecer lise celular mais forte e rápida, mas a lavagem da sonda entre as amostras é necessária para minimizar a contaminação cruzada e a perda de amostras.
5. Adicionar acetona fria (-20 °C) à amostra a um volume de 4 vezes de tampão de lise. Vórtice brevemente e incubar a -20 °C por 3 h.
6. Centrífuga a 16.500 × g durante 10 min a 2 °C. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de proteína. Lavar o pellet com 1 ml de acetona 2x −20 °C e remover o sobrenadante após centrifugação.
7. Seque o pellet de proteína com um concentrador de vácuo por 1 min. Adicione tampão de lise celular para dissolver completamente o pellet. Sonicate brevemente, se necessário. Conservar as amostras a -80 °C.
   NOTA: A precipitação de acetona pode remover resíduos de biotina-fenol na amostra, o que pode interferir com o enriquecimento a jusante de proteínas biotiniladas.

3. Microscopia de fluorescência para validar a localização e a atividade do APEX (1,5 dias)

1. Incubar os 3^{neurônios i}expressando LAMP1-APEX endógeno com 500 μM BP por 30 min a 37 °C. Ative a marcação com tratamento de 1 mM H 2 O₂por apenas 1 s para limitar a difusão da nuvem de biotina.
2. Fixe as células imediatamente com paraformaldeído a 4% no tampão de têmpera e lave suavemente 3x com PBS.
   NOTA: Para um prato de 10 cm, 4-6 mL são necessários para uma lavagem suficiente.
3. Bloquear e permeabilizar as células utilizando soro de burro a 3% e saponina a 0,1% em PBS por 30 min à temperatura ambiente (RT).
4. Incubar as células com o anticorpo primário anti-LAMP1 (H3A4 monoclonal do rato, 1:1.000) durante a noite a 4 °C.
5. Lave os neurônios 3 x suavemente com PBS. Incubar os neurônios com anticorpo secundário AF561 anti-camundongo (1:1.000) e Streptavidin-680 (1:1.000) por 1 h no RT.
6. Lavar 2x com PBS e incubar com marcador nuclear Hoechst ou 4',4-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min no RT. Enxaguar as células 2x com PBS.
7. Visualize os neurônios fixos sob um microscópio de fluorescência. Observe proteínas biotiniladas coradas com estreptavidina e colocalizadas com coloração LAMP1 fora do núcleo para validar a localização correta da atividade do APEX.

4. Determinação da relação entre as esferas de estreptavidina e a proteína de entrada (1,5 dias)

1. Realizar ensaio de proteína compatível com detergente (DCA) para determinar as concentrações totais de proteína em lisados celulares
   1. Dissolver o padrão proteico de albumina sérica bovina (BSA) no tampão de lise celular a uma concentração de 4 mg/mL. Prepare uma série de soluções-padrão de proteína BSA (0,2-2 mg/mL, 5 diluições) usando o tampão de lise celular.
   2. Transfira 5 μL de cada amostra de proteína, solução padrão de proteína BSA e tampão de lise de células em branco em triplicado para cada poço em uma placa de 96 poços.
   3. Adicionar 2 μL de reagente S por 1 ml de reagente A para obter o reagente A'. Adicionar 25 μL de reagente A' a cada alvéolo. Adicionar 200 μL de reagente B a cada alvéolo. Misture e estoure bolhas, se houver.
   4. Incubar essa placa de 96 poços no RT por 15 min, ler a absorvância a 750 nm em um leitor de microplacas e quantificar as concentrações de amostras de proteína com base na curva padrão da BSA.
2. Ensaio de mancha de pontos de titulação de contas (1,5 dias)
   1. Transfira uma série de pastas de esferas magnéticas de estreptavidina (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) para tubos de tira de PCR. Coloque os tubos de tira de PCR em um rack magnético, lave as contas 3x com 100 μL de buffer SDS a 2% e remova completamente o buffer de lavagem enquanto estiver no rack magnético.
   2. Adicionar 50 μg de amostra de proteína a cada tubo. Adicionar mais tampão de lise a um volume total de 80 μL. Feche cada tubo com força e gire a 4 °C durante a noite.
   3. Centrifugar os tubos de tira de PCR brevemente em uma microcentrífuga de bancada. Coloque os tubos de tira de PCR em um rack magnético por 1 min. Identifique 2 μL de sobrenadante de cada tubo em uma membrana de nitrocelulose seca e deixe a membrana secar completamente.
      NOTA: Se a intensidade do sinal for baixa, mais de 2 μL podem ser detectados na membrana. O volume pode ser aumentado por manchas várias vezes no mesmo local depois que a membrana é seca ao ar entre cada vez. Um aparelho Bio-Dot também pode ser usado.
   4. Incubar a membrana em tampão bloqueador (TBS) por 1 h. Incubar a membrana no conjugado Streptavidin Alexa Fluor 680 (1:1.000 em tampão de bloqueio) por 1 h. Em seguida, lave a membrana com TBS-T (Tabela 1) 5x.
      NOTA: Uma alternativa ao ensaio de dot blot é o western blotting usando um anticorpo estreptavidina.
   5. Meça o sinal fluorescente de cada ponto na membrana abaixo do comprimento de onda de 680 nm e gere um gráfico de dispersão com sinal fluorescente sobre o volume das contas. Selecione o volume ideal de contas necessárias para 50 μg de amostra de proteína de entrada com base em onde termina o decaimento exponencial da curva.
      NOTA: A intensidade de fluorescência representa a abundância de proteínas biotiniladas no sobrenadante, que deve diminuir com o aumento das quantidades de contas.

5. Proteínas biotiniladas enriquecedoras e digestão em contas (3 dias)

1. Transfira amostras de lisado de proteína de -80 °C e sonice as amostras em tubos de 1,5 mL por 30 s em um sonicator de banho para descongelar rapidamente as soluções. Vórtice e coloque os tubos de amostra no gelo.
2. Transfira 250 μL de pasta de esferas magnéticas de estreptavidina (SA) para cada tubo de 1,5 mL. Coloque os tubos em um rack magnético, lave as contas 3x com 1 mL de tampão de lavagem A (2% SDS) e remova o tampão residual.
3. Com base nos resultados do ensaio de dot blot e do ensaio de proteína DC, calcule a quantidade de amostra de proteína (μg) necessária para 250 μL da pasta magnética de esferas de estreptavidina.
   NOTA: Nesta sonda LAMP1-APEX de expressão endógena, são necessários 5 μL de esferas para 50 μg de proteína de entrada. Portanto, 2,5 mg de proteína total são adicionados a 250 μL de contas. Menos de 250 μL de grânulos SA podem ser usados para material de amostra de entrada limitada.
4. Adicionar tampão de lise celular ao tubo que contém a mistura magnética de grânulos-lisado a um volume total de 1 ml e rodar a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Amostras de diferentes grupos ou replicações devem ser normalizadas para a mesma concentração de proteína, volume e quantidade de contas para reduzir as variações experimentais.
5. Gire todos os tubos brevemente em uma microcentrífuga de bancada e coloque os tubos em um rack magnético por 1 min. Remova o sobrenadante enquanto estiver no rack magnético.
   NOTA: É fundamental aguardar 1 min depois de colocar os tubos de amostra no rack magnético todas as vezes. Isso pode minimizar a perda de contas devido à pequena quantidade invisível de contas ainda se movendo em direção ao ímã na solução.
6. Lave as contas 2x com 1 mL de tampão de lavagem A no RT (rotação de 5 minutos de cada vez). Repetir o processo com cada tampão de lavagem 2x sequencialmente a 4 °C. (Buffer B, Buffer C e Buffer D; Tabela 1).
   NOTA: Uma alta concentração de solução SDS pode precipitar-se a temperaturas frias. A primeira lavagem deve ser realizada no TR.
7. Coloque os tubos no rack magnético. Lave as contas 2x com Buffer D para remover completamente o detergente residual. Ressuspender os grânulos em 100 μL de tampão Tris de 50 mM e adicionar TCEP (concentração final) de 5 mM para incubar durante 30 min a 37 °C num misturador com temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm.
8. Adicionar 15 mM de iodoacetamida (IAA, concentração final) a cada tubo e incubar durante 30 minutos a 37 °C num misturador com temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm no escuro (tampa do misturador).
   NOTA: O IAA é sensível à luz e deve ser feito fresco 5 minutos antes desta etapa.
9. Adicionar 5 mM de TCEP (concentração final) para extinguir o excesso de IAA. Incubar durante 10 minutos a 37 °C num misturador com temperatura controlada com agitação a 1.200 rpm (tampa do misturador desligado).
10. Centrifugar brevemente os tubos de amostra e colocar num suporte magnético durante 1 min para remover o sobrenadante. Adicione 200 μL de TCEP de 5 mM em buffer Tris de 50 mM para ressuspender as contas. Adicionar 1 μg de mistura de tripsina/Lys-C à amostra e incubar durante 14 h a 37 °C num misturador com temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm.
11. Adicionar mais 0,2 μg de mistura de tripsina/Lys-C e digerir durante 3 h.
12. Gire os tubos de amostra brevemente e coloque os tubos em um rack magnético por 1 min. Transfira o sobrenadante peptídico para limpar os tubos enquanto estiver em um rack magnético. Lave as contas com 50 μL de tampão Tris de 50 mM (agitando por 5 min) e combine os sobrenadantes peptídicos.
13. Adicionar 30 μL de ácido trifluoroacético a 10% (TFA) ao tubo contendo sobrenadante peptídico para obter pH <3.

6. Dessalinização e fracionamento de peptídeos (2 h)

1. Molhe a placa de extração de fase sólida de fase reversa (apenas os poços para uso) com 200 μL de metanol de grau HPLC (MeOH) 3x no coletor de vácuo. Adicionar 200 μL de TFA a 1% em água de grau de HPLC 3x para equilibrar a placa.
2. Carregue as amostras de peptídeos na placa, ligando lentamente o vácuo para uma velocidade de fluxo inferior a 3 gotículas/s para minimizar a perda de amostras.
3. Lave a placa de extração 3x com 200 μL de 1% de TFA. Lavar novamente a placa de extracção com 200 μL de TFA a 1% contendo 2% de MeOH (v/v). Mantenha a velocidade de fluxo inferior a 3 gotículas/s.
4. Substitua a placa de coleta por uma placa de coleta de 96 poços. Se não for necessário fracionamento, eluir as amostras de peptídeo 3x com 100 μL de TFA a 1% contendo 80% de MeOH e combinar em um novo tubo de amostra. Seque as amostras de peptídeos em um concentrador de vácuo sem calor.
   NOTA: Se o fracionamento for desejado, as amostras de peptídeos podem ser eluídas em 4 frações subsequentemente usando 200 μL de 1% de TFA contendo 15%, 35%, 50% e 90% de MeOH, respectivamente, em uma placa de coleta diferente.

7. Ensaio de quantificação de peptídeos colorimétricos (opcional) (1 h)

1. Ressuscite amostras de peptídeos em 50 μL de água de grau LC-MS e tome alíquotas de 20 μL para realizar o ensaio peptídico.
   NOTA: Esta etapa consome uma grande quantidade de amostra de peptídeo, mas pode fornecer uma quantificação precisa da concentração de peptídeos antes da análise de LC-MS. Isso geralmente é realizado apenas uma vez por tipo de amostra para teste antes da preparação da amostra em larga escala.
2. Preparar diluições em série das soluções-padrão peptídicas (fornecidas no kit de ensaio colorimétrico) na água de grau LC-MS. Prepare o reagente de trabalho misturando 50% de Reagente A, 48% de Reagente B e 2% de Reagente C.
3. Transfira 20 μL de cada solução padrão peptídica (três repetições) e a amostra de peptídeo desconhecida para uma microplaca de 96 poços. Adicione 180 μL do reagente de trabalho a cada poço, misture bem e incube a placa por 30 min no RT.
4. Leia a absorbância a 480 nm em um leitor de microplacas e quantifique as concentrações de amostras de peptídeos com base na curva padrão do peptídeo.

8. Análise LC-MS

1. Ressuspender as amostras peptídicas em LC Buffer A (acetonitrila a 2% e ácido fórmico a 0,1%, grau LC-MS). Centrifugar a 16.500 × g durante 10 minutos a 4 °C para se livrar de quaisquer possíveis partículas.
2. Transfira o sobrenadante para frascos para injetáveis de LC-MS. Analise as amostras utilizando um instrumento nanoLC-MS.
   NOTA: Os parâmetros detalhados do LC-MS/MS são dependentes do instrumento e foram descritos anteriormente^22,25,26.
3. Gere uma lista de exclusão de LC-MS personalizada com uma variedade de tempos de retenção para picos de peptídeos contaminantes altamente abundantes, como estreptavidina e tripsina, com precisão de massa de 5 ppm 22 (por exemplo, os picos comuns de peptídeos de estreptavidina são m/z 402,5435 [carga 3], m/z 603,3117 [carga 2], m/z 654,9733 [carga 3], m/z 678,6812 [carga 3], m/z 1017,5182 [carga 2], etc.; os picos comuns de peptídeos de tripsina são m/z 421,7584 [carga 2], m/z 523,2855 [carga 2] e m/z 737,7062 [carga 3]).

9. Análise de dados proteômicos

1. Analise os dados brutos da LC-MS com software de análise de dados proteômicos, como Proteome Discoverer, MaxQuant²⁷ ou MS-Fragger²⁸. Incluir duas bibliotecas FASTA para análise de dados: 1) um banco de dados de referência Swissprot Homo Sapiens ; 2) uma recém-gerada biblioteca FASTA (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib) de contaminantes universais, que comprovadamente melhora a identificação proteômica e diminui as falsas descobertas²⁹.
2. Configure os parâmetros de análise de dados proteômicos com um ponto de corte de 1% de taxa de falsa descoberta (FDR) para identificações de correspondência espectral de proteínas e peptídeos (PSM). Selecione a digestão de tripsina com um máximo de três clivagens perdidas, uma modificação fixa da carbamidometilação da cisteína e uma modificação variável da oxidação da metionina e da acetilação N-terminal da proteína. Use intensidades de pico do peptídeo MS1 para quantificação sem rótulo. Normalizar as intensidades peptídicas para a carboxilase endogenamente biotinilada, propionil-CoA carboxilase (PCCA), para reduzir as variações de marcação de proximidade, conforme descrito anteriormente²².
   NOTA: A normalização PCCA pode ser selecionada no software Proteome Discoverer incluindo um arquivo FASTA de sequência de proteínas PCCA. Alternativamente, a normalização PCCA pode ser conduzida na análise de dados a jusante.
3. Exportar resultados de nível de proteína do software proteômico. Remover proteínas contaminantes antes da análise estatística²⁹. Remova as proteínas com apenas 1 PSM ou nenhum resultado de quantificação. Realizar análise a termo de ontologia gênica de proteínas (GO) com Enrichr³⁰ e análise de rede de proteínas com STRING³¹.

Este estudo proteômico de marcação de proximidade de lisossomos foi conduzido em neurônios humanos derivados de iPSC para capturar o microambiente lisossômico dinâmico in situ em neurônios vivos. As morfologias celulares de hiPSCs e neurônios derivados de hiPSC em diferentes momentos são ilustradas na Figura 2A. As iPSCs humanas crescem em colônias em meio E8. A diferenciação é iniciada pelo revestimento de iPSCs em meio de indução de neurônios contendo doxiciclina. As extensões de neurite tornam-se mais visíveis a cada dia durante a diferenciação de 3 dias. Depois de mudar para placas revestidas de OLP em meio neurônio, os neurites formam uma rede entre os neurônios e as extensões axonais se tornam mais visíveis à medida que os neurônios atingem a maturação em 2 semanas. Em i³Neurônios, a localização da sonda APEX é validada por microscopia de fluorescência após ativação rápida do APEX. As proteínas biotiniladas são coradas usando o anticorpo estreptavidina (SA) e os lisossomos são corados usando o anticorpo anti-LAMP1. A imagem mesclada valida a localização correta do LAMP1-APEX para a proteína isca (Figura 2B).

O ensaio de titulação de contas é crucial para determinar a proporção ideal de contas para proteína, de modo que a quantidade de esferas de estreptavidina seja suficiente para enriquecer todas as proteínas biotiniladas, mas não tão excessiva para causar contaminação grave por estreptavidina em LC-MS. O volume ideal de contas necessário para 50 μg de amostra de proteína de entrada é selecionado com base em onde o decaimento exponencial da curva termina (Figura 3A) Como mostrado na Figura 3A, os sinais de dot-blot do sobrenadante de incubação de proteínas de contas diminuíram à medida que mais proteínas biotiniladas foram capturadas com quantidades aumentadas das esferas de estreptavidina. Para amostras endógenas de LAMP1-APEX, 5 μL de grânulos de estreptavidina foram ótimos para 50 μg de proteína de entrada (destacado na Figura 3A). Após o enriquecimento, a quantidade de proteína capturada pelas esferas de estreptavidina é desconhecida. O excesso de enzima proteolítica (tripsina) pode aumentar a autodigestão enzimática, com picos abundantes de peptídeos de tripsina na LC-MS. A tripsina excessiva também pode digerir mais peptídeos de estreptavidina nas amostras. Portanto, a quantidade de protease necessária para a digestão das contas deve ser otimizada. Em comparação com a tripsina isolada, a digestão em esferas com a mistura de tripsina/Lys-C resultou na identificação de mais proteínas e peptídeos e menos clivagens perdidas (Figura 3B). Além disso, 1-1,5 μg de protease por 250 μL de grânulos magnéticos de estreptavidina foi ideal para obter o maior número de proteínas identificadas e a menor porcentagem de clivagens perdidas (Figura 3C). Com uma ótima proporção de contas para proteína, a mesma quantidade de contas deve capturar a mesma quantidade de proteínas biotiniladas. Portanto, essa quantidade otimizada de protease pode ser usada para todos os experimentos que enriquecem proteínas biotiniladas usando as mesmas esferas magnéticas de estreptavidina.

As enzimas de marcação de proximidade à base de peroxidase são ativadas pela incubação de biotina-fenol e pelo breve_{tratamento com H}2 O₂ (1 min). Esta etapa é uma importante fonte de variação na proteômica de marcação de proximidade. Anteriormente, descobrimos que a normalização para a carboxilase mais abundante e endogenamente biotinilada, a PCCA, pode reduzir significativamente as variações experimentais, permitindo a comparação de dados proteômicos de marcação de proximidade em diferentes lotes experimentais (Figura 4)²². Para os neurônios endógenos LAMP1-APEX, a linha parental sem expressão da sonda LAMP1-APEX foi utilizada como grupo controle. Os neurônios controle também foram tratados com biotina-fenol e H2 O₂. A distribuição das razões proteicas da LAMP1-APEX versus o grupo controle é ilustrada na Figura 5A. Todas as carboxilases endogenamente biotiniladas foram enriquecidas por contas revestidas de estreptavidina, mas permaneceram inalteradas. Como demonstrado na análise GO-term e na análise da rede proteica (Figura 5B,C), tanto as proteínas estáveis da membrana lisossômica quanto os interatores lisossômicos transitórios relacionados ao tráfico e transporte endolisossômico foram enriquecidos em proteômica LAMP1-APEX^32,33,34.

Figura 1: Fluxo de trabalho geral para proteômica de marcação de proximidade de lisossomos em neurônios derivados de hiPSC. Abreviaturas: hiPSC = célula-tronco pluripotente induzida pelo homem; LAMP1 = proteína de membrana associada ao lisossomo 1; APEX = ascorbato peroxidase; dox = doxiciclina; PA = biotina-fenol; DCA = ensaio proteico compatível com detergente; SA = estreptavidina; LC-MS/MS = cromatografia líquida-espectrometria de massas tandem; PCCA = propionil-CoA carboxilase, uma proteína endogenamente biotinilada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem microscópica de neurônios derivados de hiPSC e atividade do LAMP1-APEX. (A) Imagens de microscopia de campo brilhante de diferentes estágios de hiPSCs e neurônios derivados de hiPSC. (B) Imagem de fluorescência da atividade da LAMP1-APEX no neurônio. Sinais biotinilados corados contra estreptavidina colocalizam-se com coloração LAMP1 fora do núcleo (HOECHST). Barras de escala = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Abreviaturas: hiPSC = célula-tronco pluripotente induzida pelo homem; LAMP1 = proteína de membrana associada ao lisossomo 1; APEX = ascorbato peroxidase; SA = estreptavidina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A otimização da relação entre contas e proteínas de entrada e a digestão enzimática de proteínas pode melhorar as identificações de proteínas e reduzir a interferência. (A) Exemplo de ensaio de titulação de contas resulta do ensaio dot-blot usando 50 μg de proteína de entrada e diferentes quantidades de esferas de estreptavidina. (B) A mistura tripsina/Lys-C resultou em melhor identificação de proteína/peptídeo e menos clivagens perdidas do que a tripsina isolada. (C) Otimização da quantidade de tripsina / Lys-C para a digestão em contas. Esse número foi modificado a partir de Frankenfield et ^al.22. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A normalização dos dados proteômicos de marcação de proximidade para uma carboxilase endogenamente biotinilada, a PCCA, pode reduzir as variações de quantificação entre as replicações biológicas. Esse número foi modificado a partir de Frankenfield et ^al.22. Abreviação: PCCA = propionil-CoA carboxilase. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Proteína de membrana lisossômica enriquecida com proteínas de membrana lisossômica enriquecida e proteínas de interação lisossômica em neurônios. (A) Gráfico de dispersão das razões de abundância de proteínas de LAMP1-APEX versus nenhum controle APEX mostrando proteínas de membrana lisossômica enriquecidas e proteínas biotiniladas endogenamente inalteradas. (B) Análise a termo GO dos resultados proteômicos comprovando o componente celular enriquecido no lisossomo. (C) Análise da rede de proteínas STRING mostrando que as proteínas interagem diretamente com a proteína de isca (LAMP1), proteínas de membrana lisossômica e interatores lisossômicos, como proteínas de tráfico de membrana. Esse número foi modificado a partir de Frankenfield et ^al.22. Abreviaturas: LAMP1 = proteína de membrana associada ao lisossomo 1; APEX = ascorbato peroxidase; GO = ontologia genética. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composições de meios e buffers utilizados neste protocolo.

Tabela 2: Solução de problemas e soluções.

Usando esta sonda LAMP1-APEX, as proteínas sobre e perto da membrana lisossômica são biotiniladas e enriquecidas. Dado o diâmetro típico do lisossomo de 100-1.200 nm, este método fornece excelente resolução intracelular com um raio de marcação de 10-20 nm. A LAMP1 é uma proteína de membrana lisossômica abundante e um marcador clássico para lisossomos, servindo como uma excelente proteína isca para a marcação de APEX lisossômico no nível de expressão endógena. No entanto, também existem limitações quando se utiliza a LAMP1 para atingir lisossomos, uma vez que a LAMP1 também está presente em endossomos tardios e lisossomos não degradativos³⁵. A maioria dos marcadores lisossômicos também é expressa em endossomos tardios, que eventualmente amadurecem em lisossomos. Proteínas de isca alternativas para os lisossomos alvo são LAMPTOR, LAMP2 e TMEM192^35,36,37. É importante notar que os radicais de biotina reativos não penetram na membrana. Portanto, a maioria das proteínas somente de lúmen lisossômico não é capturada neste método proteômico LAMP1-APEX. As proteínas do lúmen lisossômico podem ser obtidas por isolamento lisossômico através do método tradicional de centrifugação por gradiente ou imunopurificação lisossômica ^4,38. No entanto, as proteínas na membrana lisossômica podem ser interrompidas durante o isolamento lisossômico e perder a informação para interações lisossômicas transitórias e dinâmicas. Portanto, a marcação da proximidade lisossômica e o isolamento lisossômico podem ser combinados para obter um instantâneo completo das atividades lisossômicas fora e dentro dos lisossomos.

Para minimizar a variabilidade da cultura de neurônios-iPSC, a densidade de revestimento de neurônios deve ser consistente em todas as replicações biológicas e grupos de comparação. Os mesmos níveis de maturação neuronal e saúde também são críticos por esse motivo. Durante a ativação do APEX, a adição de biotina-fenol_{e H 2}O₂ às células deve ser conduzida por mistura prévia com meio de cultura quente e, em seguida, adicionando a mistura às células, seguida de agitação imediata e suave para garantir uma distribuição uniforme. O uso de H 2O₂ também levanta preocupações sobre o estresse oxidativo e perturbações no microambiente dinâmico da célula. Embora não tenham sido encontradas alterações significativas no nível de abundância de proteínas, mais peptídeos foram modificados com oxidação de metionina nos neurônios tratados com H₂O₂ versus neurônios controle²². Portanto, o controle rigoroso do tempo de ativação de H 2 O₂ (1 min) é fundamental para minimizar o estresse oxidativo e reduzir a difusão da_{nuvem de}biotina para garantir um raio de marcação específico ao redor da proteína da isca.

Para linhagens celulares não polarizadas, como HEK e U2OS, as células podem ser colhidas por peletização após marcação de proximidade para remover o sobrenadante contendo biotina livre. No entanto, os neurônios devem ser colhidos adicionando diretamente o tampão de lise celular à placa e raspando em tubos para evitar danos aos neurites e perda de amostras durante a peletização. A presença de biotina livre pode saturar as contas de estreptavidina. A remoção completa da biotina livre pode ser alcançada por múltiplas lavagens e incubação com tampão de têmpera em neurônios e / ou precipitação de proteínas após a lise celular. Como diferentes proteínas de isca têm diferentes níveis de expressão, um ensaio de mancha de ponto precisa ser conduzido para cada nova sonda APEX. Uma vez determinada a relação contas/proteína ideal, a quantidade de proteína inicial e o volume de esferas devem ser consistentes para todas as replicações para a mesma sonda APEX. Ao comparar diferentes sondas, como LAMP1-APEX versus citosolic-APEX, recomenda-se usar o mesmo volume de contas, mas variar a quantidade de proteína inicial para refletir as proporções ideais de contas / proteína para diferentes sondas APEX. Para reduzir ainda mais as variações experimentais e aumentar a produtividade, a marcação de isótopos estáveis por aminoácidos em cultura celular (SILAC) pode ser realizada³⁹. A marcação isobárica multiplexada também pode ser usada para rotular quimicamente peptídeos após a digestão de proteínas via TMT/iTRAQ/DiLeu tags ^20,40,41,42.

A marcação de proximidade tem sido amplamente aplicada para capturar o microambiente celular e molecular em vários organismos⁴³. No entanto, a marcação de proximidade ainda enfrenta muitos desafios técnicos, como a contaminação por sinais de estreptavidina, o uso de peróxido de hidrogênio para ativação enzimática e a presença de carboxilases mitocondriais endogenamente biotiniladas. Portanto, os experimentos proteômicos de marcação de proximidade exigem planejamento cuidadoso e controle de qualidade. Para ajudar os pesquisadores a solucionar problemas de seu experimento de rotulagem de proximidade, fornecemos um breve guia para problemas e soluções comuns na Tabela 2. Mais recentemente, um método de marcação de proximidade clivável foi desenvolvido usando biotina tiol-clivável²⁵. As proteínas biotiniladas podem, portanto, ser clivadas das contas usando um reagente redutor, como o TCEP, sem a necessidade de digestão nas contas. Este método de biotina clivista pode reduzir drasticamente os sinais de interferência da estreptavidina, carboxilases endogenamente biotiniladas e ligação inespecífica. Esforços contínuos aplicarão esse método de biotina clivável à proteômica LAMP1-APEX para melhorar a especificidade e a precisão da rotulagem. As sondas de marcação de proximidade também podem ser projetadas para atingir outros compartimentos subcelulares⁴⁴. A quantidade e o tipo de proteínas identificadas dependem da natureza da proteína de isca, seu ambiente intracelular e o nível de expressão da sonda de marcação de proximidade. Este método proteômico endógeno LAMP1-APEX fornece uma ferramenta valiosa para estudar a atividade lisossômica dinâmica em neurônios humanos. O protocolo detalhado e a otimização da metodologia também são aplicáveis a outras sondas de marcação de proximidade e biotinilação química, servindo como um recurso útil para a comunidade proteômica.

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este estudo é apoiado pela bolsa do NIH (R01NS121608). A A.M.F. reconhece a ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship e a Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Agradecemos ao laboratório Michael Ward do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) pelo apoio à biologia molecular e pelo desenvolvimento da tecnologia i³Neuron.