Um método direto e simples para avaliar a viabilidade da Drosophila melanogasterdo embrião ao adulto

Este protocolo é projetado avaliar a viabilidade de Drosophila em cada estágio desenvolvente, do embrião ao adulto. O método pode ser utilizado para determinar e comparar a viabilidade de diferentes genótipos ou condições de crescimento.

Na Drosophila melanogaster, os ensaios de viabilidade são utilizados para determinar a aptidão de certos fundos genéticos. Variações alélicas podem resultar em perda parcial ou completa da viabilidade em diferentes estágios de desenvolvimento. Nosso laboratório desenvolveu um método para avaliar a viabilidade em Drosophila do embrião ao adulto inteiramente maduro. O método baseia-se na quantificação do número de descendentes presentes em diferentes estágios durante o desenvolvimento, começando com embriões eclosionados. Após a quantificação dos embriões, são contados estágios adicionais, incluindo L1/L2, pupas e adultos maduros. Depois que todas as etapas foram examinadas, uma análise estatística tal como o teste do qui-quadrado é usada para determinar se há uma diferença significativa entre o número começar da progêia (embriões chocados) e umas fases mais atrasadas que culminam no número observado de adultos, assim, rejeitando ou aceitando a hipótese nula (que o número de embriões eclodidas será igual ao número de larvas, pupas e adultos gravados durante as fases de desenvolvimento). A principal vantagem deste ensaio é a sua simplicidade e precisão, pois não requer uma enxágüe de embrião para transferi-los para o frasco de alimentos, evitando perdas de erros técnicos. Embora o protocolo descrito aqui não examine diretamente as larvas L2/L3, etapas adicionais podem ser adicionadas para dar conta destes. Comparando o número de embriões eclodidas, L1, pupas e adultos pode ajudar a determinar se a viabilidade foi comprometida durante os estágios L2/L3 para estudos adicionais (o uso de alimentos coloridos ajuda com a identificação visual de larvas). Globalmente, este método pode ajudar pesquisadores e educadores da Drosophila a determinar quando a viabilidade é comprometida durante o ciclo de vida da mosca. A avaliação rotineira dos estoques que usam este ensaio pode impedir a acumulação de mutações secundárias que podem afetar o phenotype do mutante originalmente isolado, especial se as mutações originais afetam a aptidão. Por esta razão, o nosso laboratório mantém várias cópias de cada um dos nossos DM ime4 alelos e rotineiramente verifica a pureza de cada estoque com este método, além de outras análises moleculares.

A vida útil é afetada por fatores genéticos e não genéticos. Em condições padrão de crescimento do laboratório à temperatura ambiente, nosso laboratório observou variação significativa de aptidão e viabilidade entre os diferentes alelos DM ime4 cultivados em condições idênticas (Figura 1 e figuras complementares). Estudos de viabilidade são freqüentemente realizados para investigar os efeitos de uma determinada combinação de alelo ou condição de crescimento em estudos genéticos populacionais^1,2,3,4. Entretanto, as análises detalhadas da viabilidade dentro de um grupo não-complementar de mutações são duras de encontrar na literatura científica. Um alelo é geralmente rotulado como "não essencial" se o pesquisador encontrar alguns indivíduos homozygous para esse alelo dentro do frasco de alimento que abriga o estoque equilibrado^5,6. Entretanto, as análises exatas do qui-quadrado para avaliar se estes homozigotos levantam-se nas relações Mendelian esperadas não são relatadas^5,6. A temperatura mais permissiva para qualquer estoque de Drosophila é a temperatura ambiente (22-23 ° c) e, com nutrientes adequados, o ciclo de vida do tipo Wild voa demora aproximadamente doze dias para ser concluído^7,8. Como a duração de cada estágio de desenvolvimento do tipo Wild Drosophila é conhecida^{7,8, o}método descrito neste relatório pode ser usado para examinar se a cepa de Drosophila em estudo está apto em cada estágio em comparação com um controle apropriado para o fundo genético testado. Em contraste com estudos que se concentram em um aspecto específico do desenvolvimento⁹, este protocolo fornece uma maneira prática de avaliar a viabilidade em diferentes estágios de desenvolvimento.

Em nosso laboratório, este protocolo é usado para avaliar a viabilidade de estoques que são deficientes para o indutor de Drosophila da meiose 4 (DM ime4). DM ime4 é um gene essencial¹⁰ que codifica um metiltransferase do RNA com papéis críticos no metabolismo do RNA em Drosophila e em outros organismos multicelulares^{5,6,10, 11} anos de ^{, 12 anos} de ^{, 13} anos de ^{, 14} anos de _. Para avaliar rapidamente os novos alelos do DM ime4 gerados por meio de crispr/Cas9 (figuras complementares), foi realizado um ensaio de viabilidade de ponto final que só contava a descendência adulta produzida dentro de frascos de estoques equilibrados (Figura 1). Algumas das ações utilizadas foram descritas nos relatórios anteriores do DM ime4 ^5,6. Os mutantes homozygous emergiram nos níveis secundário-Mendelian, como determinado por análises do qui-quadrado (Figura 1 e materiais suplementares). Para avaliar se esses números inferiores aos esperados foram devidos a menos embriões colocados, ou menos embriões eclodidos, ou perda de viabilidade em L1/L2 ou pupas, expandimos o rastreamento para incluir contagens em cada um desses estágios de desenvolvimento (Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, figura 7, Figura 8e Figura 9).

Aqui, nós descrevemos o método usando Wild-Type (OreR) moscas. Para testar empiricamente este método para uso com outras origens genéticas ou espécies de Drosophila, recomendamos usar orer como referência e ajustar os temporais de acordo com o organismo experimental.  O protocolo foi mais avaliado para avaliar a viabilidade da progêia gerada pelo cruzamento de fêmeas virgens selvagens com machos de um heterozygous DM ime4 Mutant Stock^5,6( Figura 4).

1. preparação de mídia

1. Prepare o agar de uva de acordo com as instruções do fabricante (consulte a tabela de materiais) e despeje em uma placa de Petri de 35 mm para metade cheia (Figura 5).  Deixe solidificar por aproximadamente 1 h. Após o agar uva solidifica, imediatamente usar ou armazenar a 4 ° c.
2. Delicadamente fazer arranhões através da placa de agar usando uma pequena faca de plástico (moscas como para colocar em superfícies irregulares) deixando o meio da placa sem arranhões (Figura 5). Coloque uma pequena quantidade de pasta de levedura (feita fresca; ver tabela de materiais) no centro da placa (Figura 5).

2. coleção de embriões mini gaiola set up

1. Configurar uma cruz usando duas fêmeas virgens e um macho jovem dentro da gaiola de coleta de embriões contendo a placa de agar de uva suplementada com pasta de levedura (Figura 5).
2. Após 24 h, inspecione as gaiolas para embriões colocados sem abrir a gaiola olhando para a parte inferior da placa de agar.  Se os embriões tiverem sido colocados, retire a placa de agar da câmara e coloque-a dentro de uma câmara húmida para observação microscópica (Figura 6).  Se vários dias de postura são marcados (por exemplo, ensaios de fertilidade/longevidade), manter os pais reprodutores e substituir a placa com um fresco preparado como descrito. As coleções adiantadas de menos de 24 h podem ser feitas mas, ao usar fêmeas virgens, esteja ciente que não estabelecerá até 48 h após ter emergido de seu caso do pupa.
3. Cubra a placa de agar contendo embriões com a tampa do prato de Petri para evitar a desidratação e coloque-a imediatamente dentro de uma câmara húmida (Figura 7). Observar um microscópio de dissecação e registrar embriões eclosão e L1.  Substitua a tampa e armazene à temperatura ambiente em câmara úmida até que todos os embriões tenham eclodidas e se desenvolvesse em larvas de L1 (Figura 6).

3. contando embriões e larvas

1. Após 48 h, observe as placas o microscópio de dissecação e registre os números uma última vez antes da transferência do disco do agar ao frasco do alimento.  Embriões fertilizados/viáveis devem se tornar L1 até então.  Períodos de incubação mais longos antes da transferência são possíveis, mas esteja ciente de que as placas podem começar a perder a umidade e o agar pode rachar comprometendo uma transferência limpa para frascos de alimentos (Figura 7).  Para garantir que as placas permaneçam hidratadas e a viabilidade embrionária não seja comprometida durante a contagem, evite usar uma luz de gooseneck direta sobre a superfície do agar (Figura 7E mostra uma distância adequada).
2. Depois de contar, cubra a placa e guarde-a na câmara húmida até estar pronta para a transferência. Recorde de descobertas.

4. Transfira o disco de agar uva para um frasco para injetáveis de alimentos para monitorizar a viabilidade durante o desenvolvimento

1. Uma vez que os números são gravados (embriões/L1/L2), use uma espátula para transferir cuidadosamente o disco de agar uva para um frasco grande o suficiente para acomodar um disco de 35 mm contendo os meios alimentares de Drosophila preparados de acordo com as instruções do fabricante (consulte a lista de reagentes). Coloque o disco de agar de uva L1-lado para baixo sobre o alimento (Figura 7).  Depois de transferir o disco de agar com larvas para o frasco para injetáveis de alimentos, Inspecione cuidadosamente a placa de Petri vazia para as larvas deixadas para trás (Figura 7E).
2. Configurar um cronograma para inspecionar os frascos de alimentos diariamente, em aproximadamente a mesma hora todos os dias, para garantir que as larvas L2/L3 sejam observadas fazendo o seu caminho para o alimento no frasco (Figura 8).
3. Registre o número de pupas e a Drosophila adulta (Figura 9). Continue contando até que não mais adultos são observados e evitar a contagem da seguinte geração (não conte passado 9 dias depois de observar os primeiros adultos).
4. Observe e registre as descobertas. Ajuste o período de coleta de embriões, contando e gravando de acordo com o estoque mutante que está sendo usado.
5. Realize uma análise do qui-quadrado. A hipótese nula assume 100% de viabilidade, de tal forma que o número de adultos será igual ao número de embriões eclodidos e L1 originalmente gravado e transferido para os frascos para injetáveis de alimentos

Esse método permite, de forma precisa e revisível, avaliar a viabilidade dos embriões aos adultos emergidos quando acoplados às análises do qui-quadrado.

Em estudos iniciais, após a contagem de embriões e larvas, o agar de uva foi colocado no interior do frasco para injetáveis na vertical do lado do frasco para injetáveis. Infelizmente, quando o agar foi colocado no lado do frasco, muitos dos embriões e larvas não amadureceram para adultos. Isso foi provavelmente devido à secagem do disco de agar uva (Figura 3). Esta colocação introduziu uma variável ambiental (hidratação do disco de agar) que poderia confundir os resultados. Aproximadamente 39% da progêia foi perdida entre os embriões para adultos, pois apenas 61% dos adultos emergiram. As maiores perdas ocorreram entre as larvas de L1 (contadas na superfície de placas de agar uva) e as pupas (contadas em paredes de frascos de alimentos) contam. No entanto, quando o agar de uva foi colocado enfrentado no interior do frasco para injetáveis em contato direto com a superfície do alimento, perdeu-se menos de 6% da progêia (Figura 2). O agar permaneceu hidratado à medida que todo o disco de agar de uva permaneceu em contato com a umidade do alimento instantâneo dentro do frasco (Figura 7, Figura 8). Esses resultados indicam que a posição do agar no interior do frasco é importante para a obtenção de dados confiáveis e minimizar a contribuição das variáveis ambientais. Outros dados para subsidiar a efetividade do método foram coletados comparando-se a descendência de tipo selvagem utilizada na validação do método inicial e a progêia produzida pelo cruzamento de fêmeas virgens de tipo selvagem a machos de um estoque equilibrado de DM ime4 Mutant ( Complementar Figura 2, IME4ΔNULL/TM3^SB). Aproximadamente 91% da progêia amadureceu para a idade adulta em comparação com 94% da progêia do tipo tipo selvagem (Figura 4).  Essa diferença não foi estatisticamente significante.

Machos homozygous do mutante do DM ime4 ⁵ foram usados igualmente para fornecer a validação mais adicional do método. Entretanto, os mutantes homozygous eram demasiado doentes para reproduzir-se e morrido antes que os embriões estiveram depositados. Portanto, uma limitação do experimento é que os machos precisam ser saudáveis o suficiente para se reproduzir para gerar uma população embrionária inicial para rastrear.

Figura 1 : DM ime4 os estoques mutantes emergem em níveis Submendelianos. Os estoques em que partes do domínio catalítico ou do domínio de ligação ADO-Met foram mutado são mostrados (refira a Figura suplementar 1 para detalhes). Alguns estoques tiveram porções de um ou outro domínio substituído com o ala (mutagenesis da alanina-exploração), quando outros estoques tivessem um ou ambos os domínios suprimidos. A proporção de número observado de homozigotos para os números esperados é representada em porcentagens (em comparação com os controles irmãos heterozigotos, referem-se à Figura 3 suplementar para esquema de triagem e análise do qui-quadrado). Foram realizadas análises do qui-quadrado para determinar se a diferença entre observado e esperado foi estatisticamente significante e não devido ao acaso isoladamente (p-valores < 0, 1). As barras de erro representam o erro padrão da média (mínimo de três ensaios por Cruz indicado).  Uma planilha com todos os dados pode ser encontrada em materiais complementares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : A posição do agar no interior do frasco pode introduzir variáveis ambientais não intencionais. Histograma do número de indivíduos em diferentes estágios de desenvolvimento contados a partir do lado do embrião de disco de agar uva para baixo no frasco para injetáveis de alimentos ou Agar na lateral do frasco para injetáveis de alimentos. Colocar o disco de ágar embrião-lado para baixo no frasco resultou em 94% (DP ± 0, 2) de embriões iniciais sobreviventes até a idade adulta. Colocar o agar no lado do frasco de alimentos resultou em apenas 61% (DP ± 0, 7) dos embriões originalmente contados atingindo a idade adulta. Uma planilha com todos os dados pode ser encontrada nos materiais complementares. Os números esperados em cada fase são definidos como o número inicial de embriões/L1 contados no disco de agar de uva antes da transferência para o frasco para injetáveis de alimentos (hipótese nula: 100% dos embriões eclosão se desenvolvem). Os números observados são o número real de indivíduos contados para o estágio de desenvolvimento indicado. Assim, cada estágio é comparado com o número inicial de embriões de eclosão contados na placa de agar uva. Foram realizadas análises do qui-quadrado para determinar se a diferença entre observado e esperado foi estatisticamente significante e não por chance isoladamente por meio de um limiar de p-valor de 0, 5. A diferença foi significativa para os embriões cultivados com agar no lado do frasco para injetáveis de alimentos, mas não para aqueles cultivados em um lado do embrião do disco para baixo. As barras de erros representam um erro padrão (mínimo de três ensaios por Cruz indicado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Os desenhos animados que mostram duas maneiras que os discos do agar da uva que carreg embriões/L1s podem ser coloc dentro do frasco do alimento. Houve diferença significativa entre o número total de embriões e a descendência adulta com base na posição do agar no frasco para injetáveis de alimentos. A diferença decorre de uma variável ambiental (hidratação) criada pela diferença na colocação do disco dentro do frasco de alimentos: há uma diferença estatisticamente significante entre os números esperados e observados nas larvas e as pupas contam quando o agar disco foi colocado no lado do frasco versus nenhuma diferença significativa nos números esperados versus observados quando o disco de agar estava em contato com o alimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Histograma mostrando o número de indivíduos em diferentes estágios de desenvolvimento de machos do tipo selvagem versus machos de um estoque equilibrado DM ime4 mutante. Machos equilibrados cruzaram-se com fêmeas do tipo selvagem virgens como descrito em 2,1.  O agar foi transferido do lado do embrião para baixo em frascos de alimentos.  A razão média dos adultos emergentes dos embriões originais contados em discos de agar uva de Wild-Type X Wild-tipo foi de 94%, DP ± 0, 2, enquanto que essa razão para DM ime4 Mutant/+ X Wild-Type foi de 91%, dp ± 0, 1. A análise estatística foi realizada conforme descrito na Figura 2; diferenças não foram significativas para ambos os grupos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Configuração experimental. (A) mini-gaiolas de coleta de embriões e pratos de mini-Petri de uva-agar. As placas são colocadas dentro de uma câmara úmida (prato de Petri padrão com disco de papel absorvente saturado com água) para evitar a desidratação.  Uma pequena quantidade de pasta de levedura foi colocada no centro de cada placa de uva-ágar.  (B) Retire a tampa do suporte da placa de recolha de embriões (vermelha) e coloque uma placa preparada, lado do fermento para cima.  (C) transfira a Cruz para a gaiola do embrião e coloque imediatamente uma tampa da placa de Petri para segurar as moscas dentro.  (D) Remova rapidamente a tampa e gire a gaiola do embrião assim que a abertura contata a placa da uva-ágar.  Incubar para 24-48 h, inspecionando diariamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Desenvolvimento embrionário em placas de uva-ágar. (A) os embriões de wildtype depositados nos pratos de mini-Petri de uva-Agar são contados um microscópio de dissecação. Mantenha as placas dentro da câmara húmida quando não Visualizar e evite a luz direta para impedir a desidratação.  (B) as placas de uva-Agar são mantidas em uma câmara úmida e os embriões de tipo selvagem eclosão são gravados.  Esta foto mostra três larvas de L1 tipo selvagem que se desenvolveram dos embriões mostrados em a.  (C) exemplo de números registrados de embriões (dia 1) e larvas de L1 (dia 2) para as duas placas mostradas na Figura 5.  O "número esperado" para a hipótese nula é determinado pelo número de embriões que eclodidos e se tornaram larvas L1 no momento da transferência para o frasco para injetáveis de alimentos (tabela abaixo).  Para moscas silvestres, quase todos os embriões chocam e se desenvolvem em larvas de L1.  Isso pode não ser o caso de outras origens genéticas e esse método é usado para determinar essas diferenças de viabilidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Transferência de larvas.  (A) após a gravação da contagem de L1, os discos de uva-ágar são cuidadosamente retirados da placa de Petri utilizando uma espátula limpa (apagada por etanol) (B,C) e o lado L1 transferido para baixo para entrar em contacto com os alimentos nos frascos, como indicado em D.  (E) o prato de Petri vazio é cuidadosamente inspecionado para detectar qualquer larva deixada para trás.  Se larvaee deixados para trás estão vivos e podem ser transferidos para o frasco de alimentos, fazê-lo com cuidado e imediatamente (F).  Se as larvas deixadas para trás estiverem mortas ou não puderem ser transferidas, registre esse fato para corrigir o "número esperado" para cálculos subsequentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8 : As larvas de L2 fazem seu caminho para o alimento. Veja fendas e ranhuras entre o disco de uva-ágar e a comida azul.  Configurar um cronograma para observar os frascos diariamente, de preferência na mesma hora do dia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9 : Emergência adulta. (A) as larvas L3 saem do alimento para se tornarem pupas.  (B) adultos começam a surgir no dia 11.  Configurar um cronograma para observar os frascos diariamente, de preferência, na mesma hora do dia e cuidadosamente gravar suas observações.  Pare de contar quando todas as pupas surgiram (contagem de casos de pupas vazias) e evitar a contagem da próxima geração de moscas, parando o experimento no dia 15 e contar pupas mortas se houver (pupas pretas/secas).  Mutantes com ciclos de vida mais longos podem necessitar de longos períodos de tempo, que precisam ser determinados empiricamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materiais complementares. Por favor , clique aqui para baixar esses arquivos.  

Em resumo, este método fornece uma avaliação exata e simples da viabilidade em Drosophila. O protocolo inteiro demora aproximadamente 14 dias para ser concluído. O procedimento não requer competências técnicas de peritos; Entretanto, o sincronismo apropriado, uma programação de observações diárias, e a transferência cuidadosa do agar são importantes para a exatidão e a reprodutibilidade.

Além da colocação do disco de uva-ágar embrião-lado para baixo no frasco para injetáveis de alimentos, outro passo crucial no procedimento é a transferência do disco de agar para um frasco de alimentos, o mais tardar 48 h após a remoção da placa de agar uva da coleta de embriões mini gaiolas. A transferência do agar após 48 h resultou em perda de embriões e larvas, provavelmente devido à desidratação do disco de agar. Para contar transições L2/L3, a placa precisa de incubar para 72 h. Se esta fase for crucial, as placas de agar de uva devem ser derramadas mais grossas e uma câmara húmida deve ser utilizada para evitar a dessecação. As cruzes foram estabelecidas em gaiolas de coleta de embriões que acomodam placas de 35 mm; Entretanto, este procedimento pode ser executado usando gaiolas maiores da coleção do embrião também, tal como um que acomoda 60 milímetros ou placas de Petri de 100 milímetros.  Os frascos de alimento devem então ser grandes bastante acomodar aqueles tamanhos.

Há etapas que podem ser adicionadas a este protocolo. Como mencionado acima, as transições L2/L3 são desafiadoras para quantificar em placas devido ao tempo necessário e a desidratação potencial do agar. Além disso, as larvas se tornam altamente móveis na superfície do agar, colocando um desafio para contá-los com precisão. Colocar as placas na geladeira por 30 min ou adicionar algumas gotas de um anestésico leve (solução de lidocaína) na superfície do agar antes de contar as larvas L2/L3 pode ajudar a retardar seus movimentos para contá-los com mais precisão.  Uma advertência a essas modificações é que elas podem introduzir variáveis (sensibilidade ao frio, sensibilidade anestésica) e confundir os resultados de viabilidade.  Mesmo sem esses passos, usando alimentos coloridos, os pesquisadores podem quantificar vagando L3s/prepupae como eles se instalam no lado dos frascos de alimentos para iniciar a pupação. Uma limitação a este método é que exige os adultos usados nos cruzamentos para sobreviver sendo anestesiados com o co₂ para fenotipagem para estabelecer as cruzes nas gaiolas da coleção do embrião. DM ime4 machos mutantes homozygous não se recuperam bem e morrem algumas horas após acordar do tratamento de co₂ .  Outros métodos para imobilizar adultos para a triagem podem ser explorados, como a colocação de frascos na geladeira por alguns minutos e, em seguida, transferir frascos para gelo esmagado para retardar o movimento e classificar de forma rápida e eficiente.

Além de comparar os pontos fortes alélicos e seus efeitos sobre a viabilidade, este método pode ser usado para a sensibilidade da tela ou resistência a compostos farmacêuticos definidos. Ao contrário de outros métodos que a toxicidade composta da tela na cultura de pilha¹⁵,^16,17,18, este método usa organismos inteiros, fazendo a avaliação de efeitos desenvolventes mais fáceis de analisar. Em suma, usando este protocolo e modificações nele, permitirá medir pontos fortes alélicos, bem como os efeitos dos fatores ambientais e compostos químicos sobre a viabilidade da Drosophila , fecundidade, fertilidade, tempo de vida, e duração de ciclo de desenvolvimento.

Não há conflitos de interesse.

Nosso trabalho é financiado por NIH 1R15GM1131-01 para CFH e NIH PA-12-149 para CFH.