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A hibridação in situ cromogênico do RNA do papilomavírus humano (HPV) é considerada ser um dos padrões do ouro para a deteção humana ativa da infecção do papilomavírus dentro dos tumores. Permite a visualização da expressão de mRNA de HPV E6-E7 com localização e avaliação semiquantitativa de seu sinal.
A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é um fator de risco importante para um subtipo de carcinoma epidermóide orofaríngeo (OPSCC), que tende a estar associado a um melhor desfecho do que o OPSCC relacionado ao álcool e ao tabaco. A hibridação in situ chromogenic (cish) do RNA viral de HPV poderia permitir a avaliação semiquantitativa de transcritos virais das proteínas oncogênico E6 e E7 e de um visualização in situ com uma boa definição espacial. Essa técnica permite o diagnóstico de uma infecção ativa com a visualização da transcrição do HPV nas células tumorais infectadas pelo HPV. Uma vantagem desta técnica é a vacância da contaminação das pilhas HPV-infectadas nonneoplastic adjacentes ao tumor. Globalmente, seus desempenhos bons do diagnóstico têm-no considerado ser o padrão do ouro para a identificação ativa da infecção de HPV. Desde que a interação viral da proteína E6 e E7 com proteínas da pilha PRB e p53 é obrigatória para a transformação da pilha, o RNA cish de HPV é funcional relevante e reflete agudamente a infecção oncogênico ativa de HPV. Esta técnica é clinicamente relevante, bem como os níveis de transcrição do HPV "baixo" ou "alto" ajudaram na identificação de dois grupos de prognóstico entre os pacientes com câncer de cabeça e pescoço P16-positivos relacionados ao HPV. Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças parafina-encaixadas formalin-fixadas (FFPE) com um jogo obtido do fabricante. Em vez de revelação cromogênica, a hibridação in situ de RNA também pode ser realizada com revelação fluorescente (RNA FISH). Também pode ser combinada com imunocoloração convencional.
O RNA cish de HPV é uma ferramenta poderosa para a deteção da infecção ativa de HPV, que pode provar crucial em lesões benignas ou malignos em vários locais tais como o orofaringe ou o colo uterino. A detecção de uma infecção ativa por HPV pode apoiar o diagnóstico de uma lesão induzida pelo HPV e, assim, influenciar seu tratamento e prognóstico.
O HPV é a infecção sexualmente transmissível mais frequente, e mais de 100 genótipos virais foram descritos1. De forma esquemática, genótipos de baixo risco, como os genótipos 6 e 11, são conhecidos por induzir verrugas genitais, papilomatose respiratória recorrente e outras lesões benignas, enquanto genótipos de alto risco, como genótipos 16 e também 18, são responsáveis pela maioria dos cânceres cervicais e cânceres Anais e desempenham um papel na oncogênese da HNSCC em proporções variáveis como contabilizadas por dados epidemiológicos regionais2.
Várias ferramentas estão disponíveis para a detecção de infecção por HPV. Como uma infecção por HPV de alto risco leva à expressão de proteínas oncogênicas virais E6 e E73, a detecção de transcritos E6 e E7 é amplamente vista como o padrão-ouro para a identificação ativa da infecção pelo HPV4. O RNA CISH de HPV pode ser executado em amostras de FFPE que são obtidas completamente facilmente dos pacientes que sofrem de várias doenças HPV-relacionadas. Seu desempenho tem sido avaliado em neoplasia intraepitelial escamosa no colo do útero, no ânus e na vagina, e no carcinoma epidermóide invasivo no colo do útero, no ânus e no trato aerodigestivo superior5: atinge uma sensibilidade de mais de 98% entre os casos positivos da reacção em cadeia do polymerase do ADN de HPV (PCR). Isto é ligeiramente melhor do que a imunomarcação P16 (93%) e a hibridação in situ do ADN de HPV (ADN ISH: 97%), que são mais de uso geral. Em outra coorte de 57 pacientes com carcinoma epidermóide (CEC) decorrente da região da cabeça e pescoço, da região genital, da pele e do trato urinário, comparado ao DNA do HPV, o ARN do HPV CISH obteve melhor sensibilidade (100% versus 88%) e especificidade (87% versus 74%)6.
A imunocoloração P16 é um marcador indireto refletindo o rompimento do ciclo celular que pode ser causado (mas não exclusivamente) pela infecção pelo HPV4,7. Este teste rentável possui boa sensibilidade e um valor preditivo negativo e é recomendado como um marcador substituto de infecção por HPV de alto risco no câncer de orofaringe (OPC) pelo Colégio de patologistas americanos (PAC) e pela União para o internacional Controle do câncer (UICC)8.
Embora este papel focalize unicamente na deteção do HPV em HNSCC, o RNA CISH de HPV é clinicamente relevante em várias outras circunstâncias que envolvem a infecção de HPV. Por exemplo, essa técnica pode melhorar a acurácia do diagnóstico de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau do colo do útero (LSIL, anteriormente conhecida como neoplasia intraepitelial cervical, grau 1 [NIC1]) para casos morfologicamente ambíguos9. Em relação ao CEC orofaríngeo, o ARN do HPV CISH permite a identificação do CEC relacionado ao HPV, rotulado como distinto do SCC orofaríngeo não relacionado ao HPV na recente oitava edição da classificação TNM do câncer de cabeça e pescoço (da União para câncer internacional Controle [UICC])10. Desde que o SCC HPV-relacionado apresenta um prognóstico melhor com sobrevivência mais longa e sensibilidade aumentada da radioterapia e da quimioterapia do que o SCC-não relacionado HPV11,12,13, a deteção da infecção de HPV pode impactar gerência paciente14,15. Adicionalmente, o RNA CISH de HPV pode ser usado para o diagnóstico da carcinoma sinonasal multiphenotypic HPV-relacionada com um sinal mais elevado do que o ADN CISH16de HPV. Várias análises multivariadas sugerem que a detecção de transcritos E6 e E7 está correlacionada com um melhor prognóstico em CEC orofaríngea global7,15,17,18 e no subgrupo de SCC orofaríngea P16-positivo19,20.
Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças de FFPE com um jogo obtido do fabricante.
O protocolo segue as diretrizes éticas e foi aprovado pelo Comitê de ética (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. preparação dos materiais
2. reforço da aderência e desparaffinization na capa das emanações
Nota: iniciar o protocolo com amostras histológicas de 3 – 5 μm de espessura montadas em lâminas não manchadas.
3. pré-tratamento de tecidos
Nota: estas etapas seguem a recomendação de pré-tratamento "padrão" de acordo com as instruções do fabricante para amostras de cabeça e pescoço. O sincronismo das seções 3,1 e 3,2 pode precisar de ser ajustado dependendo do tecido manipulado.
4. executar o ensaio
Nota: não deixe secar as secções entre as etapas de incubação.
5. detecção de sinal com 3, 3 '-diaminobenzidina
PRECAUÇÃO: a diaminobenzidina (DAB) é tóxica. Siga as precauções apropriadas e as diretrizes de segurança ao descartar e manusear este produto químico.
6. contrcoloração
7. desidratação
8. montagem da corrediça
9. avaliação da amostra
Como descrito aqui, no cancro de pilha Squamous da cabeça e da garganta, um caso pode ser considerado positivo na presença de mancha punctiforme marrom no citoplasma ou nos núcleos de pilhas do tumor. Na maioria dos estudos, o sinal é considerado como "positivo" ou "não detectado"14. Métodos de semiquantificação do sinal foram relatados, mas falta de padronização entre as equipes. Por exemplo, em alguns estudos, os sinais foram marcados como 1 + com 1 – 3 pontos por célula tumoral, 2 + com 4 – 9 pontos por célula tumoral, ou 3 + com 10 pontos ou mais por célula tumoral6; em análises post hoc, foram levados em consideração apenas os sinais de 2 + e 3 +, que eram mais fáceis de interpretar. Em outro estudo, os resultados foram divididos em dois escores: RNA CISH "alto" e RNA CISH "baixo". O escore de RNA CISH "alto" foi definido por mais de 50% das células cancerosas manchadas, ou pela coloração cobrindo mais de 80% da superfície celular (núcleo e citoplasma) em pelo menos 30% das células cancerosas, como observado com um objetivo de 20x (Figura 1)21.
Em relação aos controles positivos, o sinal PPIB deve ser visível como pontos punctados dentro de núcleos celulares a uma ampliação de 20x – 40x. Quanto aos slides de controle negativo, um ponto para cada 10 células exibindo fundo DAB coloração por 20x microscópio campo é aceitável.
Figura 1: exemplos de coloração "baixa" e "alta" de RNA CISH. (A e B) Escore "baixo" do RNA cish que mancha em carcinomas de pilha Squamous orofaríngea. A coloração é observada em 50% das células tumorais e cobre menos de 80% da superfície celular. (C e D) escore de RNA cish "High" em carcinomas de células escamosas orofaríngeas. A coloração é observada em mais de 50% das células tumorais e, neste caso, a superfície de coloração excede 80% em mais de 30% das células tumorais. Este número foi modificado de Augustin et al.21por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O RNA CISH de HPV executado com um jogo comprado é uma ferramenta poderosa para a deteção de transcritos virais e indica a infecção ativa de HPV. Executado manualmente, as etapas do protocolo são gerais fáceis de seguir, e o kit comprado é conveniente. Esta técnica permite a coloração de 19 amostras histológicas mais uma corrediça do controle de uma vez, e o ensaio dura ao redor 8 h. É crítico não deixar as amostras secar entre as etapas a menos que mencionado de outra maneira. A condição do pré-tratamento pode precisar de ser ajustada dependendo do tecido manipulado.
O sinal da expressão de HPV E6-E7 mRNA é detectado com uma definição espacial precisa, assim descartando toda a contaminação das pilhas nonneoplastic HPV-infectadas adjacentes ao tumor. A detecção do RNA E6 e E7 do HPV é funcionalmente relevante, uma vez que essas transcrições são necessárias para a transformação celular induzida pelo HPV através de sua interação com as proteínas celulares p53 e pRb4. Portanto, em lesões pré-cancerosas do colo uterino, o RNA CISH do HPV pode ajudar a discriminar lesões intraepiteliais de baixo grau (LSIL) de lesões intraepiteliais de alto grau (HSIL) de acordo com a localização do sinal: na maioria dos casos de LSIL, abundante núcleos de coloração difusa são rotulados em toda a espessura epitelial, indicando uma fase produtiva. HSIL exibem núcleos diffusamente manchados abundantes da pilha na camada superficial, coexistindo com sinais pontuate nucleares e cytoplasmic fortes na camada mais baixa (nas lesões conhecidas anteriormente como CIN2), ou a mancha nuclear forte com pontos cytoplasmic ao longo da espessura do epitélio, indicando a fase transformadora da infecção pelo HPV (em lesões anteriormente conhecidas como NIC3)22.
Embora ainda não exista recomendação padrão para a avaliação semiquantitativa do sinal, alguns autores relatam uma relevância clínica, uma vez que a avaliação semiquantitativa das transcrições do HPV E6 e E7 permitiu a identificação de dois fatores prognósticos grupos de doentes com HNSCC relacionados com o HPV21. Tem sido postulado que a detecção de DNA de HPV sem transcritos E6 e E7 ou com apenas baixos níveis de transcritos E6 e E7 seria funcionalmente irrelevante e que tais pacientes devem ser agrupados com pacientes com câncer HPV-negativos21, a 23.
Em relação às limitações deste procedimento, é postulado que algumas hibridizações cruzadas não específicas podem acontecer em alguns casos, como a hipótese de Dreyer et al.23 o RNA cish pode não ser adequado para discriminação entre TRANSCRITOS de RNA E6/E7 e viral ADN, como o protocolo inclui uma etapa do tratamento térmico de 100 ° c, que seja suspeitada para permitir a desnaturação viral23do ADN. Isto é apoiado pela observação de dois tipos de sinais nos casos positivos, a saber a mancha forte localizou-se principalmente em núcleos da pilha do tumor, assim como um sinal granulado fino no citoplasma. Como a sonda utilizada neste protocolo vincula especificamente os genótipos 16 e 18 do HPV, que estão envolvidos em uma grande maioria de HNSCC4relacionado ao HPV, casos ocasionais associados ao HPV podem ser perdidos pelo RNA cish, seja por causa de certos genótipos de HPV que não são incluídos na sonda, ou por causa de mutações ou deleções de sítios de encadernação de primer. Finalmente, este método exige reagentes e dispositivos caros e não é facilmente acessível na prática rotineira.
Para cada amostra, um total de três seções são necessários: um para executar o teste de HPV, um para o controle positivo, e um para o controle negativo. Como o RNA é uma molécula frágil e pode deteriorar-se ao longo do tempo em amostras de FFPE, a qualidade das transcrições tem de ser verificada para cada amostra, utilizando sondas de controlo positivas tais como PPIB, ADN-dirigida RNA polimerase II subunidade RPB1 (Polr2a), ou polyubiquitin-C (UBC) , que são genes de limpeza humana. Além disso, quando há uma aproximação semiquantitativa, o sinal deve ser normalizado à ponta de prova21do controle do gene da limpeza. O controlo positivo recomendado para cada tecido pode ser encontrado nas instruções do fabricante. Entretanto, um estudo recente confirma que a expressão do mRNA pode ser estudada robustamente em amostras prospectivas e retrospectivas, mostrando níveis de mRNA comparáveis entre as amostras de 2004 e de 2008. Isto é a favor da integridade relativa do mRNA ao longo do tempo24. A sonda de controle negativa recomendada usada para evitar manchas inespecíficas é a codificação genética bacteriana para DAPB.
Aqui a hibridação in situ cromogênico do RNA de HPV é descrita como executada manualmente. Esta técnica também pode ser realizada com rotulagem fluorescente e/ou combinada com imunocoloração convencional.
CB: conselhos, seminários: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche
Os autores agradecem ao departamento de patologia de Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle legall); a plataforma de histologia do PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para edição de idioma; Alexandra Elbakyan por sua contribuição.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
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