Detecção de vírus de Bioaerossóis usando resina de troca de ânion

Um ânion trocar o método à base de resina, adaptado para amostragem de bioaerosol baseado em choque de vírus é demonstrada o líquido. Quando acoplado com deteção molecular a jusante, o método permite a fácil e sensível de detecção de vírus de Bioaerossóis.

Este protocolo demonstra um método de amostragem de bioaerosol personalizado para vírus. Neste sistema, a resina de troca de ânion é acoplada com dispositivos de amostragem líquida baseada no choque do ar para a concentração eficaz de vírus com carga negativa da Bioaerossóis. Assim, a resina serve como um passo adicional de concentração do fluxo de trabalho de amostragem de bioaerosol. Extração de ácidos nucleicos de partículas virais, em seguida, é executada directamente a partir da resina de troca de ânion, com a amostra resultante apropriada para análises moleculares. Além disso, este protocolo descreve uma câmara de bioaerosol custom-built, capaz de gerar Bioaerossóis carregados de vírus sob uma variedade de condições ambientais e permitindo a monitorização contínua das variáveis ambientais tais como temperatura, umidade, velocidade do vento e a concentração em massa de aerossol. A principal vantagem de usar este protocolo é o aumento da sensibilidade de detecção viral, avaliada através da comparação direta para um impinger líquido convencional sem modificações. Outras vantagens incluem o potencial de concentrar diversos vírus de carga negativa, o baixo custo da resina de troca de ânion (~$0.14 por exemplo) e facilidade de uso. As desvantagens incluem a incapacidade do presente protocolo para avaliar a infectividade de resina-adsorvido em partículas virais, e potencialmente a necessidade para a otimização da reserva líquida de amostragem usado dentro do impactor.

A finalidade desse método é proporcionar uma plataforma de amostragem de bioaerosol altamente sensível para facilitar a detecção molecular do vírus de carga negativa de Bioaerossóis. Microorganismos, incluindo partículas virais, Bioaerossóis podem sobreviver por longos períodos de tempo de¹. Bioaerossóis podem viajar distâncias relativamente longas e manter a viabilidade e a infectividade, como evidenciado por um surto de doença do legionário que originou-se industrial localizados a uma distância de 6 km dos indivíduos afetados de torres de resfriamento e resultou em 18 mortes². Transmissão indirecta de vírus para os seres humanos mediados por Bioaerossóis pode ocorrer em várias configurações e tem sido demonstrado por norovírus surtos em escolas e restaurantes^3,4. Da mesma forma, bioaerosol transmissão do vírus pode ocorrer em configurações agrícolas como em explorações de suínos e aves de capoeira, com esta rota de transmissão, sendo considerada como um fator importante no movimento de vírus entre as instalações de produção^{5, 6 , 7 , 8 , 9}.

Amostragem eficaz de Bioaerossóis carregados de vírus permite a melhoria no diagnóstico rápido e preparação para a prevenção da epidemia, como mostrado em manifestações nas quais H5 gripe, um vírus foram detectados de Bioaerossóis no animal vivo comercializa na China e a Estados Unidos^10,11. Tecnologias atuais de amostragem de bioaerosol envolvem uma série de princípios de captura de partículas diferentes e podem ser amplamente classificadas em impingers, ciclones, pêndulos e filtros¹². Está além do escopo do presente protocolo a cobrir exaustivamente todas as vantagens e desvantagens dessas plataformas para amostragem de vírus de Bioaerossóis; no entanto, pode ser declarado que a maioria destes dispositivos de amostragem não foram otimizada para a coleção de vírus e bacteriófagos¹³. Além disso, infecciosidade de partículas virais é muitas vezes negativamente, com líquido impingers considerados para manter a infectividade viral mais eficazmente do que dispositivos como sólidos de pêndulos ou filtros¹⁴de amostragem. No entanto, uma desvantagem de choque do líquido é o efeito de diluição do alvo, que ocorre porque os vírus são coletados em volumes relativamente grandes (tipicamente ≥ 20 mL) de líquido no recipiente coleção. Outra desvantagem importante envolve a eficiência subótima de líquido impingers para concentrar partículas < 0.5 µM em tamanho¹⁵. No entanto, eficiência de captura desses dispositivos pode ser melhorada por imobilização em matrizes sólidas, como imobilização pode aumentar a conservação do viral de ácidos nucleicos e infectividade viral^16,17.

Nós demonstramos anteriormente que a resina de troca de ânion é uma ferramenta eficaz para a captura e a concentração de vírus do líquido matrizes, incluindo F-RNA bacteriófagos, vírus da hepatite A, adenovírus humano e rotavírus^{18,19 ,20}. Como definido pelo fabricante, a resina de troca de ânion utilizada neste trabalho é uma resina de troca aniônica de base forte poliestireno macroreticular em que amina quaternária funcionalizados grupos mediato atração e captura de anions em um líquido médio²¹ . Consequentemente, a resina de troca de ânion é esperada para capturar o vírus com cargas de superfície net-negativo, incluindo muitos vírus entéricos, vírus da gripe e outros vírus relevantes para a saúde pública e animal.

O protocolo atual envolve a adição de resina de troca de ânion de um impactor líquido. Neste sistema, a resina serve como uma etapa de concentração secundária para partículas virais capturado no líquido impactor. Ácidos nucleicos pode então ser eluídos diretamente em pequenos volumes, fornecendo uma amostra concentrada para análises moleculares. Assim, a principal vantagem deste método é a melhoria na sensibilidade de detecção viral, principalmente através da redução no volume de amostra. Além disso, devido a inerente específico captura de vírus com carga negativa, o método é provável aplicável para a deteção de um grande número de vírus de interesse. Aqui, o método é demonstrado por estirpes vacinais de tipo A e o vírus da influenza tipo B e o coliphage FRNA MS2 (MS2). Estes vírus são detectados posteriormente utilizando ensaios de qRT-PCR padrão como descrito anteriormente,²². O usuário de ponto de extremidade não deve esperar encontrar dificuldades em realizar esse método, porque as modificações aos atualmente existentes equipamentos não constituem grandes perturbações ao fluxo convencional de análise e amostragem de bioaerosol.

1. instalação da câmara Bioaerosol (ver Figura 2)

1. Pré-carrega os líquido impingers com 20 mL de 0,01 M tamponado fosfato salina, pH 7,5 (PBS).
   1. Adicionar 0,5 g de resina de troca de ânion e suspender dentro da PBS de dentre os impingers líquidos, com outro líquido impactor servindo como um controle.
2. Impingers líquidos de posição em paralelo no interior da câmara de bioaerosol usando braçadeira carrinhos com entradas de aerossol, enfrentando o nebulizador.
   Nota: Consulte a Figura 2 para obter detalhes adicionais.
3. Colocalizar um monitor de leitura direta aerossol perto os líquido impingers para medir a concentração em massa (mg/m³) do bioaerosol.
4. Colocalizar instrumentação adicional de leitura direta (ar interior qualidade monitor e térmica anemômetro) perto os líquido impingers para monitorar variáveis ambientais, como temperatura, umidade relativa e vento velocidade, dentro da câmara de bioaerosol.
5. Execute ventiladores axiais nos cantos da câmara bioaerosol para facilitar a mistura de aerossol.
   Nota: Ventiladores axiais correr a uma velocidade fixa e não são ajustáveis.

2. modelo Bioaerosolization experimentos (ver Figura 3)

1. Execute a série, 10 vezes diluições de MS2 bacteriófago e gripe vacina para concentrações desejadas em tampão fosfato salino (PBS).
   Nota: Para demonstrar o método aqui, 10^3.5 FFU/mL dos tipo A e B da gripe vacina contra estirpes de vírus e 10⁵ PFU/mL do bacteriófago MS2 são utilizados. Para determinar a concentração para os inóculos, bacteriófagos são propagados em Escherichia coli HS (pFamp) R e enumerados como descrito anteriormente,²⁰. A vacina comercial contém quantidades conhecidas de quatro estirpes de vírus vivo atenuado gripe, dois tipo um vírus de gripe e dois vírus de gripe tipo B, expressos em unidades de foco fluorescente ou FFU.
2. Preparar inóculos com o vaso de vidro de um nebulizador de jato 6 colisão criando suspensões das concentrações desejadas de partículas virais em 100 mL de PBS e instalar dentro da câmara de bioaerosol personalizado.
3. Inicie a instrumentação para medir as variáveis dentro da câmara de bioaerosol, tais como temperatura, umidade relativa %, concentração de dióxido de carbono e a velocidade (gerada usando um ventilador axial) do vento. Utilize um monitor de aerossol de leitura direta para controlar a concentração mássica dentro da câmara de bioaerosol e estabelecer coerência dentro e entre os ensaios.
4. Veda-se a câmara de bioaerosol e expurgo por 10 min com ar filtrado HEPA.
5. Fornecer ar filtrado, seco para o nebulizador operando em 6,9 kPa.
6. Gere uma concentração alvo de Bioaerossóis viral (através de nebulizador) em cada câmara de bioaerosol experimental. Para esta demonstração, Bioaerossóis com uma concentração de 5 mg/m³ são gerados.
7. Quando a concentração em massa do alvo do aerossol é atingida, interromper a nebulização.
8. Opere uma bomba de amostragem de ar para cada líquido impactor que foi calibrado para uma vazão de 12,5 L/min. conduta calibração usando um padrão de fluxo primário antes e após cada evento de amostragem para assegurar a consistência no volume de amostragem. Diluição de abastecimento usando uma linha de filtro HEPA localizada perto do nebulizador de ar e manter a pressão constante na câmara.
9. Ativamente da amostra da atmosfera da câmara bioaerosol por um período de 40 min para atingir um volume de amostragem de 500 L por exemplo.
   Nota: Amostragem por 40 min em 12,5 L/min com duas bombas em paralelo permite a amostragem de 1.000 L do bioaerosol. Assim, após a conclusão do experimento, espera-se que a maioria do ar presente na câmara de bioaerosol foi amostrada e liberada no ambiente através de um sistema de filtro HEPA. Isto é evidenciado pela diminuição na concentração de partículas. Pós-experimento, as superfícies são descontaminadas com 10% de etanol água sanitária e 70% do agregado familiar. Indicadores são usados nesta demonstração; no entanto, se conhecido os organismos patogénicos são usados neste sistema, medidas de biossegurança adicionais podem ser implementadas conforme necessário.

3. ácido nucleico extração e deteção de qRT-PCR

1. Isole os ácidos nucleicos diretamente a partir de resina de troca de ânion e, para efeitos comparativos, a partir do líquido usado dentro os líquido impingers. Neste exemplo, um procedimento de isolamento de RNA é descrito, mas um protocolo semelhante poderia ser usado para vírus de DNA.
   1. Isolamento de ácidos nucleicos de resina de troca o ânion.
      1. Transferi todos do ânion troca resina contendo líquido do impactor líquido para um tubo cônico estéril 50 mL.
      2. Permitir que a resina resolver e lentamente decantar a amostra do líquido de resina de troca o ânion. Use uma ponta de pipeta de 1 mL para remover todo o líquido restante a partir da resina de troca de ânion.
      3. De um kit de isolamento de RNA viral, adicionar 560 µ l de tampão de Lise viral contendo RNA do portador diretamente para a resina de troca de ânion e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente com a mistura de periódicos.
      4. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, transferir o viral lisado (o viral do lysis) para um estéril 1,5 mL cónico tubo e proceder com RNA kit de isolamento usando um isolamento de RNA viral (ver Tabela de materiais) em conformidade com as instruções do fabricante, exceto Esse RNA é eluída em um volume total de 60 µ l de tampão de eluição.
   2. Isolamento de ácidos nucleicos de impingers líquidos.
      1. Pipetar 140 µ l da amostra do líquido em um tubo cônico estéril 1,5 mL e realizar o isolamento do RNA usando o kit de isolamento de RNA viral em conformidade com as instruções do fabricante, com excepção de eluição do RNA em um volume total de 60 µ l de tampão de eluição.
         Nota: µ l 140 é o volume da amostra máxima que pode ser processado com o específico viral RNA isolamento kit empregado aqui em uma única etapa preparação.
2. Execute qRT-PCR para a detecção de MS2 e da influenza A e B vírus como descrito anteriormente,^23,24. Nesta demonstração, 5 µ l de ácido nucleico eluídos são utilizados para qRT-PCR.

A Figura 1 demonstra o princípio por trás de captura com base em carga de vírus de Bioaerossóis através da inclusão de resina em impingers líquido-baseado. A Figura 2 mostra a configuração da câmara bioaerosol custom-built. A Figura 3 descreve as etapas envolvidas na criação da experiência de clorofórmio e medidas para garantir o controle de qualidade. A Figura 4 mostra as curvas de amplificação para detecção de qRT-PCR de vírus de carga negativa, capturado de Bioaerossóis. A tabela 1 mostra os primers e sondas utilizadas para qRT-PCR para os vírus de exemplo utilizado neste estudo.

Usando MS2 e gripe vírus contidos em vacina contra a gripe como modelos na câmara bioaerosol personalizado, os líquido impingers modificado com resina de troca de ânion permitida para aproximadamente 3 x 9 melhoria x na detecção viral, dependendo a específica vírus, em comparação com testes diretos de choque líquido²². Conforme mostrado nas curvas de amplificação representativa qRT-PCR (Figura 4), deteção do tipo que um vírus de gripe poderiam ser alcançado até 3.26 ciclos mais cedo quando a resina de troca de ânion foi usada em comparação com testes direto do líquido do choque. Considerando que, em um qRT-PCR que é 100% eficiente, um ganho de um Ct corresponde a um aumento de 2 vezes na concentração de destino, essa diferença é equivalente a uma melhoria de 9,58 x da deteção.

Figura 1: choque do líquido acoplado com resina de troca de ânion. Cada um dos dispositivos de amostragem de bioaerosol modificada incorpora uma resina de troca de ânion em seu design. Cada grânulo de resina é uma esfera de 0,5 a 1,0 mm, com uma superfície porosa, uma característica que aumenta a superfície de troca de ânion. Grupos funcionais de amônio quaternário permitam a captura de íons em meio líquido, mediando a captura de vírus com cargas de superfície net-negativo, incluindo MS2 coliphages e gripe vírus, que são utilizados no presente protocolo como organismos modelo (uma cauda bacteriófago é desenhado aqui como um exemplo de vírus capturados). Isolamento de ácidos nucleicos, em seguida, é executado directamente a partir da resina (usando kits comercialmente disponíveis), com a amostra adequada para estratégias de deteção mais moleculares (qRT-PCR empregado aqui). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: câmara de bioaerosol Custom esquemática. R: 6-jato nebulizador fornecido com ar filtrado e seco a uma pressão de gera de 6,9 kPa; B: ventiladores axiais para facilitar a mistura uniforme bioaaerosol; C: monitor de aerossol para identificar as concentrações de bioaerosol relativo; D: líquido impinger com resina; E: impactor líquido sem resina; F: termal anemômetro para medir a velocidade do vento; G: monitor de qualidade ar para medir outras variáveis ambientais, incluindo temperatura, dióxido de carbono e percentual de umidade relativa; H: bombas de amostragem ativo calibradas para 12,5 L/min; I: acionamento selado portas de luva para equipamento de amostragem de posicionamento dentro da câmara de bioaerosol; J janela de observação de. Esta figura foi reutilizada de trabalhos anteriores com permissão da editora²². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: fluxo de trabalho do experimento bioaerosolization. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: resina de troca de ânion melhora a detecção de qRT-PCR com base de vírus de carga negativa no Bioaerossóis. Neste exemplo, tipo os vírus da gripe em uma concentração de inóculo de 10^3.5 FFU/mL foram aerosolized dentro da câmara de bioaerosol personalizado até a concentração em massa de bioaerosol chegou a 5 mg/m³. Líquido impingers com e sem resina empenharam-se, simultaneamente, para cada amostra (500 L) do bioaerosol. RNA viral foi obtido a partir da resina de troca de ânion ou o líquido do impactor e analisado por qRT-PCR. O experimento foi repetido em triplicado. Ácidos nucleicos obtidos de amostras de resina foram detectados em um Ct médio de 26.76, Considerando que amostras líquidas impactor foram detectadas em um Ct médio de 30.02 (ΔCt de 3,26). Esta diferença no Ct é equivalente a uma melhoria de 9,58 x na deteção usando a resina de troca de ânion. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Primers e sondas utilizadas neste estudo. Todos os primers e sondas foram de Friedman et al . 2011²³ e domingos & Selvarangan 2010²⁴.

Este protocolo descreve um método para a captura de viral sensível de Bioaerossóis usando impingers líquidos modificados. O método é otimizado para detecção e quantificação da carga viral em Bioaerossóis. A modificação específica demonstrada aqui envolve a adição de resina de troca de ânion ao líquido contido em um impinger líquido comum. Este método foi desenvolvido por sua simplicidade no processamento da amostra a jusante, Considerando que outras técnicas de processamento de amostra como centrifugação, filtração e métodos baseados em precipitação não oferecer tal vantagem. Extração de ácidos nucleicos é executada diretamente a partir da resina, eliminando a necessidade de alto volume elutions e várias etapas de preparação de amostra, em última análise, contribuindo para a sensibilidade de detecção melhorada do método através de redução na amostra eficaz volume. Além disso, tem sido demonstrado que imobilização de partículas virais em terra firme superfícies podem contribuir para a estabilidade aumentada do ácido nucleico viral ou retenção de infectividade viral^17,25. Imobilização mais pode contribuir para captura de maior eficiência, reduzindo as perdas devido a reaerosolization¹⁶. O método pode ser facilmente acoplado a jusante análises moleculares (qRT-PCR demonstrado aqui). A resina de troca de ânion pode ser extraídas por meio de campo e enviada para um laboratório de referência para a análise, enquanto o equipamento de amostragem de ar pode permanecer dedicado ao monitoramento na área de amostragem. Como o princípio por trás do procedimento envolve a captura de específico de vírus carregando uma carga de superfície de rede-negativo, o método deverá ser favorável para a detecção de vários vírus patogénicos de importância para a saúde humana e medicina veterinária. Como comentado por Michen e Graule²⁶, um grande número de vírus importantes para a saúde pública e animal têm net-negativo cargas superficiais, com poucas exceções conhecidas, tais como certas cepas de rotavírus e polioviruses.

Este protocolo não avalia diretamente o efeito das condições ambientais sobre a sensibilidade da deteção; no entanto, quando a amostragem do ar é realizada em configurações do campo, é concebível que variáveis como temperatura e umidade relativa podem afetar a eficiência de coleta em vários tipos de amostradores de ar¹². Assim, as condições dentro da câmara de bioaerosol podem ser modificadas para atender esses parâmetros ambientais, conforme necessário. O método de resina de troca de ânion tem se mostrado eficaz concentrar vários vírus de amostras de água com uma ampla gama de propriedades físico-químicas, indicando que a interferência de partículas em suspensão, bactérias e outros ambientais contaminantes é esperado para ser mínimo¹⁸. Além disso, buffers de coleção podem exigir otimização para vírus específicos, como em alguns casos tem sido demonstrado que otimizando o buffer de coleção podem levar a retenção melhorada de estabilidade viral²⁷. A principal desvantagem do método apresentado é o fato de que ele não pode determinar a infectividade viral. Outra desvantagem deste protocolo é a incapacidade de avaliar os efeitos potencialmente negativos da nebulização e na estabilidade viral, incluindo a dessecação, cisalhamento e adsorção não específica de bioaerosol câmara superfícies²²de amostragem de ar.

Os dispositivos de amostragem de bioaerosol modificada podem ser passíveis de amostragem de campo baseada em várias configurações, incluindo hospitais, escolas, operações agrícolas e outros locais. Porque as modificações são feitas para equipamentos de amostragem de ar existentes, espera-se que os dispositivos modificados seria facilmente adoptáveis por operadores atualmente amostragem Bioaerossóis por vírus. O protocolo é demonstrado aqui em uma câmara de bioaerosol Custom-Built usando vírus MS2 e gripe, que são alvos úteis para desenvolvimento do método devido ao fato de que eles representam exemplos de vírus não-envelopado e envelopadas, MS2 é reconhecido como um substituto de vírus entéricos e são comumente empregado na avaliação de impingers^22,26,,^27,28,29.

Trabalho futuro envolverá a otimização das condições de amostragem (ou seja, velocidade de amostragem de ar, buffers de coleção) e inclusão de vírus relevantes adicionais em protocolos de teste.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do CDC/NIOSH altas planícies Intermountain centro agrícola de saúde e segurança (5U54OH008085) e o programa de concessão de avaliação do Colorado Bioscience descoberta (14BGF-16).