Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.

A técnica de indução de escarro e processamento é um método não-invasivo reconhecido, permitindo a coleta e a análise das células das vias aéreas, o que é interessante em várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou fibrose pulmonar idiopática. Esta técnica é bem tolerado, seguro e não invasivo, mas está atualmente limitada a serviços de pesquisa e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado. A taxa de sucesso de indução de escarro e análise é cerca de 80%.

Aqui, descrevemos a indução e laboratório de processamento de amostras de escarro. Expectoração é induzida por inalação de solução salina hipertônica ou isotônica com salbutamol. Para o processamento, nós usamos a técnica de escarro de todo. Ditiotreitol (DTT) é usado para permitir que o mucolysis de amostras de escarro. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar os tipos de células presentes no lúmen das vias aéreas. Análises adicionais podem ser efectuadas na expectoração sobrenadante e as células do escarro, que podem permitir a investigação sobre processos inflamatórios e mecanismos imunes. Exemplos incluem estudando mediadores na expectoração sobrenadante e realizando um amplo espectro de análise em células de escarro como citometria de fluxo, genômica ou proteômica.

Finalmente, apresentam-se resultados representativos de análise do escarro em doentes com DPOC, asmáticos e controles saudáveis.

Vários métodos são usados para investigar a inflamação das vias aéreas: direto de medições (como biópsias brônquicas ou lavado broncoalveolar lavages) e métodos indirectos (como sintoma, avaliação, testes de função de análise e pulmão de amostra de sangue)¹. As técnicas diretas têm a vantagem de avaliar confiantemente a inflamação das vias aéreas, mas são invasiva e não viável em grande escala por causa do desconforto do paciente e o risco incorrido¹. Quanto os métodos indirectos, eles mal se correlacionar com a avaliação direta da inflamação de vias aéreas¹.

Coleta de escarro é outra maneira de amostras de células das vias aéreas e permite a avaliação direta da inflamação das vias aéreas. No entanto, produzir expectoração espontânea pode levar a amostras de má qualidade e não é possível para todos os pacientes². Esta questão foi superada com o uso de nebulização ultra-sônica solução salina hipertônica para induzir a produção de expectoração². Esse método foi inicialmente usado em pacientes infectados com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) para o diagnóstico de pneumonia por Pneumocystis carinii pneumonia³ e foi adaptado para indivíduos saudáveis e asmáticos em 1992⁴. Indução de escarro também é viável em pacientes mais graves com o uso de solução salina isotônica⁵. Embora geralmente bem tolerado, a inalação de solução salina pode causar broncoespasmo em pacientes com hyperresponsive vias aéreas⁵. Portanto, é aconselhável administrar um agonista beta de ação curta antes do procedimento¹. Além disso, mostramos anteriormente que adicionar salbutamol para a solução salina no nebulizador ultra-sônico diminuiu ainda mais este risco⁶. As vantagens da indução de escarro é que é não-invasivo² e seguro quando apropriado precauções⁵.

Para o processamento de amostras de escarro, dois métodos são atualmente usados na literatura: a técnica de escarro toda e a ficha de seleção⁷. Em nosso laboratório, é realizada a técnica de escarro de todo. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar o tipo de inflamação presente no lúmen das vias aéreas. No entanto, muitas análises adicionais também são possíveis investigar processos inflamatórios e mecanismos imunes, estudando mediadores no escarro sobrenadante⁸ ou por meio de investigação detalhada em células de escarro (por exemplo, , fluxo cytometry⁹, culturas de células¹⁰, genómica¹⁰, proteomics¹⁰, imunocitoquímica⁷, in situ da hibridação⁷, etc)

A técnica de indução de escarro e análise está atualmente limitada a Pesquisar serviços e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado¹. Inflamação das vias respiratórias pode ser investigada com este método para várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou de fibrose pulmonar idiopática¹¹.

Todos os métodos descritos nesta seção foram aprovados pelo Comitê de ética do Hospital da Universidade de Liège, e todos os indivíduos saudáveis deram consentimento escrito de participação.

1. indução de escarro

1. Pré e pós-broncodilatador espirometria
   1. Executar uma espirometria (volume expiratório forçado em 1 segundo [VEF₁] e manobra de capacidade vital forçada [VT]) de acordo com a American Thoracic Society (ATS) / sociedade respiratória Europeia (ERS) critérios padrão¹².
   2. Administre 400 µ g de salbutamol inalado em um inalador de dose calibrada (MDI) através de um dispositivo de espaçador.
      Nota: Em adultos, os efeitos adversos do salbutamol inalado incluem tremor e taquicardia¹³.
   3. Repita a espirometria (VEF₁ e manobra de CVF) 15 min mais tarde, de acordo com os critérios ATS/ERS¹².
2. Preparação do nebulizador ultra sonico
   Nota: O nebulizador deve ser cuidadosamente limpos e desinfectado antes de cada utilização, em conformidade com as instruções do fabricante.
   1. Encha a câmara de nebulização com água destilada até o nível recomendado.
   2. Coloca uma xícara limpa na câmara de nebulização.
   3. Cubra a taça com a tampa adequada.
   4. Encha o copo com qualquer 50 mL de solução salina hipertônica (5%) para um paciente com pós-broncodilatador VEF₁ > 65% previsto ou 50 mL de solução salina isotônica (0,9%) para um paciente com pós-broncodilatador VEF₁≤65% previsto.
   5. Adicione 1,75 mL da solução de sulfato de salbutamol (5 mg/mL) para a Copa.
   6. Conecte os tubos e válvulas de acordo com as instruções do fabricante.
3. Coleção de nebulização e escarro
   Nota: Execute a técnica sob supervisão médica.
   1. Explica o procedimento ao paciente.
   2. Pedir ao paciente para usar um grampo do nariz.
   3. Ligue o nebulizador e selecionar o nível mais baixo das configurações de aerossol e ventilador.
   4. Pedir ao paciente para inalar o aerossol através da peça de boca com a respiração das marés por 5 min.
      Nota: Aerosol e fã de configurações podem ser aumentadas dependendo da tolerância do paciente.
      1. Em caso de tosse insuportável ou náuseas, interrompa o procedimento e vá para a etapa 1.3.5.
      2. Em caso de aperto no peito ou desconforto respiratório, vá para a etapa 1.3.8.
   5. Desligue o nebulizador.
   6. Pedir ao paciente para remover o grampo do nariz, enxágue a boca com água e bochechar duas vezes antes de descartá-lo na pia.
      Nota: Células de Saliva podem contaminar a amostra de escarro e levar a uma amostra inutilizável.
   7. Pedir ao paciente para tossir escarro em um recipiente plástico.
   8. Execute uma espirometria (manobra expiratória forçada) para medir VEF₁.
   9. Avaliar a queda de₁ FEV como segue: (VEF₁ medido na etapa 3.8 [mL]) - (pós-broncodilatador VEF₁ medido na etapa 1.3 [mL]) / (pós-broncodilatador VEF₁ medido na etapa 1.3 [mL]) * 100.
      1. Se o VEF₁ cai em 20% ou mais do valor pós-broncodilatador, interrompa o procedimento. Medida VEF₁ novamente 10 min mais tarde. Se o VEF₁ cai 20% ou mais, pergunte o médico administrar o brometo de ipratrópio nebulização (0,25 mg/2 mL) e manter o paciente sob observação médica. Vá para a etapa 1.3.10.
      2. Se o VEF₁ não cai em 20% ou mais do valor pós-broncodilatador, repita as etapas de 3,2 a 3,9 uma a três vezes para alcançar um tempo de nebulização total de 10 a 20 min.
         Nota: O tempo de nebulização total dependerá (presença de fichas ou peças viscosas) de qualidade e quantidade da amostra do escarro. Se a qualidade da amostra e/ou quantidade é pobre após 10min de nebulização, o procedimento deve ser ampliado para alcançar um tempo de nebulização total de 15 a 20 min.
   10. Manter a amostra de escarro refrigerada até o processamento.

2. escarro processamento

Nota: Processe o escarro dentro de 3 horas de amostragem para viabilidade celular ideal.

Atenção: Use um jaleco, luvas e óculos de proteção.

1. Preparativos preliminares
   1. Fazer uma diluição de 10 vezes da solução concentrada de ditiotreitol (agente mucolítico) com água destilada estéril para obter 10 mL de uma solução de 6,5 mM, em conformidade com as instruções do fabricante.
      Nota: Para evitar a solução concentrada ditiotreitol, mistura com o ar ambiente, retire a solução do frasco com agulha e seringa estéril. Uma vez aberto, o frasco de solução concentrada deve ser mantido em temperatura e usado dentro de 5 dias. A solução diluída é preparada diariamente.
      Atenção: Por causa do perigo de irritação de olho e pele, utilize equipamento de protecção (vestuário, luvas e óculos de proteção).
   2. Fazer uma 5-fold diluição da solução de azul de trypan (0,4%) com de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) para obter uma solução de 0,08%. Manter esta solução diluída à temperatura ambiente e usar dentro de 2 semanas.
      Atenção: Por causa de riscos cancerígenos, utilize equipamento de protecção (vestuário, luvas e óculos de proteção).
2. Coleta de escarro sobrenadante
   1. Transferir o escarro todo em um tubo de plástico de fundo cónico de 50 mL e pesar a amostra.
   2. Adicione um peso 3 vezes da solução DPBS.
   3. Lentamente o vórtice a amostra por 30 s.
   4. Centrifugue a 800 x g e 4 ° C por 10 min.
   5. Filtrar a amostra através de 2 simples camadas de gaze estéril e recolher o sobrenadante em um tubo de plástico de fundo cónico de 50 mL.
   6. Alíquota do sobrenadante em plástico 2 mL tubos e armazená-los a-80 ° C.
      Nota: Amostras de sobrenadante são úteis para ensaiar componentes de fase fluida do escarro.
3. Mucolysis expectoração
   1. Se necessário, adicione DPBS para o centrifugado para alcançar um volume total de suspensão de células de 5 mL.
   2. Dilua a suspensão de células com 1 volume de ditiotreitol 6,5 mM. Use um balancim de banco para agitar a suspensão de eritrócitos por 20 min em temperatura ambiente.
      1. Repita pelo menos 3 vezes com DPBS.
   3. Centrifugar a suspensão de células diluído em 550 x g e 4 ° C por 10 min.

Hemocytometer
Uma imagem típica é mostrada na Figura 1 que é visualizado com o microscópio usando o hemocytometer. Células escamosas são facilmente identificadas, como eles são muito maiores do que as células não-escamosas. Estas células escamosas são células epiteliais, vindo da boca. Os dois tipos de células estão manchados pelo azul Trypan quando morto. Cuidado deve ser tomado para evitar a contagem de leveduras, bactérias e sucata.

Figura 1 : Hemocytometer imagens mostrando (A) a vida não-escamosas, (B) um morto não-escamosas e (C) um carcinoma de células células. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cytospin slide: a Figura 2 mostra uma imagem representativa de um slide cytospin obtido após o processamento do escarro. Os diferentes tipos de células (neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais) podem ser diferenciados por meio de sua morfologia e coloração. Em alguns casos, a contaminação por células escamosas pode ser importante e, se a percentagem de células escamosas é superior a 80%, a amostra é considerada mal sucedida (Figura 3).

Figura 2 : Imagens de slide Cytospin mostrando (A) um neutrófilo, (B) um macrófago, (C) um eosinófilo, (D) um linfócito e (E) uma célula epitelial. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Exemplo de um slide de cytospin de má qualidade com > 80% de células escamosas. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Taxa de sucesso
No nosso departamento, a taxa de sucesso do procedimento (combinando uma indução bem sucedida e um cytospin legível), com base em uma amostra de 1.129 pacientes (indivíduos saudáveis, asmáticos ou pacientes DPOC), é de 82% (924/1.129). Em uma análise de sub de acordo com o tipo de pacientes, a taxa de sucesso é de 75% (57/76) em indivíduos saudáveis, 82% (827/1.004) em asmáticos e 82% (40/49) em doentes com DPOC.

Resultados em indivíduos saudáveis
Em uma análise retrospectiva de uma série de 289 indivíduos saudáveis do nosso departamento, a mediana (intervalo interquartil) peso de escarro foi 3,72 g (intervalo interquartil de 2,46 g - 5,54 g) e a mediana total não-escamosas contagem/g de escarro foi 0,59 x 10⁶ ( intervalo interquartil de 0,37 x 10⁶ - 1,29 x 10⁶).

Os indivíduos saudáveis, a proporção de células escamosas é baixa em 19% (10% - 34%) e a viabilidade é alta em 66% (54-78%). Sobre o percentual dos diferentes tipos de células, os resultados estão resumidos na Figura 4A. Podemos observar que a porcentagem de macrófagos (49% [31-68%]) é maior do que a porcentagem de neutrófilos (34% [14% - 60%]), enquanto as percentagens de linfócitos (2% [1-3%]), eosinófilos (0% [0-0%]) e células epiteliais (4% [2-11%]) são baixas. Estes resultados são semelhantes quando os dados são expressos em valores absolutos (Figura 4B).

Figura 4 : Resultados representativos da contagem diferencial de células observadas em indivíduos saudáveis expressaram em percentagens (A) ou (B) valores absolutos. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Também é importante ter em conta a idade dos pacientes. Na verdade, uma forte correlação está presente entre a idade do paciente e a proporção de neutrófilos em amostras de escarro (Figura 5). Da mesma forma, quando a classificação dos pacientes segundo grupos de idade de 10 anos (Figura 6), observamos um aumento significativo da percentagem de neutrófilos, com o aumento da faixa etária. Portanto, essa variável deve ser considerada ao comparar resultados de diferentes coortes, e cuidado deve ser tomado na correspondência de assuntos.

Figura 5: Correlação entre idade e escarro porcentagem de neutrófilos. Calculou-se a correlação com o teste de Spearman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Evolução da percentagem dos neutrófilos de acordo com a categoria de idade. O p-valor de ANOVA foi < 0,0001 para a comparação da porcentagem de neutrófilos entre classes de idade. Várias comparações foram feitas com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Os p-valores são representados como segue: * p < 0.05, * * p < 0,01, e * * * p < 0.001. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados em pacientes que sofrem de doenças respiratórias
A técnica de escarro induzido é comumente usada para avaliar o perfil de células inflamatórias em pacientes asmáticos.Esta técnica também pode ser aplicada para pacientes que sofrem de DPOC, outra doença respiratória inflamatória. Ao comparar indivíduos saudáveis, asmáticos e DPOC (os 3 grupos sendo pareados por idade, sexo e hábitos de tabaco), observamos que o perfil de células inflamatórias é bem diferente entre estas coortes (Figura 7). De fato, pacientes asmáticos são geralmente caracterizados por eosinófilos escarro levantadas, enquanto a proporção de neutrófilos de escarro é geralmente superior em doentes com DPOC em comparação com controles saudáveis, que está relacionada com a severidade da doença.

Figura 7 : Perfil de células inflamatórias escarro de indivíduos saudáveis (n = 45), os pacientes asmáticos (n = 108) e doentes com DPOC (n = 54). Os três grupos foram pareados por sexo, idade e hábitos de tabaco. Os p-valores da ANOVA foram < 0,05, < 0,0001, e < 0,0001 para a comparação de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos entre grupos, respectivamente. Várias comparações foram feitas com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Os p-valores são representados como segue: * p < 0,05 e * * * p < 0.001. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método de escarro induzido é uma ferramenta útil para estudar o compartimento das vias respiratórias. Há várias possíveis aplicações desta técnica. Primeiro, pode melhorar o conhecimento sobre as células imunes e mecanismos envolvidos em diversas doenças respiratórias. Por exemplo, essa técnica tem permitido a investigação da inflamação das vias respiratórias em grandes coortes de pacientes, e tem sido demonstrado que cerca de metade dos pacientes asmáticos são caracterizados por um anormal das vias de inflamação eosinofílica^{15, 16 , 17}, enquanto doentes com DPOC geralmente exibem um neutrófilo escarro levantadas contar¹⁸. Esta técnica também tem contribuído para melhor caracterização da inflamação das vias aéreas em pacientes com fibrose pulmonar idiopática e mediadores de evidências que podem contribuir para esta doença¹⁹. Em segundo lugar, a técnica de escarro induzido pode ser útil para predizer a resposta ao tratamento. Por exemplo, a presença de uma porcentagem anormal de eosinófilos escarro tem demonstrada ser um marcador preditivo de corticosteroide responsividade^11,18. Em asma e DPOC, adequar a dose de corticosteroides para normalizar a percentagem de eosinófilos do escarro foi mostrado para ser mais eficaz na diminuição do número de exacerbações que o ajuste do tratamento de acordo com as actuais directrizes clínicas^{11 ,20,21}. Em terceiro lugar, a análise do escarro pode ajudar a desenvolver terapias alvo. Por exemplo, a presença de um número anormal de neutrófilos de escarro na DPOC e alguns pacientes asmáticos tem levado ao desenvolvimento de tratamentos antineutrophilic¹¹. Em quarto lugar, a técnica pode desempenhar um papel no diagnóstico. Por exemplo, a presença de eosinofilia de escarro é necessária fazer um diagnóstico de bronquite eosinofílica não asmática¹¹.

Além de obter uma contagem diferencial de células, a técnica de indução de escarro também permite que o desempenho de muitas análises adicionais, ao estudar células de expectoração ou escarro sobrenadante. A análise dos mediadores^8,19,22 e a avaliação da atividade quimiotáctica da amostra para eosinófilos²²são exemplos com expectoração sobrenadante. De células do escarro, RNA pode ser extraído e usado para microRNA ou expressão gênica analisa^19,23 . As células do escarro também podem ser analisadas pelo fluxo cytometry^9,23 , que permite, entre outros, immunophenotyping e classificação de células. Além disso, escarro células podem ser cultivadas¹⁰, e sua produção do mediador pode ser medida na vitro²⁴. É interessante notar que, neste caso, o conteúdo do mediador é diferente do que pode ser encontrado na expectoração sobrenadante. Com efeito, mediadores na expectoração sobrenadante podem ser influenciados por secreções de células residentes das vias aéreas e por exsudação de plasma, contrariando o escarro cultura celular modelo²⁴. Finalmente, imunocitoquímica e em situ hibridação também pode ser executada usando o escarro células⁷.

A escarro induzido a técnica tem algumas limitações. A indução deve ser realizada sob supervisão médica. Também é essencial para o operador dar instruções completa aos pacientes. Outras limitações incluem a cooperação e a condição médica dos pacientes, que são necessários esforços respiratórios. Sobre a viabilidade desta técnica em crianças, vários estudos têm relatado que foi bem sucedida e segura em crianças com mais de 6 anos de idade²⁵. Dados sobre crianças de < 6 anos de idade estão faltando²⁵, mas é provável que a indução de escarro é difícil de executar essas crianças¹⁴. A técnica é atualmente restrita aos serviços e centros especializados de investigação porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado¹. Outra limitação é que a técnica de indução de escarro e análise não é sempre bem sucedida, significando que um cytospin legível não é sempre obtido²⁶. No entanto, a taxa de sucesso é geralmente cerca de 80% em diferentes coortes de pacientes^4,26,,^27,28,29. Finalmente, o cuidado deve ser tomado quando comparando diferentes coortes de pacientes em relação a correspondência da idade, como foi mostrado para o impacto do escarro célula contagem^30,31. Da mesma forma, outros parâmetros como sexo e tabaco hábitos tem que ser correspondido como eles também podem interferir com o escarro célula contagem^29,32. Quando o paciente correspondência não é possível, outra maneira de considerar idade, sexo ou status de fumar é para ajustar a análise estatística para estas características.

Em comparação com outras técnicas que permitem a coleta de células de vias aéreas, como biópsias e lavado broncoalveolar lavages, o método de escarro induzido tem as vantagens de ser simples, bem tolerado, seguro, reprodutível, cost-effective e não-invasiva. Estas vantagens permitem que a técnica de escarro induzido a ser executada em grande escala e repetidamente ao longo do tempo e torná-lo uma alternativa de escolha para a amostragem das vias respiratórias. Bronchosorption é outra técnica que permite a coleta do fluido mucosa para avaliar as vias aéreas mediadores³³. Enquanto esta técnica (exigindo broncoscopia) é mais invasiva do que o escarro induzido, tem as vantagens de evitar qualquer contaminação com saliva e obtenção de altas concentrações de mediadores do que na de lavagem broncoalveolar³³.

Passos críticos precisam de atenção no protocolo. Primeiro, cuidado deve ser tomado sobre a concentração salina e o tempo de indução, porque esses dois parâmetros podem influenciar os resultados e, portanto, precisa ser padronizada^34,35. Em segundo lugar, o mucolysis com TDT é uma etapa importante do tratamento. Em comparação com PBS, TDT foi mostrado para melhor dispersar escarro células⁷, que melhora a qualidade de slide cytopsin e é essencial ter uma célula pode ser reproduzido de contagem². No entanto, o agente mucolítico pode interferir com a medição dos componentes bioquímicos.Cravação de experiências então deve ser realizado quando um novo composto bioquímico³⁶de medição. Finalmente, uma outra etapa crítica do processo é a célula contando passo, que deve ser realizado por um técnico treinado para garantir resultados confiáveis e interpretáveis.

Um método alternativo usando fichas de escarro (peças de lêmures ou mais densas), em vez de escarro todo, também é descrito na literatura⁷. Ambas as técnicas têm vantagens e desvantagens. A escarro toda técnica permite mais rápido processamento⁷, mas é frequentemente contaminada com saliva, o que dilui a amostra e pode reduzir a qualidade do cytospins^2,7. Com a técnica de seleção de plug, a contaminação da saliva é reduzida, o que significa que as amostras são muitas vezes de melhor qualidade para a dosagem dos mediadores da fase fluida e cytospin slides⁷. O processamento é no entanto mais⁷ e plugues selecionadas podem não ser representativa da amostra inteira³⁷. É também interessante notar que nem todas as amostras contêm plugues, que podem ser um fator limitante. Ambos os métodos são validados e podem ser reproduzidos, e atualmente não há nenhuma evidência de que a contagem de células diferenciais obtidas de ambos esses métodos é diferentes de^14,38.

No futuro, escarro induzido pode ser usado como uma ferramenta clínica para fornecer biomarcadores para a investigação, diagnóstico e gerenciamento de todos os tipos de doenças respiratórias inflamatórias.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo Hospital da Universidade de Liège (Liège CHU). Reconhecemos "Produções de instantes" para a produção de vídeo. Também reconhecemos o Cedric François, o paciente que apareceu no filme.