Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Durante anos, distinções entre os tipos de fibra de músculo esquelético foram melhor visualizadas pela coloração de miosina-ATPase. Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino do tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, IIX e tipo IIB fibras agora podem ser identificadas com precisão, com base no seu perfil de MyHC; no entanto, a análise manual desses dados pode ser lento e baixo-direita tedioso. A este respeito, avaliação rápida, exata da composição da fibra-tipo e morfologia é uma ferramenta muito desejável. Aqui, apresentamos um protocolo para coloração imuno-histoquímica estado-da-arte da MyHCs nas seções congeladas obtidas de músculo do membro posterior do mouse em conjunto com um algoritmo semi-automático de romance que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra. Como esperado, o músculo sóleo exibido mancha para tipo I e fibras IIA, mas não para as fibras tipo IIX ou tipo IIB. Por outro lado, o músculo tibial anterior era composto predominantemente de tipo IIX e tipo IIB fibras, uma pequena fração de fibras de tipo IIA e pouco ou nenhum tipo I fibras. Várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade, com a finalidade de medir os diferentes aspectos da morfologia das fibras (ou seja, área da seção transversal (CSA), diâmetro de Feret máxima e mínima). Os valores obtidos para estes parâmetros foram então comparados com os valores obtidos manualmente. Não há diferenças significativas foram observadas entre o modo de análise em relação ao CSA, diâmetro de Feret máximo ou mínimo (todos os p > 0,05), indicando a precisão do nosso método. Assim, nosso protocolo de análise de imunocoloração pode ser aplicado para a investigação dos efeitos na composição muscular em muitos modelos de envelhecimento e miopatia.

-Já há algum tempo que o músculo esquelético é composto por fibras simples de muitos tipos¹. Inicialmente, dois grupos de fibras foram caracterizados com base em suas propriedades contráteis e chamado, apropriadamente, contração lenta (tipo I) e contração rápida (tipo II). Estas categorias eram ainda mais diferenciadas com base no metabolismo de fibra. Desde tipo I fibras são ricas em mitocôndrias e dependente do metabolismo oxidativo, eles foram elucidados por robustamente positivo dinucleótido de nicotinamida e adenina-tetrazólio redutase (NADH-TR) face² ou Succinato desidrogenase (SDH)³ a coloração. Por outro lado, as fibras do tipo II exibiram menor e graus variáveis de NADH-TR face ou SDH manchando e foram divididos em dois subgrupos de contração rápida (tipo IIA e IIB) um pouco grosseira com base na sua capacidade oxidativa relativa. Essas distinções entre fibras tem sido visualizadas mais eficazmente pela miosina-ATPase coloração onde tipo I fibras mancham escuras depois de uma pré-incubação a pH 4.0 e tipo IIB fibras absorvem precipitada seguir pré-incubação com fibras de tipo IIA pH 10,0 coloração intermediària⁴.

Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino de fibra-tipo⁵. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibras podem ser todos identificadas com precisão com base no seu perfil MyHC. Além disso, um outro tipo de rápido-contração muscular metabolicamente intermediário-fibra, tipo IIX, tem sido identificados⁶. Fibras de híbrido expressar mais do que um MyHC também foram confirmados^5,7,8. Algumas espécies como o gato e o babuíno são conhecidos para não expresso tipo IIB MyHCs⁶. Apesar de imunocoloração MyHC atualmente é a avaliação do estado-da-arte da composição muscular, a análise dos dados obtidos através desta técnica é complicado e demorado sem assistência automatizada. Para este fim, um punhado de métodos semi automatizados para analisar esses dados foram desenvolvidos^5,9,10. Aqui, apresentamos um protocolo relativamente padrão para identificação de imuno-histoquímica de fibra muscular tipo^5,7,8,10, , juntamente com um romance semi-automático algoritmo que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra com precisão.

todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê de uso e Universidade do Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care (91813(05)1D).

1. dia 1: primária (1°) imunocoloração com bloqueio de albumina de soro bovino (BSA)

1. ar seco seções congeladas do músculo do membro posterior de rato (por exemplo, tibial anterior, sóleo) montagem em slides carregados para ~ 30 min ¹¹. desenhar uma borda ao redor as seções usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta.
2. Lugar ~ 250 µ l de soro de 5% BSA/tampão de fosfato (BSA/PBS) em cada slide para bloquear a ligação do anticorpo específico. Incubar em temperatura ambiente por 1 h.
3. Enquanto bloqueia, 01:50 de preparar diluições do anticorpo 1 ° sobrenadante em 5% BSA/PBS (todos são anticorpos monoclonais de rato, ver tabela 1 ^{6 , 12}); preparar 250 µ l de solução por slide. Manter estoques de anticorpo de 1° e diluições na Ice.

tabela 1: os anticorpos primários usados para distinguir MyHCs.

4. após a aspiração da solução bloqueio 5% BSA/PBS, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 1° para os slides adequados. Adicionar 250 µ l de 5% BSA/PBS para controlo de negativo somente anticorpo secundário (2°) slides.
5. Incubar a 4 ° C por 24-48 h em um ambiente úmido.
   Nota: Um prato de Petri coberto com folha de alumínio com papel de filtro umedecido pode servir como uma câmara de incubação adequado.

2. Dia 2:2 ° imunocoloração com anticorpos fluorescentes

1. aspirar solução de anticorpo 1° ou 5% BSA/PBS solução de controle. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA.
2. Durante a lavagem, preparar diluições de 1: 200 dos anticorpos purificado, fluoróforo conjugado 2 ° em 5% BSA/PBS (ver tabela 2, todos são anti-rato cabra). Prepare 250 µ l de solução por slide. Manter anticorpos fluoróforo conjugado de 2° às escuras na Ice.

tabela 2: anticorpos secundarios conjugados fluoróforo usado para visualizar de primária do anticorpo reconhecimento do MyHCs.

3. após aspiração da terceira aplicação da solução a 5% BSA/PBS bloqueio, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 2° a todos os slides. Incubar durante 90 min à temperatura ambiente em um ambiente escuro, úmido.
4. Solução de anticorpo 2° aspirado. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA/PBS.
5. Lavagem com PBS. Seca durante 10 min.
6. Montar a lamela com um meio de não-permanentes, baixa viscosidade montagem aquoso.
7. Quando seco, selar as bordas de slide com as unhas pintadas. Secar e armazenar em um escuro slidebox.

3. Slides com microscopia de epifluorescência de imagem

1. limpar os slides com uma pequena, 70% etanol-embebido laboratório-limpeza.
2. Obter imagens digitais das seções de músculo immunostained usando um microscópio de epifluorescência, equipado com um aparelho fotográfico (consulte a Tabela de materiais).
   1. Selecione uma área de aproximadamente 1 mm ² (objetivo de 10 X, at 1.4).
   Filtro de passa-tempo
   2. Vista fluorescência de anticorpos conjugados a Alexa 488 2° através de um 505 nm. Ver os a fluorescência gerada pela excitação dos anticorpos conjugados a Alexa 594 2° através de um filtro de passa-tempo 595 nm. Digitalize imagens com um computador PC equipado com um software de imagem compatível. Incluem a barra de escala da imaging software para análise posterior.

4. Análise de imagens com Fiji

Nota: antes de prosseguir com a análise, Fiji (disponível livremente o National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve ser instalado através de https://imagej.net/Fiji/Downloads. Além disso, a macro usada neste processo é fornecida no Arquivo suplementar. Coloque o arquivo de macro em um diretório acessível.

1. Carga brightfield uma imagem de uma seção selecionada em Fiji. Navegue até Plugins → segmentação → segmentação Weka Trainable.
2. a fim de estipular as áreas celulares da seção, desenhar uma linha em uma fibra e clique em " adicionar a classe 1 ". Em seguida, desenhe uma linha no espaço entre as fibras e clique " adicionar a classe 2 " para marcar os domínios extracelulares. Repita até que há 5-10 etiquetas em cada classe. Classificador de trem clique
   1. . Sobre a sobreposição resultante de vermelha e verde, adicionar rótulos mais manualmente (consulte a etapa 4.2) incorretamente segmentado pedaços da imagem, se necessário. Repita até fibras (vermelho) são separadas adequadamente o espaço entre as fibras (verde).
3. Clique " probabilidade de obter " e salvar a imagem em uma pasta recém rotulada.
4. Repita o procedimento acima (passos 4.2-4.3) com a imagem fluorescente tirada do mesmo campo. Rotular as fibras immunostained como " classe 1 " e todas as regiões não-fluorescente como " classe 2 ". Salvar o mapa resultante de probabilidade para a mesma pasta onde a imagem processada brightfield é armazenada.
5. Abrir um dos mapas probabilidade salvo anteriormente em Fiji. Desenhe uma linha reta na barra de escala fornecida pelo software da imagem latente. Vá para analisar → definir escala. Altere os parâmetros (ou seja, distância conhecida, unidade de comprimento) para seus valores apropriados como determinado pela barra de escala e, em seguida, verificar o " Global " caixa para padronizar a escala para cada imagem.
6. Navegar para Plugins → Macros → executar → Tyagi et al fibra quantificação macro.ijm (consulte o Arquivo suplementar). Imediatamente, um painel de navegação irá aparecer. Abra a imagem ' pasta do host s; uma caixa de diálogo será exibida. Para cada caixa de diálogo, alterar o " fundo " valor de lista suspensa para " luz. "
   Nota: A pasta agora será preenchida com imagens dos contornos da fibra e arquivos de software de planilha dos resultados (diâmetro CSA e Ferrari são mais pertinentes ao quantificar a morfologia das fibras; parâmetros medidos podem ser ajustados em analisar medidas de conjunto). Dados de morfologia de fibra gerados pela função dos poros-análise de Fiji serão automaticamente transferidos para arquivos de software de planilha para ambas as imagens fluorescentes e brilhante campo.
7. Calcular a fração de fibras expressando um determinado MyHC em um campo, dividindo o número de fibras fluorescentes no campo com o número de fibras totais na imagem correspondente campo claro.

Músculos do membro posterior (ou seja, tibial anterior, sóleo) dissecados de um rato masculino de C57BL/6 de idade desconhecida foram flash congelado pelo afundamento de um molde de plástico que contém o músculo em OCT composto em isopentano arrefecido a nitrogênio líquido. Em seguida, usando um cryotome, 8-10 µm serial seções foram cortadas a-20 ° C e transferidas para lâminas de vidro carregado positivamente diferentes¹².

Nós escolhemos o tibial anterior e sóleo porque estes músculos são compostos predominantemente de fibras de contração rápida e lenta, respectivamente^13,14. Após a coloração para cada tipo I, IIA, IIX e MyHCs IIB, imuno-histoquímica brightfield e fluorescentes imagens foram capturadas. Os painéis à esquerda da Figura 1 mostram as seções de um immunostained do músculo sóleo com o tipo I, IIA, IIB MyHC específicas e IIX anticorpos listados na tabela 1.

Figura 1 : Coloração imuno-histoquímica de MyHC tipo I, IIA, IIX e IIB no músculo sóleo de rato. Painéis esquerdos mostram imagens fluorescentes obtidas de seções de um músculo sóleo de rato sondado com anticorpos primários, direcionados para o tipo I (BA-F8; A), tipo II (SC-71; B), tipo IIX (6 H 1; C) e tipo IIB (BF-F3; D) MyHCs. Certo painéis mostram as seções em que o anticorpo primário usado no experimento descrito no painel da esquerda correspondente foi omitido. Bares = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Especificamente, observamos substanciais frações de fibras expressando tipo I (Figura 1A, à esquerda) e tipo IIA MyHCs (Figura 1B, à esquerda) com uma quantidade razoável das restantes fibras exibindo coloração positiva para tipo IIX MyHCs (Figura 1C, à esquerda). Por outro lado, praticamente sem fibras IIB do tipo foram evidentes (Figura 1D, à esquerda). Essas observações são consistentes com os relatórios anteriores que músculos sóleo são compostos principalmente de tipo I, tipo IIA e tipo fibras IIX (nem tanto) com quase nenhum tipo IIB fibras^5,10,12. Importante, nenhuma mancha foi observada nas seções em que o anticorpo primário tinha sido omitido o protocolo, demonstrando a especificidade dos anticorpos (Figura 1A-D, painéis certo).

Figura 2 : Coloração imuno-histoquímica de MyHC tipo IIB, IIX, IIA e eu no músculo tibial anterior de rato. Painéis esquerdos mostram imagens fluorescentes obtidas de seções de um rato músculo tibial anterior sondado com anticorpos primários direcionados para tipo IIB (A), tipo IIX (B), tipo II (C) e tipo I (D) MyHCs. Certo painéis mostram as seções em que o anticorpo primário usado no experimento descrito no painel a esquerda adjacente foi omitido. Bares = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nós também manchado tibial anterior músculos com os anticorpos acima mencionados. Tibial anteriores músculos foram compostos principalmente de tipo IIB e tipo IIX MyHC-positivo fibras (Figura 2A-B, deixada painéis) com contribuições menores de fibras expressando tipo IIA MyHCs (Figura 2C, à esquerda); praticamente não há fibras expressando tipo eu MyHC foram observados (Figura 2D, à esquerda). Nossos dados indicando que o rato tibial anterior é composta predominantemente de rápida contração muscular tipo IIA, tipo IIB e tipo IIX fibras são consistentes com estudos anteriores^5,10,13. Novamente, nenhuma mancha foi observada nas seções em que o anticorpo primário tinha sido omitido o protocolo(Figura 2A-D, painéis certo).

Figura 3 : Segmentação de fibra computadorizado iterada. Brightfield imagem de uma seção anterior do tibial (A) do rato. Transformação da mesma imagem usando nosso algoritmo semi-automático (B). Imagem fluorescente de mesma seção mostrando immunostaining do tipo IIA MyHC (C). Imagem de transformação mostrando único tipo IIA MyHC-expressando fibras (D). Bares = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para efeitos de Análise morfométrica, brightfield imagens dos campos de immunostained também foram obtidas. O exemplo mostrado na Figura 3A é de uma seção de músculo anterior tibial sondada com SC-71 anticorpos dirigidos ao tipo IIA MyHCs¹³. Usando nosso algoritmo semi-automático original, várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade a partir das imagens de brightfield. Uma transformação de imagem típica derivada da imagem brightfield mostrada na Figura 3 é apresentada na Figura 3B. Usando a transformação e a função de análise de poro de Fiji, medimos o CSA médio (± 891.4 45,0 µm²), máximo (46,9 ± 1,3 µm) e mínimo (26,0 ± 0,8 µm) significa Feret diâmetros de cada fibra no campo. Para testar a fidelidade de nossas medições, também avaliamos esses parâmetros na imagem brightfield manualmente. O mau CSA (867.0 ± 52,0 µm²), máximo (45,7 ± 3,5 µm) e mínimo (25,6 ± 1,9 µm) quer dizer Ferrari diâmetros obtidos usando o método de aquisição manual mais tedioso não foram significativamente diferentes do método semi-automático (todos os p > 0,05, unpaired t-testes; Tabela 3).

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Tabela 3: morfologia das fibras e a composição do tibial anterior músculo immunostained para tipo I, IIA, IIB e IIX MyHCs conforme determinado pelo manuais e semi-automática de métodos analíticos. Quer dizer fibra CSA, significa Feret diâmetros e tipo de MyHC em um rato tibial anterior quantificadas através de avaliação manual tradicional versus o algoritmo apresentado. Por favor, note que frações combinadas excederem um valor de 1 devido à presença de fibras, expressando a mais de um tipo de MyHC.

Figura 3 C mostra uma imagem fluorescente do mesmo campo immunostained com anticorpos dirigidos ao tipo IIA MyHCs. Fibras manchadas de forma positiva no campo foram selecionadas por número (Figura 3-D) e usadas para determinar a fração de fibras do tipo IIA MyHC-expressando dividindo pelo número total de fibras no campo brightfield de transformação (tabela 3 ). A média CSA, máximo e mínimo Feret diâmetros de fibras de tipo IIA foram então avaliados (tabela 3). A proporção de tipo eu, as fibras tipo IIX e tipo IIB, bem como as suas dimensões, foram determinados, repetindo este protocolo em seções serial immunostained com BA-F8, 6h 1 e anticorpos BF-F3, respectivamente,^6,12(tabela 4 ; Figura 4 A-D).

Tabela 4: MyHC conteúdo e morfologia no sóleo rato e tibial anterior. Composições de tipo de fibra de seções representativas do sóleo e tibial anterior. Quantificação da CSA média, Ferrari e diâmetros mínimos e máximas de tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB do sóleo e tibial anterior são mostrados. Dados são dadas como mau ±SEM.

Também avaliamos esses parâmetros em um campo obtidos a partir do músculo sóleo (tabela 4; Figura 4 A-D). 3.052 e 2.876 fibras individuais foram contadas para o tibial anterior e músculos sóleo, respectivamente. Tomados em conjunto, estes dados demonstram a viabilidade do nosso método na análise do tipo de fibra e morfométricos.

Figura 4 : Resumo de dados de Análise morfométrica. Composições de fibra-tipo de seções representativas do tibial anterior e músculos sóleo (A). Quantificação da média CSA, minimimal e diâmetros de Feret máximas de tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB cinco no sóleo e tibial anteriort é mostrados em (B-D). Dados são dadas como dizer ±SEM. diferenças significativas entre o tibial anterior e sóleo são indicados (* denota p < 0.05: * * denota p < 0,01; * * * denota p < 0.005; teste-t). 3.052 e 2.876 fibras individuais foram contadas para o tibial anterior e músculos sóleo, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar: macro de quantificação de fibra. Clique aqui para baixar este arquivo.

Aqui, nós fornecemos orientação útil para a identificação dos tipos de fibra de músculo esquelético. Ao fazê-lo, descrevemos um novo algoritmo para análise dos dados.

Desde que nossos resultados, em grande parte, confirmam os anteriores relatórios^5,8,10 e refletem nossa própria medição manual, o algoritmo aparece ser exato. Ainda, encontramos algumas armadilhas experimentais infrequentes, incluindo bordas claras fibra resultantes de artefato de seccionamento. O impacto desses artefatos pode ser minimizado através de seccionamento cuidadoso e atento exame da seção processada antes da análise. Em particular, menos-do que-ideal segmentação de imagem pode ser contornada através de várias rodadas de reclassificação na mesma imagem para alcançar o contraste mais nítida.

A etapa mais crucial em nosso protocolo é um passo 4.2 em que estipulamos as áreas celulares e extracelulares da seção por desenhar uma linha em uma determinada fibra, distinguindo, assim, uma área de "classe 2" ou "classe 1". Obviamente, esta distinção manual é crítica porque determina os limites das fibras musculares; um erro nesta etapa afetará negativamente a avaliação das dimensões da fibra.

Neste estudo, nós sondou seções para apenas um MyHC em uma determinada seção serial. No entanto, algumas fibras, como fibras de híbrido, expressam dois tipos de MyHC, indicativo de sobreposição de perfis metabólicos/funcional (por exemplo, tipo IIX e IIB). Assim, as frações de fibra-tipo resumidas-se a um valor > 1 para o sóleo e tibial anterior(Figura 4). Fibras de híbrido podem ser identificadas com duplo-, ou até mesmo triplo-, rotulagem protocolos como os descritos por Lee et al ⁷e Bloemberg e Quadrilatero⁵, respectivamente. Importante, o nosso método de análise pode ser aplicado a esses protocolos de coloração mais complexos. Outra limitação do nosso protocolo é que não é totalmente automático; no entanto, acreditamos que esta pequena concessão garante que nosso método não compromete a rigor por causa da velocidade.

Enquanto as composições MyHC de tanto sóleo e tibial anteriores músculos observados neste estudo refletem os resultados de estudos anteriores^5,6,7,10,14 , há alguns contrastes com estudos anteriores sobre a avaliação do CSA. Por exemplo, nossas medições de CSA média são um pouco menores do que aqueles relatados por qualquer Bloemberg e Quadrilatero⁵ e Allen et al. ¹⁵ em particular, nossas medições de CSA variaram de 539.86 ± 24.44 µm² a 1319.50 ± 57.47 µm² através de tipos de fibra enquanto deles durou aproximadamente 735.7 ± 31,2 µm² para 3073.8 ± 51.3 µm². No entanto, os nossos valores mais se assemelham às observadas por Augusto et al . ¹³ e Lucas et al ⁶ que relataram CSAs médias variando de 436 ± 605 µm² 2404 ± 412.5 µm² e 815 ± 221 µm² a 1904 ± 570 µm², respectivamente. Assim, uma variabilidade na análise morfométrica das fibras do membro posterior do mouse existe em toda a literatura.

Imuno-histoquímica apresenta uma maneira eficiente para rotular e classificar as fibras musculares, com base no seu teor de MyHC. Quantificação precisa das experiências de imuno-histoquímica é essencial para fazer conclusões significativas sobre os dados; para este fim, um método que pode automatizar as partes tediosas de análise é útil, especialmente quando centenas ou mesmo milhares, de fibras precisam ser medidos e classificados. Além de fornecer medições semelhantes às observações manuais, nosso algoritmo fornece uma avaliação rigorosa destes dados sem preconceito; Esta vantagem sobre medição manual garante rigor científico. A este respeito, a nossa metodologia pode ser útil na caracterização dos efeitos de manipulações genéticas e experimentais que afetam a integridade do músculo. Especificamente, juntamente com o nosso método de rápida análise imuno-histoquímica de MyHC pode ser empregada para avaliar as alterações morfológicas e metabólicas no músculo dos modelos de doenças como as distrofias musculares, caquexia ALS e câncer. Além disso, a eficácia das intervenções que impedem a atrofia ou hipertrofia de causar também poderão ser avaliada.

Os autores têm sem interesses conflitantes para divulgar.

Estamos gratos à Fundação Boettcher e a associação de esclerose Lateral amiotrófica (#17-II-344) pelo apoio da pesquisa.