Avaliação do Maternal Vascular Reformas durante a gravidez no mouse Útero

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

A troca de nutrientes, gases e produtos residuais durante a gestação eutherian é mediada pela placenta. No trato reprodutivo feminino, as artérias uterinas são as principais condutas de sangue para o útero. Após a implantação, estes ramo em navios especializados chamados artérias em espiral que bobina através dos decídua basal para a unidade fetoplacentária. Diâmetro e elasticidade dessas artérias em espiral, que estão rodeados por leucócitos, em particular de células natural killer uterinas (desconhecido), ditar volume e velocidade do sangue disponível para a placenta ^1,2. Alterações hemodinâmicas corretos, como resultado da remodelação das artérias em espiral são críticos para o sucesso da gravidez.

Embora os mecanismos subjacentes diferem em detalhe entre o ser humano e murino a gravidez, o resultado final do processo de remodelação em ambas as espécies é dilatada, de alta condutância vasculatura que perde a sua camada de músculo liso. Em ratinhos, o interferão uNK derivada de células (SEN-) γ é necessário para induzir essas mudanças em torno de meados de gestação ^3-5. Os ratos que não têm a utilização de células NK ou componentes da via de sinalização de IFN-γ não conseguem passar por essas mudanças e isso está associado à redução ^{de 6,7} crescimento fetal, salientando a importância de um fornecimento de sangue adequado para a unidade fetoplacentária. Durante a gravidez humano início, a invasão intersticial e endovascular de trophoblast extravilosas e sua interação com células uNK são importantes para induzir alterações vasculares e promover o crescimento fetal ^8-10. células uNK pode orquestrar a invasão do trofoblasto humano através quimiocinas ¹¹ e citocinas, tais como granulócitos macrófagos - fator estimulante de colônia (GM-CSF) ^12. Invasão do trofoblasto raso está associado à redução de remodelação arterial e complicações na gravidez, tais como pré-eclampsia ^9.

Este protocolo é baseado no trabalho pioneiro de Anne Croy que descreveu o importantepapel do sistema imunológico e, particularmente NK-derivado de IFN-γ para a remodelação vascular bem sucedida através de imuno-histoquímica e de transferência elegante experiências ^5,13. Aqui nós descrevemos uma maneira rápida e econômica para avaliar o estado de remodelação das artérias em espiral. Embora nosso laboratório avalia rotineiramente isso em meados de gestação (dias de gestação (gd) 9.5) ^14, o processo de remodelação ocorre entre gd8.5 e 12,5 ^15. O advento de scanners de slides automatizadas facilitou enormemente a avaliação da área do vaso e do lúmen das seções e encontramos esta ser uma abordagem mais reprodutível do que medir os diâmetros dos vasos. A adição de detecção imuno-histoquímica da SMA permite uma validação e simples dos resultados obtidos a partir da avaliação estereologia. Tal como acontece com todas as técnicas estereológicas, recomenda-se para efectuar a avaliação como uma experiência cega por pelo menos dois examinadores. Para este fim, um passo de aleatorização pode ser introduzido quando cortado em sérieting as amostras para que os investigadores avaliem os slides não sabem de qual grupo experimental as amostras vêm.

O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar uma ferramenta confiável para avaliar cuidadosamente a remodelação das artérias em espiral em ratos com genótipos maternos e paternos definidos, no contexto de modelos de mouse para complicações relacionadas com a gravidez. Os resultados sublinham a dependência de células uNK do presente processo, que é essencial para o crescimento normal do feto.

Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e são aprovados pelo Painel de Revisão Ética Cambridge.

1. Coleta de Amostras

1. Configure acasalamentos programados usando 8-12 semanas de idade do sexo feminino camundongos C57BL / 6 com homens adultos (até 2 fêmeas para cada macho) à tarde. Verificar a presença de tampões vaginais como um sinal de cópula no início da manhã, nos seguintes dias. A presença de um plug no gd0.5 marcas manhã.
2. Em gd9.5, sacrificar o animal por deslocamento cervical e a cavidade abdominal aberta. Note-se que a eutanásia por CO _{2 pode causar} vasodilatação.
3. Use fio dental para ligar suavemente as artérias uterinas (figura 1, setas tracejadas). Amarrar o fio em volta das artérias na ponta de cada trompa uterina, proximal para os ovários, bem como em torno do colo do útero.
   Nota: Não ruptura dos vasos, pois isso pode resultar em artérias desabaram.
4. Dissecar o útero rapidamente usando tesouras de dissecação, extraindo todo o útero distalmente para os três pontos de ligação na ponta dos cornos uterinos e do colo do útero.
5. Colocar o útero em um pedaço de poliestireno preparadas de tal modo que ambos os cornos estão alinhadas ao longo do mesmo eixo longo em direcções opostas a partir do colo do útero. Gentilmente esticá-lo e fixá no lugar usando 2-3 25 agulhas G.
6. Mergulha-se o poliestireno em um tubo de 50 ml preparadas cónica. Encher a 50 ml com formalina a 10%. Fix para 5-6 horas à temperatura ambiente.
7. Descartar a solução de formalina e substituir com 50 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) durante 5 min.
8. Extirpar os dois cornos uterinos proximal ao ponto de ligação em cada extremidade e proximal do colo do útero no centro, aparar qualquer excesso de gordura ao redor dos locais de implantação e lavar duas vezes em PBS durante 5 minutos para remover traços de formol.
9. Armazenar as amostras em etanol a 70% a 4 ° C (até duas semanas) até ao processamento.
   CUIDADO: Ethanol é altamente inflamável.
10. Usar um sistema de processamento automatizado utilizando os parâmetros indicados no Quadro 1. Incorporar os chifres individualmente em parafina, de modo que eles podem ser cortados ao longo do plano perpendicular ao longo eixo do útero. Isto garante que a área máxima de cada local de implantação será exposto para análise no meio do bloco (Figura 2A).
    OPCIONAL: Este é um ponto de tempo conveniente para a randomização dos blocos se se desejar.
11. Usando um micrótomo, corte cortes seriados de 7 de espessura mm a partir dos blocos. Manchar uma seção a cada intervalo de 49 mm com hematoxilina e eosina (H & E, ver secção 2.1). Armazenar os restantes secções à temperatura ambiente para a coloração SMA e outras aplicações a jusante.

Tabela 1:. Definições para processamento de tecidos automatizado Visão geral da configuração usada para o processamento de tecido uterino

2. SterAvaliação eological

1. H & E Coloração
   1. Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de lâminas em um banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente.
      CUIDADO: O xileno é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Este trabalho deve ser realizado em um exaustor, utilizando equipamento de protecção individual (EPI).
   2. Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min.
   3. Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95%, etanol a 70% e água purificada durante 5 minutos cada.
   4. Imergir as lâminas em 50% Gill n 3 hematoxilina solução, diluiu-se com água purificada, durante 5 min.
      CUIDADO: Hematoxilina é nocivo por ingestão e contato com os olhos. Utilizar EPI adequado ao manusear.
   5. Lavar as lâminas em uma calha de coloração em água corrente por 10 min.
   6. Imergir as lâminas em 1% de solução de ácido / álcool (1% de ácido clorídrico a 10 M em etanol a 70%) durante 10 sege lavar em uma calha de coloração em água corrente.
   7. Imergir as lâminas em solução de eosina para 30 seg e lavar em uma calha de coloração em água corrente por 10 min.
   8. Dentro de um exaustor de fumos, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 70%, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada.
   9. Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min.
   10. Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio.
2. Avaliação estereológica de tamanho do vaso e remodelamento Estado
   1. Para cada local de implantação, determinar quais seções estão perto do ponto midsagittal. O anexo corioalant�ca entre o feto ea placenta em desenvolvimento serve como um bom indicador do ponto midsagittal.
   2. Selecione 3 seções em 49 mm intervalos próximos ao ponto midsagittal para a análise. Digitalizar slides selecionados. A fim de evitar Including veias, que foram mostrados para ser mais perifericamente localizados nos locais de implantação ^16, restringir a análise no centro de 2/4 de cada local de implante (Figura 2A).
   3. Para avaliar o tamanho do lúmen, desenhar em torno do interior dos vasos e gravar a área desta forma. Para o tamanho total do vaso, desenhar em torno da parede exterior do recipiente, incluindo as células endoteliais, pericitos e leucócitos intramurais.
      Nota: A relação entre o tamanho total do vaso de lúmen é um proxy para o status de remodelação de uma embarcação. Como os navios de bobina através do plano da secção que foi cortado ao longo, pode haver várias secções transversais da mesma artéria numa única lâmina. Evitar a medição da mesma artéria várias vezes.
   4. Grave as medições dos 5 navios em cada local de implantação com as maiores e mais redondos lumens. Meça cada local de implantação em triplicata (três seções espaçadas 49 mm afastados uns dos outros). A média destes 15 medições represeNTS o diâmetro médio dos vasos maiores.
   5. Para evitar sobre-representação de navios maiores em algumas amostras, meça o mesmo número de embarcações em cada local de implantação.

3. Avaliação Qualitativa Usando imunohistoquímica

1. Desparafinização e reidratação
   1. Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de corrediça resistente ao calor num banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente.
   2. Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min.
   3. Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95% e 70% e com água purificada durante 5 minutos cada.
2. Antigen Recuperação
   1. Preparar um tampão de citrato de sódio 10 mM em água purificada e ajustar até pH 6 utilizando ácido clorídrico a 10 M.
   2. Encha um recipiente resistente ao calor que pode conter 600 ml com 400 ml de tampão citrato de sódio e coloque em uma panela de pressão doméstica contendo wat suficienteer para submergir metade do recipiente. Genericamente anexar a tampa da panela de pressão e de calor até à ebulição.
   3. Colocar a lâmina cremalheira no tampão de citrato de sódio e fixar firmemente a tampa da panela de pressão. Uma vez pressurizada, deixar ferver durante 3 min.
   4. Retire a pressão da panela de pressão e retire o recipiente interior. Permitir lâminas arrefecer no tampão de citrato de sódio durante 10 min à temperatura ambiente.
   5. Lavagem das lâminas num banho contendo água purificada durante 5 min.
   6. Cercar as seções usando uma caneta barreira hidrofóbica.
   7. Lavagem das lâminas por imersão em PBS durante 5 min.
3. O bloqueio da peroxidase endógena e a ligação não específica
   1. Incubar secções com 3% de peróxido de hidrogénio diluído em água purificada numa câmara humidificada, durante 30 min à temperatura ambiente.
      CUIDADO: O peróxido de hidrogênio é altamente irritante para os olhos, a pele e por ingestão. Utilizar EPI adequado.
   2. Toque o excesso de solução de peróxido de hidrogênio e lave SLIdes duas vezes por imersão em solução salina tamponada com Tris (TBS) durante 2 minutos cada.
   3. Incubar secções com imunoglobulina de ratinho a partir do reagente de bloqueio do rato no kit de rato preparadas de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Lavagem das lâminas em TBS duas vezes durante 2 minutos cada.
4. A imunodetecção de actina de músculo liso
   1. Preparar a solução diluente de anticorpo (fornecido no kit) e incubar com as secções durante 5 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Dilui-se 1: 100 actina de músculo liso de ratinho anti-humano (Dako M0851) em solução diluente de anticorpo. Diluir controlo de isotipo de IgG2a de ratinho em solução diluente de anticorpo, assegurando que a concentração de imunoglobulina final é equivalente em ambas as soluções.
   3. Toque o excesso de seções de solução diluente de anticorpo e cobrir com tanto soluções de controle de anticorpos isotípicos ou diluído. Incubar numa câmara húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente.
   4. Lave as lâminas duas vezes em TBS para2 min cada.
   5. Diluir anticorpo anti-ratinho biotinilado secundário e secções incubar durante 10 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções dos fabricantes.
   6. Lavagem das lâminas uma vez cada com TBS e PBS durante 2 min, respectivamente.
   7. Preparar a solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) de acordo com as instruções do fabricante. Cubra seções com solução DAB e incubar por até 4 min, garantindo para monitorar seções para evitar o excesso de desenvolvimento da cor.
      CUIDADO: DAB é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Utilizar EPI adequado ao manusear.
   8. Imergir as lâminas em água purificada uma vez intensidade da coloração desejada seja atingida.
   9. Contracoloração com 50% Gill No. 3 hematoxilina durante 20 segundos e lavar em uma calha de coloração em água corrente até que a água corre claro.
5. Desidratação e montagem
   1. Dentro de um exaustor, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo 70% ethanol, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada.
   2. Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min.
   3. Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio

RAG2 ^{- / -} IL2RG ^{- / -} ratinhos faltam todos os linfócitos maduros, incluindo células NK ^17, e suas artérias uterinas deixar de sofrer as alterações vasculares vistas na wildtype congénica C57BL / 6 (WT) ratos em meados de gestação ^5,14. Como resultado desta reduzida RAG2 remodelação ^{- / -} IL2RG ^{- / -} ratos mostram significativamente menores áreas luminais superfície, indicativos de navios em geral mais pequenas que podem ser visualizadas em secções H & E-coradas e quantificados por estereologia (Figura 2). Além disso, a espessura da parede relativa (embarcação a proporção lúmen) é maior nas artérias espiraladas em destes ratinhos, sugerindo reduzido fornecimento de sangue arterial e a velocidade mais elevada.

Esta avaliação quantitativa foi confirmada usando a detecção imunohistoquímica da SMA. É característico para ratinhos WT a perder a maior parte da SMA dentro da média vasculardas artérias em espiral até meados de gestação. Se este processo impulsionado por células NK não ocorrer, SMA permanece na mídia dos vasos e pode ser facilmente detectada immunohistochemically como anéis ao redor dos vasos sangüíneos (Figura 3).

Figura 1: Rato útero em gd9.5, visão esquemática desenho mostrando a posição relativa dos cornos uterinos, colo do útero (azul) e principais artérias uterinas (vermelho).. Indicado são o eixo longo dos cornos uterinos (setas) e os pontos de ligação (setas tracejadas). As secções para imuno-histoquímica são cortadas ao longo do plano de vista.

Figura 2:. Estereológica avaliação do remodelamento arterial em meados de gestação (A) Exemplo assessment de luminal e área total do vaso em secções H & E manchadas de fêmeas WT no centro de 2/4 dos decídua basal (demarcada pelo preta vertical linhas tracejadas) no gd9.5. Nos navios em maior ampliação, correu a linha vermelha demarca área total de navio, amarelo linha tracejada demarca as áreas da luz. Barra = 500 um (esquerda), 50 uM (à direita). O longo eixo do útero é uma linha horizontal nesta orientação. (B) Quantificação de áreas luminais (painel esquerdo) e proporção de área para área total luminal do vaso (painel da direita) de WT (C57BL / 6) e RAG2 ^{- / -} IL2RG ^{- / -} ratinhos (em C57BL / 6 de fundo). Cada ponto de dados representa a média de 15 medições de 5 medições (por secção, 3 secções por local de implantação). Barras representam a média de n = 11-13 locais de implantação a partir de 4 gravidezes por grupo; p-valor a partir de uma de duas caudas, não emparelhado teste de Mann-Whitney. WT: tipo selvagem.

Figura 3:. A detecção imuno-histoquímica de actina do músculo liso nas decídua basal coloração representativas SMA em WT (topo) e RAG2 ^{- / - - / -} IL2RG ratinhos (em C57BL / 6 fundo, na parte inferior) gd9.5. Barra = 100 um. WT: tipo selvagem.

O protocolo aqui apresentado destina-se a proporcionar um método através do qual reprodutível para avaliar as alterações vasculares que são necessárias para a gravidez bem sucedida. Fundamental para o sucesso desta avaliação é a qualidade das secções de tecido. Ambos determinar com precisão a idade gestacional dos locais de implantação, bem como ligando de forma confiável as artérias uterinas são passos fundamentais. Alterações nos parâmetros como tempo de fixação, protocolo de processamento de tecidos, etc. também podem afetar o resultado. Para uma avaliação estereologia imparcial, é importante medir o mesmo número de recipientes em cada local de implante. Recomenda-se a medir 5 navios por local de implantação e cada local de implantação em triplicado. A média destas medições 15 representa o tamanho médio dos 5 maiores navios.

Para além dos dados de RAG2 alymphoid ^{- / -} IL2RG ^{- / -} ratos mostrado aqui, encontramos este protOCOL úteis para um número de modelos de função imune materno inadequada, incluindo uma das células NK inibidos ^14. Defeitos na remodelação arterial também têm sido mostrados em modelos de prejudicada invasão trofoblástica ¹⁸ e as técnicas descritas aqui podem ser úteis para avaliar a vasculatura nestes casos. Nós otimizado e validado este protocolo para investigação de remodelação vascular decidual no meio da gestação em camundongos, mas também é concebível para adaptar este protocolo para trabalhar em outros sistemas de modelos (por exemplo, ratos) ou mesmo em outros órgãos. Enquanto nós achamos que a remodelação NK-dependente pode ser robustamente avaliado em gd9.5, ele pode ser alterado para outros pontos de tempo, tais como gd12.5, quando a vasculatura materna está completamente remodelado. Neste ponto de tempo, a invasão do trofoblasto endovascular é mais profunda ¹⁶ e este ponto de tempo pode ser mais adequado para investigações de o papel de trofoblasto para alterações vasculares. Se as leituras quantitativas adicionais são desejados,investigadores também pode aumentar o número de secções coradas para SMA e avaliar a percentagem de vasos remodelados parcialmente dentro de cada local de implante.

Uma limitação deste protocolo é a natureza descritiva dos exames histológicos. Os ensaios funcionais, no entanto, são apenas lentamente a tornar-se disponíveis (tal como ultra-som Doppler ^19). Estas técnicas exigem perícia técnica e custos muito mais elevados para aquisição e manutenção de equipamento, mas tem a vantagem de proporcionar uma leitura longitudinal in vivo para o efeito das alterações que podem ser observadas histologicamente. Uma possível desvantagem de todos os exames estereológicos é a subjetividade dos investigadores. Para o efeito, utilizando dois examinadores independentes que analisam todas as amostras de forma independente pode ajudar a evitar esse problema. Enquanto o protocolo descrito aqui dá uma visão sobre a quantidade de sangue pode chegar a interface feto-materna, pode ser vantajoso para combiná-lo com o complabordagem ementary de avaliar a quantidade total de sangue a qualquer momento na vasculatura através de plástico lança ^16.

A força deste protocolo é que ele combina duas abordagens independentes. Alteração vascular é primeiro avaliada quantitativamente por estereologia eo resultado é então validado qualitativamente usando imuno-histoquímica. A confiabilidade dos resultados pode ser reforçada por randomizing as amostras. As amostras preparadas para este protocolo pode ser facilmente utilizado para investigar também outros parâmetros, tais como a gravidez de decidualização, o desenvolvimento do agregado linfóide mesometrial de gravidez (PAE) ou imunodetecção de células de interesse, para avaliar com rigor um fenótipo gravidez em midgestation.

Remodelamento arterial é um passo crítico para gestações sem complicações em mulheres e fracasso dessas mudanças está na base das grandes síndromes obstétricas (GOS), ou seja, pré-eclampsia, restrição de crescimento fetal enatimorto. Nós apresentamos aqui as técnicas para avaliar cuidadosamente um fenótipo gravidez no mouse modelos que imitam algumas características da fisiopatologia da GOS.

The authors have nothing to disclose.

The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.