Method Article
Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.
Acidente vascular cerebral que afecte contas de matéria branca para até 25% das apresentações clínicas acidente vascular cerebral, ocorre silenciosamente em taxas que podem ser 5-10 vezes maior, e contribui significativamente para o desenvolvimento de demência vascular. Alguns modelos de acidente vascular cerebral focal substância branca existir e esta falta de modelos apropriados tem dificultado a compreensão dos mecanismos neurobiológicos envolvidos na resposta a uma lesão e reparação após este tipo de acidente vascular cerebral. A principal limitação de outros modelos de acidente vascular cerebral subcorticais é que eles não focalmente restringir o enfarte e a substância branca ou foram validados principalmente em espécies não murinas. Isto limita a capacidade de aplicar a grande variedade de ferramentas de investigação para estudar o murino de acidente vascular cerebral neurobiologia substância branca. Aqui apresenta-se uma metodologia para a produção fiável de um acidente vascular cerebral focal em matéria branca murino utilizando uma injecção local de um inibidor de eNOS irreversível. Apresentamos também diversas variações no protocolo geral, incluindo dois estereotáxica únicavariações, traçando retrógrada neuronal, bem como de rotulagem tecido fresco e dissecação que expandir muito as potenciais aplicações desta técnica. Estas variações permitem múltiplas abordagens para analisar os efeitos neurobiológicos desta forma comum e pouco estudado de acidente vascular cerebral.
Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US 1. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia 2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist 4,5.
The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.
Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) 6 that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded 7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.
The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) 9 with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 10. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.
O uso de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pela University of California Los Angeles Animal Care e do Comitê Use.
Nota: Comece identificando a população murina alvo. Em estudos anteriores, do tipo selvagem ratinhos C57 / Bl6 machos única têm sido utilizadas, no entanto vários ratinhos transgénicos ou knockout também pode ser usado. Note-se que as coordenadas estereotáxicas baseiam-se em murganhos C57 / BL6 anatomia. Recomenda-se que cada usuário inicialmente verificar a localização do curso de substância branca.
1. Branco Matéria curso de indução - Medial Abordagem angular
2. Branco Matéria curso de indução - Posterior Abordagem angular
3. neuronal retrógrada Labeling
4. Processamento de tecido por imunofluorescência
5. Processamento de Tecidos para a proteína ou RNA Análise
Usando o modelo apresentado, a matéria branca forelimb subjacente córtex sensório-motor confiável pode ser alvo. Este modelo de acidente vascular cerebral induzida quimicamente produz axonal focal e a perda de mielina, astrocitose e microgliose (Figura 1), como é tipicamente visto nos enfartes lacunares humanos. Usando três injeções, um modelo clinicamente útil é estabelecida com comprometimento precoce em tarefas motoras membro anterior 7 e uma pequena, mas significativa porção de experiências tecido cerebral isquemia, que imuno-histoquímica, imunofluorescência, e bioquímicos técnicas são viáveis e confiáveis em nível quantitativo. Em pontos de tempo iniciais (h) depois de indução de acidente vascular cerebral, as alterações na organização molecular axonal podem ser detectados (Figura 2). Aos 7 dias, o acidente vascular cerebral completa a sua maturação a uma área circunscrita da perda axonal (Figura 1a). Em nossas mãos, este método produz uma approxima lesão da substância branca focalmadamente 800 um de diâmetro horizontal e que se estende aproximadamente, 1 mm ao longo do eixo ântero-posterior do corpo caloso. Por 7 dias, o tamanho médio do enfarte total é de aproximadamente 0,200 mm3 e terá uma forma elíptica. Temos observado cerca de 10% de variabilidade no tamanho acidente vascular cerebral tanto entre os animais e entre as secções, dependendo de onde no elipse da secção ocorre. Ainda mais o crescimento no tamanho do infarto é raramente visto além de 7 dias.
A adição de uma injecção simultânea de dextrano em resultados de amina marcação neuronal significativa na camada 5 e 6 camada corpos celulares neuronais que possuem axónios que se projectam através da região de acidente vascular cerebral (Figura 3). neurónios corticais sobrejacente que não são danificadas pelos aspectos sham do procedimento (passagem de agulha fina), são submetidos a lesão axonal distal e pode ser identificado através da inclusão de um marcador com a preparação de L-NIO. Esta abordagem foi o uso d para demonstrar as alterações dinâmicas do segmento inicial do axônio após acidente vascular cerebral 8.
Embora o pequeno tamanho da região de tecido afectado pelo acidente vascular cerebral limita a utilização de outras técnicas comuns, tais como o cloreto de (TTC) coloração de 2,3,5-trifeniltetrazólio, o acidente vascular cerebral região matéria branca pode ser identificada em tecido fresco. A adição de um corante comum tal como Fast Green produz uma região de identificação de tecido que podem ser dissecados sob um microscópio de dissecação (Figura 4). Depois de dissecados este tecido pode ser utilizado para análise de proteínas com western blot ou imunoprecipitação, ou para o isolamento de ARN e a análise (Figura 4C). Através da utilização de várias linhas de ratos transgénicos, uma variedade de abordagens inovadoras podem ser usadas para estudar a neurobiologia após acidente vascular cerebral focal de substância branca incluindo estudos de mapeamento de destino celular e microdissecação de captura laser (Figura 4C).
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Figura 2:. Branco Matéria do curso Altera axonal Organização microdomínio Dentro de 3 horas da indução branco importa acidente vascular cerebral, organização microdomínio axonal no nó, marcado por espectrina beta-IV (vermelho) e no paranode, marcado por proteína associada a contactina (caspr, verde), é interrompido (setas, B). Contralateral axônios da substância branca mostrar nodal regular, paranodal e organização juxtaparanodal (A e C), enquanto a substância branca ipsilateral mostra alongamento nodal e paranodal que é típico dos axônios com contato axoglial perdeu (B e D). Barra de escala = 5 uM.
Figura 3: neuronal retrógrada Labeling com Branco Matéria do curso Identifica Individual neurônios com lesão axonal. Co-injecção de amina dextrano fluorescente (vermelho) no momento da indução de acidente vascular cerebral permite a identificação de neurônios individuais com axônios lesionados por acidente vascular cerebral. A maior parte da rotulagem ocorre em axônios dentro da camada 5 e 6 neurônios no córtex sensório-motoras primárias que recobrem o acidente vascular cerebral. Imagem representa 7 dias após o acidente vascular cerebral. Barra de escala = 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Microdissecção de lesões curso branco material protegido para uso em Biochemical e transcricionais ensaios de co-injecção de Fast Green, no momento da indução acidente vascular cerebral permite a identificação precoce da região feridas às 24 horas (A, painel superior). Immunoblotting para as proteínas específicas axonal pode ser realizada para demonstrar a redução da região de acidente vascular cerebral sozinho (A, painel inferior). Em pontos de tempo mais longos, a região de acidente vascular cerebral substância branca (painel da esquerda) pode ser focalmente dissecados sem marcação específica (B). Painel superior direito mostra a região da matéria branca após remoção da região dissecados enquanto o painel inferior direito mostra a região dissecados de matéria branca que contém o acidente vascular cerebral (B). PCR para genes específicos de oligodendrócitos utilizando ARN isolado a partir de regiões dissecadas a partir da matéria branca (C). IL = ipsilateral; CL = contralateral; c = controle; S = curso.
injeção | Anterior / Posterior | Medial / lateral | Dorsal / Ventral |
1 | 0,22 | 0,22 | -2.10 |
2 | 0,70 | 0,15 | -2,16 |
3 | 1.21 | 0,15 | -2,18 |
Tabela 1: coordenadas estereotáxicas para Approach angular lateral (em mm).
injeção | Anterior / Posterior | Medial / lateral | Dorsal / Ventral |
1 | -0.75 | -0,96 | -2.10 |
2 | -1.00 | -0,96 | -2,05 |
3 | -1.25 | -0,96 | -2.00 |
Tabela 2: coordenadas estereotáxicas para Approach angular Posterior (em mm).
Um número de modelos anteriores de acidente vascular cerebral subcorticais tenham sido descritos incluindo injecções focais de endotelina-1 para a cápsula interna, matéria branca subcortical e corpo estriado do rato 6,15 12-14 e rato. Modelos mais recentes de pequenos acidentes vasculares cerebrais focais têm utilizado a injeção microembolias colesterol na artéria carótida 16 e oclusão photothrombotic de um único arteríolas penetrantes 17. Cada um destes modelos tem vantagens e desvantagens 5. O modelo descrito presentemente produz uma lesão que tem uma série de características que imitam enfarte lacunar humano, incluindo anormalidades axonais e perda, degradação da mielina, um núcleo de necrose focal e um déficit clínico que é mínima e demonstra bastante rápida recuperação de dependentes de 7 anos de idade. Segmentação substância branca de murino permite uma grande variedade de manipulações genéticas que podem suportar estudos mecanicistas.
a críticapassos do protocolo incluir a utilização de coordenadas estereotáxicas precisos. Porque a substância branca murino é pequena em tamanho e varia de estirpe para estirpe, revisão das coordenadas estereotáxicas pode ser necessário, dependendo da idade e estirpe de ratinho utilizada. Controlo do volume da injecção, também é importante que este está directamente correlacionada com o tamanho do enfarte. injecções maiores produzem traços maiores que invadam córtex sobrejacente e striatum subjacente.
Focal da injecção de ET-1 utilizando a abordagem descrita aqui tem sido relatado mas endotelina-1 foi demonstrado que têm efeitos directos sobre parácrinos diferenciação e maturação dos oligodendrócitos 10,18 confundindo o estudo de pós-AVC matéria branca biologia. Em contraste, os alvos de aproximação L-NIO células endoteliais sozinha enquanto produzindo uma lesão idêntica e elimina quaisquer efeitos parácrinos de confusão sobre as células envolvidas na resposta a uma lesão. L-NIO não é directamente citotóxico e a selecdose de Ted foi determinada por experiências preliminares de escalonamento de dose (dados não mostrados). A abordagem posterior angulada foi desenvolvido para mais precisamente axónios recortadas a partir do córtex motor primário produzir o défice comportamental máxima que pode ser atribuída a lesões da substância branca. A abordagem em ângulo medial também danos axônios do córtex motor, mas estende-se mais lateralmente e envolve os axônios subjacentes córtex sensorial primário.
A lesão acidente vascular cerebral expande muito rapidamente durante as primeiras 24 horas. Aos sete dias, o tamanho do enfarte é máxima e que não têm observado um crescimento significativo lesão para além desse período. eventos celulares adicionais e degeneração axonal irá ocorrer para além desta fase inicial, mas a dimensão do enfarte medida pelo núcleo necrótico não mudará significativamente na ausência de qualquer intervenção.
A co-injecção de marcadores neuroanatomical no momento do acidente vascular cerebral identifica neurónios que experimentam lesão axonal isquémica. Usando o medial ou posterior abordagem em ângulo, os corpos celulares neuronais com projeções axonal danificados permanecem incólumes. Isto cria um modelo útil para estudar o efeito de axotomia isquémica em neurónios do sistema nervoso central. Nós utilizamos marcadores principalmente retrógradas incluindo amina dextrano e Fluorogold, que ambos mostram excelente aceitação por parte dos axônios danificados tempos. Ao empregar a grande variedade de transgênicos e linhas de knock-out do mouse, os usuários deste protocolo pode investigar o papel específico de genes neuronais envolvidas na matéria curso branco resposta a uma lesão e reparação.
Nenhum
SN e MDD receberam apoio do NIH K08 NS083740 e do Departamento de Neurologia UCLA. AJG reconhece o apoio do Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Fundação de Pesquisa Médica e da L. Hillblom Fundação Larry. KLN agradece o apoio da Stroke Center American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS e STC foram apoiados pelo NIH R01 NS071481. JDH reconhece o apoio do NIH K08 NS083740.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride | Calbiochem | 400600-20MG | |
Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical, Inc. | NDC 57319-559-06 | |
Capillary tubes | World Precision Instruments | 50-821-807 | |
Picospritzer | Parker Instrumentation | Picospritzer II | |
Stereotactic setup | Kent Scientific | KSC51725 | |
Pipette puller | KOPF | Model 720 | |
Stereomicroscope SZ51 | Olympus | 88-124 | |
Fine scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | |
Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8547 | |
Curved Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8598 | |
Blunt dissection tool | Fine Scientific Tools | 10066-15 | |
Drill | Dremel | 8220-1/28 | |
Drill bits | Fine Scientific Tools | 19007-05 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Marcaine | HOSPIRA | NDC 0409-1610-50 | |
Trimethoprim-Sulfamethaxole | STI Pharmacy | NDC 54879-007-16 | |
Fluororuby | Fluorochrome Inc | 30 mg | |
Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
Sucrose | Fisher | BP220-10 | |
Cryostat | Leica CM3050 S | 14047033518 | |
Glass slides | Fisher | 12-544-7 | |
Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
Dissection microscope | Nikon | SMZ1500 | |
23 G butterfly needle | Fisher | 14-840-35 | |
10x Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14065056 | |
1 M HEPES-KOH, pH 7.4 | Affymetrix | 16924 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Cyclohexamide | Sigma | 01810 |
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