A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Acidente vascular cerebral que afecte contas de matéria branca para até 25% das apresentações clínicas acidente vascular cerebral, ocorre silenciosamente em taxas que podem ser 5-10 vezes maior, e contribui significativamente para o desenvolvimento de demência vascular. Alguns modelos de acidente vascular cerebral focal substância branca existir e esta falta de modelos apropriados tem dificultado a compreensão dos mecanismos neurobiológicos envolvidos na resposta a uma lesão e reparação após este tipo de acidente vascular cerebral. A principal limitação de outros modelos de acidente vascular cerebral subcorticais é que eles não focalmente restringir o enfarte e a substância branca ou foram validados principalmente em espécies não murinas. Isto limita a capacidade de aplicar a grande variedade de ferramentas de investigação para estudar o murino de acidente vascular cerebral neurobiologia substância branca. Aqui apresenta-se uma metodologia para a produção fiável de um acidente vascular cerebral focal em matéria branca murino utilizando uma injecção local de um inibidor de eNOS irreversível. Apresentamos também diversas variações no protocolo geral, incluindo dois estereotáxica únicavariações, traçando retrógrada neuronal, bem como de rotulagem tecido fresco e dissecação que expandir muito as potenciais aplicações desta técnica. Estas variações permitem múltiplas abordagens para analisar os efeitos neurobiológicos desta forma comum e pouco estudado de acidente vascular cerebral.

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

O uso de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pela University of California Los Angeles Animal Care e do Comitê Use.

Nota: Comece identificando a população murina alvo. Em estudos anteriores, do tipo selvagem ratinhos C57 / Bl6 machos única têm sido utilizadas, no entanto vários ratinhos transgénicos ou knockout também pode ser usado. Note-se que as coordenadas estereotáxicas baseiam-se em murganhos C57 / BL6 anatomia. Recomenda-se que cada usuário inicialmente verificar a localização do curso de substância branca.

1. Branco Matéria curso de indução - Medial Abordagem angular

1. Comece a preparação de uma pipeta de vidro removido utilizando tubo capilar 0,5 milímetros de tal modo que o diâmetro distai é entre 15-25 uM ^11.
2. Prepara-se uma alíquota de 10 ul estéril de L-NIO (N (5) - de HCl (1) -iminoethyl-L-ornitina) a 27,4 mg / ml (130 ^ M) em solução salina normal a 0,9% estéril.
3. Pré-encher a pipeta de vidro puxadocom um pequeno volume de L-NIO (2-5 ul) por meio da fixação do pipeta de vidro para a tubagem ligada a uma linha de vácuo. Deite o pipeta sobre a bancada de trabalho e inserir a extremidade puxado para dentro da solução de L-Nio.
   1. Aplicar o vácuo até pelo menos 2 mm da porção de 0,5 mm da pipeta é preenchido. Desligue o vácuo e retirar a pipeta. Colocá-lo de lado até Passo 1,12.
4. Colocar o rato numa câmara de indução e induzir anestesia do rato utilizando isoflurano padrão de 32% fluiu através de um vaporizador (5 L / min inalado com 5 L / min de oxigénio e 0,5 L / min _{de N2)} durante 1 minuto ou até profundamente anestesiados. Transferir o rato a um aparelho de estereotaxia equipado com um microscópio estereotáxica. Proporcionar a manutenção da anestesia utilizando 32% de isoflurano fluiu através de um vaporizador (2 L / min inalado com 5 L / min de oxigénio e 0,5 L / min _{de N2)} e um cone de nariz. Verifique a profundidade da anestesia com uma pitada dedo do pé.
5. Ajustar o braço de injecção para 36 °.
6. AffiXA puxado titular pipeta de vidro para a extremidade distal de um sistema de injecção de baixa pressão de volume e anexar ao braço de injecção da configuração estereotáxica.
7. Brasão bigodes do animal anestesiado com vaselina e colocar pomada lágrima artificial sobre ambos os olhos. Prepare um campo cirúrgico estéril, colocando uma cortina estéril sobre a cabeça do animal com um 5-10 cm de abertura sobre a cabeça. Prepare uma superfície cirúrgica aspetic raspando o pêlo que cobre o crânio. Limpar o couro cabeludo com a alternância de betadine e 70% compressas com álcool.
8. Adicione uma 1,5 centímetros incisão na linha média do couro cabeludo com uma tesoura fina estéreis para expor a superfície do crânio. Seca-se o crânio com uma mecha de algodão estéril e usando um microscópio de ampliação estereotáxica em 1-3X, remover qualquer tecido periostal sobrejacente usando uma ferramenta de micro ponto de estéril.
9. Marcar o bregma como ponto de referência usando um marcador de ponta fina.
10. Perfurar uma craniotomia ellipitical 2 mm, utilizando uma fina broca cirúrgica stip estéril0; começando posteriormente ao bregma e estendendo anteriormente apenas à esquerda da linha média. Retirar os fragmentos de osso e tecido mole sobrejacente de modo que o córtex cerebral pode ser visualizado.
11. Manter o campo cirúrgico e superfície cortical úmida, aplicando de forma intermitente gotas de solução salina estéril.
12. Juntar uma pipeta de vidro puxado para o braço do injector do aparelho estereotáxico. Alinhar a extremidade distal da pipeta com a bregma e zero as coordenadas estereotáxicas.
13. Avançar a pipeta para o primeiro anterior / posterior (A / P) e medial / lateral (M / L) coordenadas fornecidas na Tabela 1.
14. Avançar a pipeta para a superfície cortical e zerar o ventral (A / V D) Medição dorsal /.
15. Lentamente passar a pipeta no cérebro até atingir o primeiro D / V de coordenadas na Tabela 1.
16. Usando um sistema de injecção de baixa pressão de volume ajustado a 20 psi durante 20 pulsos ms, injectar 100 nl de L-NIO no cérebro e esperar cinco minutos para evitar o refluxoa pista pipeta.
    1. Use um retículo calibrado na ocular do microscópio estereotáxica e uma ampliação de 3X.
    2. Por conseguinte, deslocar um total de 0.100 mm ³ (comprimento com 0,5 mm de diâmetro de uma pipeta de 0,5 mm, correspondendo a 100 nl) a partir da pipeta de vidro puxado para cada conjunto de coordenadas. Usando uma bolsa, medir e padronizar uma vez que cada configurar varia dependendo da ampliação e escalas usadas.
    3. Para a medição do volume precisas durante cada injecção, a abordagem da pipeta em ângulo com o microscópio do lado de modo que o menisco hidroaéreo tem uma vista sagital. O menisco deve aparecer no mesmo plano focal de tanto a parede interior e exterior da pipeta.
17. Lentamente, retirar a pipeta e repita os passos 1.13-1.16.3 no segundo e terceiro conjunto de coordenadas fornecidas na Tabela 1.
18. Após a injecção final, remover a pipeta e colocar cera de osso suficiente para encher o local craniotomia. UMApproximate as bordas da ferida couro cabeludo e ligam-se com adesivo dérmico.
19. Injectar 0,1 mL de 0,5% Marcaine nas margens da ferida, usando uma agulha 30 G estéril para evitar a prevenir a dor associada com o local de incisão no couro cabeludo.
20. Devolver o animal para habitação e abastecimento de pós-operatório de antibióticos (0,48 mg / ml sulfametoxazoltrimetoprim, ou 0,5 mg / ml levofloxacina) na água de beber durante 5 dias.

2. Branco Matéria curso de indução - Posterior Abordagem angular

1. Execute os passos 1,1-1,12 como no protocolo de abordagem em ângulo medial, exceto ajustar o braço para injeções da configuração estereotáxica a 45 graus orientados anterior para posterior.
2. Avançar a pipeta para o primeiro A / P e M / L coordenadas fornecidas na Tabela 2.
3. Conclua as etapas restantes 1.14-1.20 como no protocolo de abordagem em ângulo lateral.

3. neuronal retrógrada Labeling

1. Prepare uma estéril 10aliquota ul de L-NIO a 54,8 mg / ml em 0,9% de solução salina normal.
2. Prepara-se uma aliquota de 20% estéril Fluororuby (ou 20% de amina dextrano biotinilado ou 2% de Fluorogold) em 0,9% de solução salina normal.
3. Dilui-se em conjunto 1: 1, para concentrações finais de 27,4 mg / ml de L-NIO e 10% Fluororuby.
4. Execute o protocolo de acidente vascular cerebral como acima nas etapas 1.3-1.23.
5. Visualizar o marcador nativamente fluorescente na secção de tecido por meio da fixação de perfusão, cryosectioning e microscopia, como descrito anteriormente ^8.

4. Processamento de tecido por imunofluorescência

1. Em um intervalo pós-AVC apropriada variando de 3 horas a 14 dias após o acidente vascular cerebral, eutanásia ratos através de overdose isoflurano ou IACUC locais procedimento aprovado.
2. Abrir a cavidade torácica com uma tesoura em ângulo e inserir uma agulha G 23 borboleta para o ventrículo esquerdo.
3. Coloque um pequeno corte no átrio direito com uma tesoura fina para permitir uma via de saída para o fluido de perfusão.
4. Transcardialmente perfundir com 30-40 ml de solução salina tamponada com fosfato fria seguido de 30-40 ml de paraformaldeído a 4% frio, a uma taxa de 10 ml / min à temperatura ambiente.
5. Decapitar o mouse e remover o cérebro usando uma tesoura esterilizada para abrir o crânio posteriormente e em seguida, remover suavemente a caveira sobreposta com uma espátula, coloque o cérebro em frio PFA 4% durante 24 h, e depois transferir para 30% de sacarose em PBS durante 48 horas .
6. Prepare secções de quarenta micron flutuante usando um criostato e executa o processamento de anticorpo, tal como anteriormente descrito ^6-8. Neste estudo, utilizar os seguintes anticorpos: (: diluição 1 500); de coelho anti-neurofilamento 200 de coelho anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); de coelho anti-Iba-1 (1: 1,000).

5. Processamento de Tecidos para a proteína ou RNA Análise

1. Em um intervalo pós-AVC apropriada variando de 3 horas a 14 dias após o acidente vascular cerebral, eutanásia através de overdose isoflurano ou IACUC locais procedimento aprovado.
2. decapitar orato e remover o cérebro usando uma tesoura esterilizada para abrir o crânio posteriormente e em seguida, remover suavemente a caveira sobreposta com uma espátula.
3. Inserir uma espátula estéril 4 milímetros na parte frontal do cérebro para cortar o bolbo olfactivo e os nervos ópticos. Suavemente levantar o cérebro para fora da calvária e colocar em tampão de dissecção gelado (Solução Salina Equilibrada de 1x Hank, 25 mM de HEPES-KOH, pH 7,4, glicose 35 mM, bicarbonato de sódio 4 mM, e 0,01 mg / ml de ciclo-hexamida).
4. Usando um bloco cérebro e novas lâminas de barbear estéreis, prepare lajes 2-3 mm contendo o curso e colocar em buffer de dissecção fria.
5. Sob um microscópio de dissecação, identificar o assunto córtex motor subjacente branca no hemisfério injetado. Em intervalos mais longos de pós-acidente vascular cerebral, a região pode ser visualmente identificado por necrose focal e palidez mielina.
   Nota: Em intervalos pós-AVC anteriores, a injecção de L-NIO misturado com 1 ul de 10% Fast Green pode permitir a identificação visual do acidente vascular cerebral ( Figura 4A).
6. Sob a orientação de um microscópio de dissecação e utilizando uma nova bisturi, dissecar cuidadosamente a região da substância branca que contém o acidente vascular cerebral, identificado por qualquer rotulagem Verde Rápido ou perda de tecido. Remover córtex sobrejacente e subjacente estriado como desejado.

Usando o modelo apresentado, a matéria branca forelimb subjacente córtex sensório-motor confiável pode ser alvo. Este modelo de acidente vascular cerebral induzida quimicamente produz axonal focal e a perda de mielina, astrocitose e microgliose (Figura 1), como é tipicamente visto nos enfartes lacunares humanos. Usando três injeções, um modelo clinicamente útil é estabelecida com comprometimento precoce em tarefas motoras membro anterior ⁷ e uma pequena, mas significativa porção de experiências tecido cerebral isquemia, que imuno-histoquímica, imunofluorescência, e bioquímicos técnicas são viáveis ​​e confiáveis ​​em nível quantitativo. Em pontos de tempo iniciais (h) depois de indução de acidente vascular cerebral, as alterações na organização molecular axonal podem ser detectados (Figura 2). Aos 7 dias, o acidente vascular cerebral completa a sua maturação a uma área circunscrita da perda axonal (Figura 1a). Em nossas mãos, este método produz uma approxima lesão da substância branca focalmadamente 800 um de diâmetro horizontal e que se estende aproximadamente, 1 mm ao longo do eixo ântero-posterior do corpo caloso. Por 7 dias, o tamanho médio do enfarte total é de aproximadamente 0,200 ^mm3 e terá uma forma elíptica. Temos observado cerca de 10% de variabilidade no tamanho acidente vascular cerebral tanto entre os animais e entre as secções, dependendo de onde no elipse da secção ocorre. Ainda mais o crescimento no tamanho do infarto é raramente visto além de 7 dias.

A adição de uma injecção simultânea de dextrano em resultados de amina marcação neuronal significativa na camada 5 e 6 camada corpos celulares neuronais que possuem axónios que se projectam através da região de acidente vascular cerebral (Figura 3). neurónios corticais sobrejacente que não são danificadas pelos aspectos sham do procedimento (passagem de agulha fina), são submetidos a lesão axonal distal e pode ser identificado através da inclusão de um marcador com a preparação de L-NIO. Esta abordagem foi o uso d para demonstrar as alterações dinâmicas do segmento inicial do axônio após acidente vascular cerebral ^8.

Embora o pequeno tamanho da região de tecido afectado pelo acidente vascular cerebral limita a utilização de outras técnicas comuns, tais como o cloreto de (TTC) coloração de 2,3,5-trifeniltetrazólio, o acidente vascular cerebral região matéria branca pode ser identificada em tecido fresco. A adição de um corante comum tal como Fast Green produz uma região de identificação de tecido que podem ser dissecados sob um microscópio de dissecação (Figura 4). Depois de dissecados este tecido pode ser utilizado para análise de proteínas com western blot ou imunoprecipitação, ou para o isolamento de ARN e a análise (Figura 4C). Através da utilização de várias linhas de ratos transgénicos, uma variedade de abordagens inovadoras podem ser usadas para estudar a neurobiologia após acidente vascular cerebral focal de substância branca incluindo estudos de mapeamento de destino celular e microdissecação de captura laser (Figura 4C).

Figura 2:. Branco Matéria do curso Altera axonal Organização microdomínio Dentro de 3 horas da indução branco importa acidente vascular cerebral, organização microdomínio axonal no nó, marcado por espectrina beta-IV (vermelho) e no paranode, marcado por proteína associada a contactina (caspr, verde), é interrompido (setas, B). Contralateral axônios da substância branca mostrar nodal regular, paranodal e organização juxtaparanodal (A e C), enquanto a substância branca ipsilateral mostra alongamento nodal e paranodal que é típico dos axônios com contato axoglial perdeu (B e D). Barra de escala = 5 uM.

Figura 3: neuronal retrógrada Labeling com Branco Matéria do curso Identifica Individual neurônios com lesão axonal. Co-injecção de amina dextrano fluorescente (vermelho) no momento da indução de acidente vascular cerebral permite a identificação de neurônios individuais com axônios lesionados por acidente vascular cerebral. A maior parte da rotulagem ocorre em axônios dentro da camada 5 e 6 neurônios no córtex sensório-motoras primárias que recobrem o acidente vascular cerebral. Imagem representa 7 dias após o acidente vascular cerebral. Barra de escala = 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Microdissecção de lesões curso branco material protegido para uso em Biochemical e transcricionais ensaios de co-injecção de Fast Green, no momento da indução acidente vascular cerebral permite a identificação precoce da região feridas às 24 horas (A, painel superior). Immunoblotting para as proteínas específicas axonal pode ser realizada para demonstrar a redução da região de acidente vascular cerebral sozinho (A, painel inferior). Em pontos de tempo mais longos, a região de acidente vascular cerebral substância branca (painel da esquerda) pode ser focalmente dissecados sem marcação específica (B). Painel superior direito mostra a região da matéria branca após remoção da região dissecados enquanto o painel inferior direito mostra a região dissecados de matéria branca que contém o acidente vascular cerebral (B). PCR para genes específicos de oligodendrócitos utilizando ARN isolado a partir de regiões dissecadas a partir da matéria branca (C). IL = ipsilateral; CL = contralateral; c = controle; S = curso.

Tabela 1: coordenadas estereotáxicas para Approach angular lateral (em mm).

Tabela 2: coordenadas estereotáxicas para Approach angular Posterior (em mm).

Um número de modelos anteriores de acidente vascular cerebral subcorticais tenham sido descritos incluindo injecções focais de endotelina-1 para a cápsula interna, matéria branca subcortical e corpo estriado do rato ^{6,15 12-14} e rato. Modelos mais recentes de pequenos acidentes vasculares cerebrais focais têm utilizado a injeção microembolias colesterol na artéria carótida ¹⁶ e oclusão photothrombotic de um único arteríolas penetrantes ^17. Cada um destes modelos tem vantagens e desvantagens ^5. O modelo descrito presentemente produz uma lesão que tem uma série de características que imitam enfarte lacunar humano, incluindo anormalidades axonais e perda, degradação da mielina, um núcleo de necrose focal e um déficit clínico que é mínima e demonstra bastante rápida recuperação de dependentes de ⁷ anos ^de idade. Segmentação substância branca de murino permite uma grande variedade de manipulações genéticas que podem suportar estudos mecanicistas.

a críticapassos do protocolo incluir a utilização de coordenadas estereotáxicas precisos. Porque a substância branca murino é pequena em tamanho e varia de estirpe para estirpe, revisão das coordenadas estereotáxicas pode ser necessário, dependendo da idade e estirpe de ratinho utilizada. Controlo do volume da injecção, também é importante que este está directamente correlacionada com o tamanho do enfarte. injecções maiores produzem traços maiores que invadam córtex sobrejacente e striatum subjacente.

Focal da injecção de ET-1 utilizando a abordagem descrita aqui tem sido relatado mas endotelina-1 foi demonstrado que têm efeitos directos sobre parácrinos diferenciação e maturação dos oligodendrócitos ^10,18 confundindo o estudo de pós-AVC matéria branca biologia. Em contraste, os alvos de aproximação L-NIO células endoteliais sozinha enquanto produzindo uma lesão idêntica e elimina quaisquer efeitos parácrinos de confusão sobre as células envolvidas na resposta a uma lesão. L-NIO não é directamente citotóxico e a selecdose de Ted foi determinada por experiências preliminares de escalonamento de dose (dados não mostrados). A abordagem posterior angulada foi desenvolvido para mais precisamente axónios recortadas a partir do córtex motor primário produzir o défice comportamental máxima que pode ser atribuída a lesões da substância branca. A abordagem em ângulo medial também danos axônios do córtex motor, mas estende-se mais lateralmente e envolve os axônios subjacentes córtex sensorial primário.

A lesão acidente vascular cerebral expande muito rapidamente durante as primeiras 24 horas. Aos sete dias, o tamanho do enfarte é máxima e que não têm observado um crescimento significativo lesão para além desse período. eventos celulares adicionais e degeneração axonal irá ocorrer para além desta fase inicial, mas a dimensão do enfarte medida pelo núcleo necrótico não mudará significativamente na ausência de qualquer intervenção.

A co-injecção de marcadores neuroanatomical no momento do acidente vascular cerebral identifica neurónios que experimentam lesão axonal isquémica. Usando o medial ou posterior abordagem em ângulo, os corpos celulares neuronais com projeções axonal danificados permanecem incólumes. Isto cria um modelo útil para estudar o efeito de axotomia isquémica em neurónios do sistema nervoso central. Nós utilizamos marcadores principalmente retrógradas incluindo amina dextrano e Fluorogold, que ambos mostram excelente aceitação por parte dos axônios danificados tempos. Ao empregar a grande variedade de transgênicos e linhas de knock-out do mouse, os usuários deste protocolo pode investigar o papel específico de genes neuronais envolvidas na matéria curso branco resposta a uma lesão e reparação.

Nenhum

SN e MDD receberam apoio do NIH K08 NS083740 e do Departamento de Neurologia UCLA. AJG reconhece o apoio do Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Fundação de Pesquisa Médica e da L. Hillblom Fundação Larry. KLN agradece o apoio da Stroke Center American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS e STC foram apoiados pelo NIH R01 NS071481. JDH reconhece o apoio do NIH K08 NS083740.