Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

A citometria de fluxo foi explorado extensivamente em imunologia, hematologia e oncologia para definir populações de células através de dispersão propriedades intrínsecas, a expressão do antigénio da superfície celular, e outros parâmetros de fluorescência ^1-3. Os nossos insights sobre desenvolvimento linhagem de sangue e doença são o resultado de um significativo grau de refinamento contínuo desta metodologia após a sua implementação inicial ^{de 4,5.} O aumento da consciência do potencial analítico quantitativo e global de citometria de fluxo tem incentivado recentemente o seu uso mais difundido na pesquisa com células-tronco e pode permitir semelhante profunda progresso em um tempo mais curto ^6. No entanto, a aplicação da citometria de fluxo para analisar especificamente e isolar populações neuronais tem sido entendida como um desafio. Em contraste com as células hematopoiéticas que existem naturalmente em suspensão, os tipos de células neuronais são tipicamente colhidas de fontes excessivamente complexas que podem incluir células gliais e vários outras células circundantes, bem como uma intrincada rede de neurônios portadores de processo. Consequentemente, neurobiologia ainda tem que implementar a versatilidade de citometria de fluxo para o seu potencial completo em rotinas do cotidiano da pesquisa. No entanto, desde que uma única suspensão de células viáveis ​​podem ser gerados (e protocolos têm sido desenvolvidos e optimizados para esse fim ^7), citometria de fluxo e de células activadas por fluorescência (FACS) pode ser considerado um elemento valioso do repertório analítico em neurobiologia ^8-11.

. Figura 1. Princípio da análise de citometria de fluxo e componentes de um citômetro de fluxo Fluxo cytometers compreendem três sistemas principais: fluídicos, óptica e eletrônica. Um fluxo simplificado de células em suspensão (preparada a partir de tecido primário ou em cultura in vitro) é realizada pela bainha Fluid através de focagem hidrodinâmica, a limitação da amostra para o seu núcleo central. As peças ópticas são compostos de lasers que iluminam o fluxo de células e os filtros ópticos que encaminham o sinal para os detectores apropriados. Os sinais de luz detectados são convertidos em sinais eletrônicos, posteriormente processadas por um computador e visualizadas em um monitor para análise de dados e gating. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Usuários de métodos de citometria de fluxo de lucro de pelo menos um conhecimento básico dos fundamentos subjacentes, incluindo blocos de construção de um citómetro (para revisão ver ^12,13; também veja a Figura 1). Um feixe de raios laser intersecta com um fluxo de fluidos hidrodinamicamente focado que contém as células em suspensão, que por sua vez, passam através do feixe de laser em um ficheiro único "um após o outro. O Interceptino de uma célula (ou qualquer outra partícula, para esse efeito) com os resultados de laser na dispersão de luz a partir deste ponto de interrogação. Luz dispersada pode ser detectada na continuação da direcção de laser (dispersão frontal, associada ao tamanho da partícula), bem como perpendiculares à sua direcção (dispersão lateral; reflectindo a granulosidade da partícula / célula). Estas propriedades de dispersão acima mencionados não exigem rotulagem específica, razão pela qual uma amostra não marcado (ou também os restos celulares, bolhas de ar, etc.) gerará um sinal (evento) na dispersão para a frente bivariada e lado dispersão comumente usado para gating inicial. Ao utilizar os lasers e filtros específicos para os espectros de excitação e de emissão correspondente adequadas, uma célula pode ser analisada quanto a sua positividade, o nível de intensidade, ou na ausência de marcadores fluorescentes. A maioria das aplicações de citometria de fluxo têm-se centrado na caracterização através de antigénios da superfície celular. Ao contrário do lineag hematopoiéticase, a linhagem neural permaneceu menos extensivamente definido de acordo com a superfície de expressão epitopo padrões ^5. Uma vantagem de explorar os antigénios de superfície é que as células vivas podem ser submetidas a triagem celular paradigmas tais como FACS. Em contraste, a coloração do antigénio intracelular requer fixação e permeabilização passos para mediar a interacção epitopo-anticorpo, o que impede a jusante aplicações que exigem células viáveis. Digno de nota, tais abordagens ainda permitem inúmeros ensaios quantitativos ^14, bem como análises a jusante para RNA e proteína expressão ^15. Hematologia, imunologia e oncologia, muitas vezes utilizado mais de uma dúzia de marcadores em conjunto para definir determinadas subpopulações ^16. Além disso, citometria de massa ou CyTOF pode agora ser utilizado para analisar se a 30 parâmetros simultaneamente ^17,18.

Para aplicações de células-tronco neurais, bem como culturas primárias ^14,19,20 A heterogeneidade das célulasvitro é um fenômeno comum ^21-23. As células não representam a população alvo de interesse encarnar um fator potencialmente confusão para leitura experimental ^24,25. Convenientemente, os diferentes tipos celulares presentes dentro de uma suspensão celular heterogénea suportar perfis de expressão de antigénio distintas (conhecidas ou ainda a ser decifrados), que podem ser utilizados para definir estes diferentes populações. A citometria de fluxo pode, portanto, desempenhar um papel crucial na resolução de heterogeneidade celular e, assim, facilitar aplicações biomédicas (ensaios in vitro, de terapia celular) e otimizar a leitura quantitativa, concentrando-se no subconjunto mais relevantes ^24,26. Várias combinações de antigénios de superfície foram identificados nos últimos anos para permitir o isolamento e quantificação de tipos de células neuronais específicas. Isto inclui CD133 para o enriquecimento de células estaminais neurais ^27, uma combinação dos / CD24 / CD29 antigénios de superfície CD15 para o isolamento da NSC, Differentiated neurônio e células da crista neural ²⁸ ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 para isolar neural e subconjuntos gliais ^25, entre outras assinaturas ^29,30. Além neurônios, marcadores gliais incluem A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² e GLAST ^33. Uma publicação recente tem explorado o mesencéfalo marcador precursor floorplate CORIN ^34,35 para enriquecer precursores dopaminérgicos no transplante de células Parkinson paradigmas ^36. Moléculas de CD não são apenas marcadores, mas mediadores funcionalmente relevantes de interações célula-célula e da capacidade de uma célula para responder a estímulos a partir de moléculas de matriz extracelular e fatores de crescimento ^37. Uma estratégia de reforçar ainda mais o arsenal de antigénios CD combinatórias para caracterizar desenvolvimento da linhagem neural é a utilização de marcadores intracelulares conhecidos para rastrear e definir as combinações de antigénios CD para um tipo particular de célula de interesse. Nós exploramos recentemente essa abordagem e identificaram CD49F ^- / CD200 padrões de expressão combinatórias ^altas como uma nova abordagem para o enriquecimento de subconjuntos de neurônios de pluripotentes induzidas sistemas de cultura de células-tronco diferenciadas neurally ^38. Aqui, nós incluímos e discutir o último protocolo (e variações opcionais dos mesmos), em que a coloração da superfície e coloração intracelular pode ser utilizado simultaneamente para definir sub-populações de células neurais, por citometria de fluxo.

Figura 2. Diagrama do sistema de opções de protocolos experimentais. A figura ilustra uma representação esquemática dos principais passos envolvidos no protocolo. Passos opcionais (corante CFSE ou rotulagem antígeno intracelular) são indicados por caixas de cinza claro. Após a colheita, é essencial avaliar o número e a viabilidade de células de suspensões de células neuronais antes da coloração da superfície celular. Positivo comobem como os controlos negativos devem ser incluídos em adição às amostras de interesse. As amostras podem ser analisadas por análise de citometria de fluxo e / ou utilizadas em paradigmas de separação de células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora se tenha usado previamente anticorpos primários em combinação com anticorpo secundário por ³⁸ coloração intracelular, que agora introduzir a rotulagem não-covalente do anticorpo primário através de fragmentos Fab fluorescentes (rotulagem Zenon) como uma ligeira variação, reduzindo, assim, os passos de manipulação de células ^39. Além disso, como mais um exemplo da versatilidade do protocolo, que empregam uma etiquetagem opcional de um subconjunto experimental por carboxifluoresceína éster de succinimidilo (CFSE) antes da coloração de antigénio de superfície. Essa pré-rotulagem CFSE permite a comparação direta imediata de duas linhas celulares ou condições experimentais (CFSE marcado vs. sem rótulo) dentro de um único tubo de amostra, reduzindo variação ou diferenças sutis no tempo de incubação e de poupança de anticorpos. CFSE é um corante fluorescente estabelecido que é comumente usado para rastreamento de células ^40, na proliferação ^41,42 e barcoding experiências ^43,44. Finalmente, embora passos reais (FACS, de separação de células imunomagn�ica ou immunopanning) não fazem parte deste protocolo, em princípio, os procedimentos de colheita e de rotulagem descritos aqui fazer amostras de rendimento que podem ser submetidos a superfície antígeno ou aplicações de classificação baseada em rotulagem intracelulares ^{15 25,28.}

Com este artigo, pretendemos: resumir um protocolo de coloração antígeno de superfície viável ^25,28, resumir um protocolo para detecção de alvos intracelulares, bem como superfície combinada e análise do antígeno intracelular ^38, apresentar uma CFSE marcação com corante passo intracelular ^41,45 como um opção experimental para comanalisa comparativo de populações de células neurais, e resumir abordagens para análise de citometria de fluxo (controles apropriados ^13,46, gating estratégia e dados apresentação ^47).

1. Neural colheita celular

1. Avaliação por microscópio:
   1. Antes de iniciar um experimento, verificar o estado da cultura com brilhante-campo ou microscopia de contraste de fase.
      NOTA: Enquanto o tecido neural primário obtido a partir de dissecações é, em princípio, igualmente passível de análise por citometria de fluxo ^14,28, por favor, note que o foco do protocolo está em células obtidas de sistemas in vitro de células neurais.
2. Colheita de células ^7:
   1. Lavar suavemente o prato / frasco de células aderentes com Mg2 ⁺ / Ca2 ⁺ livre salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente (por exemplo, 5 ml para o frasco T75, 3 ml por poço de placa de 6 poços, ou 10 ml de prato de 10 cm).
      NOTA: O PBS usado durante todo o protocolo é Mg2 ⁺ / Ca2 ⁺ livre.
      1. Para o exemplo de vídeo, utilizar um frasco T75 de células de neuroblastoma SH-SY5Y em 80% de confluência. Aplicar etapas de lavagem suplementar nos casos emdetritos considerável está presente no prato.
      2. Considere ⁴⁸ lavagens com PBS, contendo albumina de Percoll, ou de centrifugação de Ficoll ⁴⁹ gradientes de soro e / ou grânulos comercialmente disponíveis ^50,51. A remoção da mielina e outros lípidos ou de outros contaminantes é crítica, especialmente quando as fontes de tecidos adultos primários estão a ser utilizados.
   2. Adicionar pré-aquecido (37 ° C) substituição de tripsina a um volume apropriado que cobre toda a superfície do recipiente de cultura de tecidos.
      NOTA: Como alternativa, considere Accutase ou outras opções de digestão enzimática. Este passo crítico pode afetar negativamente a expressão epitopo superfície (ver ^7).
   3. Incubar o prato / frasco a 37 ° C durante 2-5 minutos (dependendo do tipo de célula) para permitir que as células a separar. Bata levemente o vaso de cultura de tecidos ou flush com uma pipeta sorológica para desalojar as células. Evitar o excesso de digestão (pois isso pode causar a perda de células e coagulação em etapas posteriores).
   4. Quench a substituição da tripsina por adição de duas vezes o volume de tampão de fluxo (2% de FBS em PBS) e recolher as células num tubo de 15 ml.
   5. Triturar suavemente a suspensão de células utilizando uma pipeta de microlitro (100 - 1000 uL) ou uma pipeta de 5 ml serológico para preparar uma suspensão de célula única.
   6. Centrifuga-se as células a 220 xg durante 5 min a 25 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante deixando um pelete de trás.
   7. Re-suspender o sedimento num volume apropriado de tampão de fluxo, dependendo do tamanho da pastilha (por exemplo, para um frasco T75 confluente de células SH-SY5Y o rendimento típico é de pelo menos 10 x 10 ⁶ células, caso em que as células são ressuspensas em 5 ml de tampão de fluxo).
      NOTA: Se forem observados pedaços maiores ou coagulação, filtrar através de um 30 - malha 100 mm.
3. A contagem das células ^52:
   1. Transferir uma pequena alíquota da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga e diluir em uma proporção definida em um volume de trypan azul ou um corante de viabilidade alternativa antes da transferência para um hemocitômetro ou sistema de contagem de células automatizado.
   2. Dilui-se a suspensão de células para uma concentração de 1 x 10 ⁶ células viáveis ​​/ ml através da adição do volume apropriado de tampão de fluxo ou PBS com 0,1% de BSA (se prosseguir com a rotulagem CFSE).
      NOTA: iodeto de propídio, D-7 aminoactinomycin, anexina V e comercialmente disponíveis kits de ensaio viabilidade solucionáveis ​​representam opções alternativas, a fim de avaliar a viabilidade das células. Além disso, ensaios de apoptose caspase-3 utilizando a fluorescência como anteriormente descrito ⁵³ pode ser usado. Canais fluorescentes serão "ocupado" por estes reagentes que podem limitar as opções para passos subsequentes, se incluído em todas as amostras.

2. Corante intracelular Etiquetagem Usando CFSE (Figura 3)

1. Dilui-se a CFSE para uma concentração do material desejado que pode ser facilmente utilizado.
   NOTA: Para estas experiências a concentração de ações de0,01 mM foi usada. Determinar a concentração de trabalho ideal de CFSE empiricamente.
2. Adicionam-se 10 ul de uma solução 0,01 mM de CFSE por ml de células (Secção 1.3.2, concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml em PBS + BSA a 0,1%) para uma concentração final de 0,1 uM. Resumidamente vortex para misturar bem.
   NOTA: As concentrações de CFSE usados ​​aqui são cerca de dez vezes menor do que os normalmente aplicados em ensaios de proliferação, por conseguinte, a toxicidade celular do corante é mínima. Não observamos efeitos negativos sobre a viabilidade celular.
3. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente com agitação constante (200 rpm). Proteger da luz.
4. Extingue-se o corante por adição de 5 volumes de tampão de fluxo para os tubos. Centrifuga-se a 94 x g durante 5 min à TA.
5. Descartar o sobrenadante deixando um pelete de trás. Re-suspender as células com 5 volumes de tampão de fluxo.
6. Centrifuga-se a 94 x g durante 5 min à TA. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml.
7. Adicionar um número igual de células não coradas de interesse para a suspensão de células coradas. Proceder à tona protocolo de coloração antígeno (Seção 3).

Figura 3. Detecção de expressão diferencial entre o antigénio de superfície CD duas linhas de células por células SH-SY5Y neuroblastoma CFSE corante rotulagem. São pré-marcado com CFSE, para posterior identificação em comparação com fibroblastos BJ não marcados. Co-coloração da amostra mista (painéis à direita) com marcadores de superfície CD24 ou CD54 (ambos conjugados com APC) demonstra que as linhas celulares são facilmente distinguíveis devido à coloração CFSE (Setas = SH-SY5Y; setas = fibroblastos BJ). A maioria das células SH-SY5Y expressam CD24, mas não CD54 (ICAM-1). Em contraste, os fibroblastos BJ (CFSE-negativo) são positivas para CD54, mas amplamente negativo para CD24.Target "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. celular coloração da superfície

1. Etiqueta de tubos, incluindo amostras e controlos críticos (ver Tabela 1).

Tabela 1. L ist de tubos para ser incluído em um fluxo típico citometria experimento. A tabela mostra um conjunto mínimo de tubos de amostra necessários para uma experiência de co-coloração descrito neste artigo de vídeo. Um experimento ideal deve incluir todos os controles necessários (e positivas, bem como controles negativos de compensação) para a interpretação precisa dos resultados obtidos.

2. Adicionar 100 ul de suspensão de células (a partir da Secção 2.7 ou 1.3.2) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Certifique-se de um mínimo de 0,1 x 10 ⁶ células estão presentes por 100 mL de suspensão de células.
3. Adicionar fluoróforo anticorpo conjugado com a amostra a uma diluição adequada.
   NOTA: Determinar a diluição de trabalho de cada um dos anticorpos, antes da experiência. Ver Tabela 2 para uma lista of antigénios de superfície neurais.

Tabela 2. Selecção de antigénios de superfície neurais. Esta tabela fornece uma lista de epítopos de superfície que se verificou ser expresso por diversos tipos de células neurais para exemplificar o aumento painel de antigénios de superfície utilizados para caracterizar a linhagem neural. Note-se que esta selecção está longe de ser completa e que a maioria destes marcadores são também expressos por uma variedade de outras células neurais e não neurais. Por conseguinte, as combinações de vários marcadores será necessária para melhor definir e isolar os subconjuntos neurais indicados.

4. Incubar durante 30 min num agitador orbital (200 rpm) no escuro.
5. Tampão de lavagem de fluxo
   1. Adicionar 1 ml de tampão de fluxo para os tubos. Centrifugar a 380 g durante 4 min a 4 ° C.
   2. Descartar o sobrenadante deixando um pelete de trás.
6. Repita o passo de lavagem de novo.
7. Após a segunda lavagem, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo para um volume final de 100 ul.
8. Use amostra para análise de citometria de fluxo. Como alternativa, proceder com a Seção 4 e 5.
   NOTA: Se as células estão a ser classificado e colocado de volta na cultura pós-FACS (ou seja, a suspensão de células viáveis ​​sem fixação ou permeabilização), aplicar técnicas de assepsia durante a colheita, a coloração e as etapas de análise.

4. Fixação e permeabilização ³⁸

1. Fixação com paraformaldeído (PFA):
   1. Preparar tampão de fixação contendo 2% de PFA em PBS.
      NOTA: PFA é prejudicial aos seres humanos e ao meio ambiente. Usar equipamento de protecção individual adequado e descarte de resíduos, de acordo com os regulamentos locais.
   2. Adicionar 500 ul de tampão de fixação de 100 ul de suspensão de células.
   3. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador orbital (100 rpm) no escuro.
2. PBS lavagem:
   1. Adicionar 1 ml de PBS ao tubo. Centrifuga-se a 380 xg durante 3 min a 4 ° C.
   2. Descartar / decanta-se o sobrenadante deixando aproximadamente 100 ul do tubo.
3. Permeabilização com Tween-20:
   1. Preparar tampão de permeabilização que contém 0,7% de Tween-20 em PBS.
   2. Adicionar 500 ul de tampão de permeabilização de 100 ul de suspensão de células.
   3. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador orbital (100 rpm) no escuro.
4. Lavar as células uma vez com PBS (como descrito na Secção 4.2) e remover o sobrenadante do co tubosmpletely, deixando apenas o sedimento atrás.

5. Coloração Intracelular Antigen ³⁸ (Figura 4)

1. Preparação das soluções de anticorpos primários:
   1. Dilui-se os anticorpos primários em tampão de diluição contendo 1% de albumina de soro bovino, 10% de soro (por exemplo, burro ou soro de cabra normal) e 0,5% de Tween-20 em PBS.
      NOTA: Escolha o soro a ser utilizado, dependendo da espécie os anticorpos secundários foram levantados no.
   2. Alternativamente, usar Zenon rotulagem de fluoresceína o anticorpo primário de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Prepare 1 jig de anticorpo primário em PBS a uma diluição adequada (volume total ≤ 20 ul).
      2. Adiciona-se 5 ul de reagente de marcação Zenon fluoresceína IgG (Componente A) à solução de anticorpo.
      3. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
      4. Adiciona-se 5 ul de reagente de bloqueio Zenon (Componente B) à mistura de reacção.
      5. Incubara mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aplicar o anticorpo com a amostra em 30 min.
2. Coloração de anticorpo primário:
   1. Adicionar 100 ul da solução de anticorpo primário para a pelete de células e tritura-se suavemente para misturar.
   2. Alternativamente, adicionar Zenon anticorpo marcado com fluoresceína para a suspensão de células na diluição apropriada.
   3. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 30 min num agitador orbital (200 rpm), protegida da luz. Lavar as células uma vez com PBS (como descreve na Secção 4.2) e remover o sobrenadante dos tubos completamente, deixando apenas o sedimento atrás.
3. Coloração do anticorpo secundário (não necessária para os anticorpos Zenon fluoresceína marcados):
   1. Dilui-se os anticorpos secundários em PBS a uma concentração apropriada.
   2. Adicionar 100 ul da solução de anticorpo secundário para a pelete de células e tritura-se suavemente para misturar. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 30 min num agitador (200 rpm) no escuro.
4. Lavam-se as amostras duas vezes com PBS (como descrito na Secção 4.2).
5. Lavar uma vez com tampão de fluxo (ver secção 3.5).
6. Re-suspender as células em cerca de 150 ul de tampão de fluxo e analisar no citómetro de fluxo.

Figura 4. Co-coloração de superfície e proteínas intracelulares. A citometria de fluxo de dados exemplifica uma comparação entre baseada em anticorpo primário + secundário contra a coloração intracelular com base em fluoresceína Zenon em combinação com coloração de superfície. Positividade exclusiva no eixo y (quadrante superior esquerdo) e o eixo x (quadrante inferior direito) mostra células coradas para MAP2 e CD24, respectivamente. Após co-coloração, MAP2 partilhada e expressão de CD24 pode ser visto no quadrante superior direito (painéis da direita). Comparação do usoAlexa Fluor 488. (Top; AF488) versus Zenon fluoresceína (em baixo) para os rendimentos de rotulagem MAP2 resultados semelhantes por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Fluxo de análise de citometria

1. Realizar uma análise de citometria de fluxo, imediatamente após a conclusão do protocolo de coloração utilizando um citómetro de fluxo com filtros adequados para a detecção de sinal. Use 488 nm laser vermelho nm azul e 640 com FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), e filtros FL-4 (675/25) de banda.
2. Configure portas primárias com base na dispersão frontal e lateral excluindo detritos e células mortas.
3. Definir portões fluorescência para superfície e antígeno intracelular para ≤0.5% com base nas amostras não coradas e indemnizações por sobreposição espectral usando controles manchadas de solteiro.

O protocolo aqui apresentado permite abordagens para versátil experimentais (Figura 2). Na sua versão mais curta (passos 1, 3 e 6), ele pode ser considerado como um guia para a coloração simples de antigénios de superfície. Na sua forma mais complexa, um número de paradigmas de co-marcação com uma gama de antigénios intracelulares pode ser prosseguido passos opcionais (2 e / ou 4 a 5). Além disso, o passo CFSE-rotulagem exemplifica a sua utilidade para a célula rotulagem / rastreamento de subpopulações em estudos de interação célula-célula ou fluxo experimentos de citometria de barcoding (passo 2). Populações de células viáveis ​​(obtidas a partir das etapas 2 e / ou 3) são propícios para a célula paradigmas (FACS) e análise a jusante, incluindo cultura de células pós-tipo. Por outro lado, a superfície de antigénio intracelular e coradas (passos 3 a 5)oferece oportunidades de leitura analítica em seu próprio direito. Por exemplo, a identificação de co-localização de determinados antigénios CD em subconjuntos particulares de populações de células neurais (por nós aplicados em Turaç et al ³⁸ para identificar CD49f ^-. / CD200 ^elevados assinaturas para neuronal FACS). Estes e outros exemplos de marcadores neurais são fornecidos na Tabela 2, dos quais CD15, CD29, CD49f e FORSE1, estão principalmente associadas com células estaminais neuronais, e CD24 e CD56 são abundantes nas células neuronais. Embora alguns destes marcadores são exclusivos, diferentes intensidades de coloração e análise multivariada expressão pode ajudar a identificar conjuntos de marcadores específicos para análise e isolamento de subpopulações neuronais específicas.

A Figura 3 ilustra os resultados típicos obtidos a partir do uso combinatória de corante intracelular e a coloração da superfície. Os dados mostram como duas populações celulares distintas podem ser facilmente distinguidos ind misturado amostra devido à marcação prévia de uma das populações. Aqui, as células de neuroblastoma SH-SY5Y foram marcadas com CFSE, e exibem fluorescência no canal verde (FL1; eixo y) que é claramente distinto da segunda população não corado, neste caso fibroblastos BJ. Enquanto fibroblastos característica bem estabelecida (CD54) e neuronais (CD24) marcadores são mostradas (presente em suas respectivas populações-alvo; FL2 ou fluorescência FL4, respectivamente; eixo x) abordagens análogas pode ser explorada para o rastreio de antigénios adicionais não identificados. Além disso, os efeitos das interacções célula-célula de dois (ou mais) que as subpopulações foram marcadas anteriores experiências de co-cultura pode ser estudado dessa forma.

A Figura 4 mostra que as células não coradas SH-SY5Y, bem como amostras coradas para CD24-APC e / ou o antigénio MAP2 neuronal intracelular (canal FITC), após fixação e permeabilização. Quanto a este último pode afetar as propriedades de dispersão, bafluorescência ckground e coloração epitopo superfície, as parcelas servir para documentar a expressão de superfície mantida de CD24 neural após a coloração intracelular. Além disso, a co-localização de coloração MAP2 neuronal na fracção de CD24-positivo é mostrado. É crítico para assegurar a detecção fiel do antigénio de superfície em comparação com a expressão de superfície de CD24 em células vivas. Além disso a especificidade da detecção intracelular sobre o fundo, a ligação não específica de anticorpos e autofluorescência necessita de ser confirmado. Detecção de antígenos intracelulares através de estratégias baseadas em anticorpos secundários primário + baseados em fluorescência Zenon ou produz resultados comparáveis, o que fornece uma base racional para considerar esta abordagem eficiente em termos de tempo mais (pulando o passo 5.3). Enquanto que o protocolo é robusta e permite a detecção combinada de uma gama de marcadores de superfície e intracelulares, com limitado a fluorescência de fundo, recomenda-se a aderir estreitamente com os tempos de incubação e as etapas de lavagemfornecida no protocolo. Além disso, é aconselhável a analisar, pelo menos, três repetições experimentais independentes e notar que a intensidade da marcação e superfície estabilidade epitopo pode ser específica do marcador e pode exigir uma maior optimização. Uma vez estabelecido para um alvo particular, apesar da falta de capacidade de analisar as características morfológicas, o fluxo de detecção de citometria de superfície e antígenos intracelulares ou antígenos intracelulares por si só é compatível com a microscopia de fluorescência convencional.

O protocolo aqui apresentado é bem estabelecido para as culturas de células neurais derivadas de células estaminais humanas, mas pode ser igualmente aplicado a outras fontes de células neurais, incluindo tecido primário ou linhas de células neuronais. Para além das fontes embrionárias, células estaminais ou progenitoras neurais pode ser extraído a partir das regiões do cérebro adulto neurogénicos ^27. Além disso, a citometria de fluxo e FACS pode ser explorada para quantificar, analisar e isolar várias populações de células, incluindo neurónios maduros ^{54, 33,} astroglial microglial ^55, oligodendrócitos, ⁵⁶ ou ⁵⁷ células endoteliais de tecido cerebral pós-natal.

Independentemente da fonte, as condições óptimas para a fixação e permeabilização necessitam de ser determinado para cada tipo de célula experimentalmente, como excesso de qualquer um dos passos pode levar a uma grande mudança de propriedades de dispersão que afectam a citometria de fluxo de leitura. Eficiência do protocolo também depende da STABILdade das moléculas de superfície postar permeabilização. Deve notar-se que os diferentes epitopos de superfície pode ser afectada pela manipulação de células como parte do procedimento para vários graus. Também colheita de substituição enzimática com tripsina ou Liberase-1, por exemplo, podem afectar uma variedade de epítopos de superfície celular, mas a um grau menor em comparação com o uso de Accutase ou papaína ^7.

Epítopos específicos podem ser afectadas por um mesmo paradigma de tratamento para um grau variável: enquanto que a VCAM-1 (vascular de adesão celular da proteína-1; CD106) pode ser afectada pela colheita, dissociação, fixação e permeabilização de uma maneira muito sensível, ICAM-1 ( intercelular Molécula 1 de Adesão; CD54) pode exibir um padrão de expressão mais robusta preservado durante todo o procedimento ^58.

Enquanto anteriormente qualquer superfície ^25,28 ou rotulagem antígeno intracelular ¹⁴ foram aplicadas em paradigmas neurobiologia, abordagens combinando mÉTODOS ³⁸ pode render novos superficiais neural antígenos candidatos e fornecer opções de citometria de leitura adicionais.

Rotineiramente realizar a coloração passo superfície antes da coloração antígeno intracelular e ter usado essa estratégia para expandir o nosso conjunto de marcadores de superfície para neuropoiesis ³⁸ usando uma variedade de linhas de células neurais. A titulação de anticorpos e os tempos de incubação terá de ser optimizada para os respectivos tipos de células, e os epítopos alvo paradigma experimental. Da mesma forma, a concentração de CFSE e a quantidade de células utilizadas por coloração deve ser optimizada para cada linha de células, pois nem todas as linhas de células coram de forma idêntica com a mesma quantidade de concentração de CFSE.

CFSE tem uma excitação de pico de 494 nm e emissão de pico de 521 nm (canal verde; FL-1 detector), portanto, qualquer spillover fluorescência para outros canais precisa ser compensada para determinar emissão de fluorescência específica. Corantes alternativas, como Cell Traço Violet (CTV), Cell Proliferação Dye eFluor 670 (CPD), Horizon V550, V450 Horizon tem sido experimentado e testado para ser usado em vez de CFSE ^59,60 com sucesso.

Em citometria de fluxo, que é fundamental para determinar o sinal de fluorescência específico real de fundo. Por conseguinte, os controlos mais adequados têm de ser cuidadosamente escolhido, e pode incluir o uso de uma linha de células não neurais ou de outra forma negativa para sublinhar a especificidade do anticorpo (os chamados controlos negativos internos ^38,46). A autofluorescência de cada fonte de células deve ser tida em conta. Controles isotipo pode ser considerada em grande parte dispensável na detecção de células mais neural paradigmas ^13,46.

Dada a considerável variação observada em sistemas de cultura de células (particularmente os que são derivados a partir de células-tronco) e do processo de coloração, a inclusão de réplicas biológicas é fortemente recomendado. Deve notar-se que o uso de repórteres genéticos é umoutra maneira de usar o fluxo neural citometria ^61,62. Recentemente, Maroof et al. Utilizou uma abordagem repórter Nkx2.1-GFP para classificar as subpopulações neuronais cortical-como distintas a partir de células-tronco embrionárias humanas ^63.

Um campo de up-and-coming é representada pela exploração de exossomos neurais em áreas biomédicas tão diversas como a biologia do tumor e neurodegeneração ^64, e citometria de fluxo de exossomos ou seu isolamento por ensaios baseados em talão fornece ferramentas importantes para esta missão ^65. Para o protocolo de vídeo relacionada ver ^66.

The authors declare no potential conflicts of interest.

Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).