Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo.

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento e rebrota dos neurônios olfativos primários. Com efeito, o sistema olfactivo principal é caracterizado pela sua capacidade de dar origem a novos neurónios, mesmo em animais adultos. Esta capacidade particular, é, em parte, devido à presença de OECs que criam um microambiente favorável neurogenesis. Esta propriedade de OECs foi utilizado para transplantação celular, tal como nos modelos de lesão da espinal-medula. Embora o sistema nervoso periférico tem uma maior capacidade de regeneração após lesão nervosa do que o sistema nervoso central, seções completas induzir misrouting durante rebrota axonal em particular após facial da secção do nervo laríngeo. Especificamente, o corte total do nervo laríngeo recorrente (NLR) induz rebrota axonal aberrante resultando em sincinesias das cordas vocais. Neste modelo específico, nós mostramos que o transplante OECs aumenta eficiência axonal rebrota. ve_content "> OECs são constituídas de várias subpopulações presentes tanto na mucosa olfactiva (OM-OECO) e os bulbos olfativos (OB-OECO). Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização destas diferentes subpopulações de OECs numa modelo de lesão do NLR. Usando este paradigma, culturas primárias de OB-OECs e OM-OECs foram transplantadas em Matrigel após secção e anastomose do NLR. Dois meses após a cirurgia, foi avaliada animais transplantados por análises complementares com base na videolaringoscopia, eletromiografia (EMG) e estudos histológicos. Primeiro, videolaringoscopia nos permitiu avaliar as funções laríngeas, em particular co-contrações musculares fenômenos. Então, EMG analisa riqueza demonstrada e sincronização de atividades musculares. Finalmente, estudos histológicos com base em azul de toluidina permitiu a quantificação do número e perfil de fibras mielinizadas.

Todos juntos, vamos descrever aqui como isolar, cultura, identify e transplante OECs da OM e OB após NLR seção-anastomose e como avaliar e analisar a eficiência dessas células transplantadas sobre as funções de rebrota e laringe axonal.

O sistema olfactivo principal é composto de duas partes distintas: a mucosa olfactiva (OM) no sistema nervoso periférico e o bolbo olfactivo (OB), no sistema nervoso central. O sistema olfactivo principal é caracterizado pela capacidade de os neurónios olfactivos primárias (PON) para a auto-renovação ao longo da vida em espécies de mamíferos. Esta capacidade torna-se possível devido à presença de células estaminais neurais na OM. PON crescimento e rebrota da OM para OB é facilitada pelas células gliais especializadas chamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs são células da crista neural que criam um microambiente favorável para a neurogênese do PON da OM para OB ^1. Deste modo, OECs pode ser encontrada na MO e no OB constituindo diferentes subpopulações de células de ^2,3. As diferentes propriedades de OECs os cientistas levam a usá-los para transplantes celulares em vários paradigmas de lesão do sistema nervoso ^4. De fato, OECO fatores de crescimento produção, reduzir a cicatrização glial, prrebrota axonal Omote, e pode se misturam livremente com os astrócitos ^5,6. No entanto, a grande maioria destes estudos são baseados em lesão medular (LM); alguns deles usaram OECs após lesão do nervo periférico (PNI) ^7,8.

Embora o sistema nervoso periférico tem uma grande capacidade de regeneração após a lesão do nervo, seções completas induzir aberrante rebrota axonal. De fato, após transecções completas do facial ou dos nervos recorrentes (NLR) axônios misrouted causar co-contrações musculares chamados sincinesias. Por isso, é de primordial importância para propor um modelo de PNI, não só para quantificar rebrota axonal, mas também para avaliar a eficiência das contrações musculares. Na literatura o modelo mais comum descrito é baseado em ^9,10 lesão do nervo facial. Neste modelo, a uma avaliação funcional baseiam-se na recuperação de movimentos whisker ^10. No entanto, é complicado para demonstrar a eficiência do movements e discriminar os fenômenos co-contrações musculares. Propomos aqui um modelo baseado em uma lesão do NLR. Este modelo permite avaliar não só a rebrota axonal e movimentos das cordas vocais, mas também a eficiência e funcionalidade desses movimentos após transplantes celulares ^11,12. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo para a cultura e transplante OECs do OM e OB em um modelo de seção NLR / anastomose e avaliar os animais após a cirurgia.

1. Culturas primárias de Mucosa olfativa e olfativo Lâmpadas

1. Antes de dissecção
   1. Adicione médio, para 50 ml, por adição de 44 ml de livre de cálcio de Dulbecco Modificado de Eagle / meio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado com 5 ml de soro fetal de bovino (FBS) e 1 ml de penicilina / estreptomicina.
   2. Bata de 75 centímetros ² frascos com poli-L-lisina (50 ug / ml, 1,5 ug / cm ^2), 1 h à temperatura ambiente.
   3. Lavar frascos com PBS 1x.
   4. Armazene os frascos revestidos na geladeira por até 1 semana.
2. Dissecação
   1. Qualquer método de eutanásia deve ser previamente aprovado pelo cuidado com os animais e uso comitê da instituição e realizado por pessoal qualificado.
   2. Escolha ratos endogâmicos, como ratos Fischer.
   3. Depois que o rato foi confirmado ter entrado anestesia profunda com pentobarbital de sódio ou outras formas injectáveis ​​de anestesia, como cetamina / xilazina, decapitá-lo e remova a pele.
   4. Abra o crânio do anterior para a parte posterior.
   5. Retire o OB tendo o cuidado de evitar as meninges.
   6. No mesmo rato, abrir o sagittaly cavidade nasal.
   7. Remover o OM tendo o cuidado de evitar a mucosa respiratória. Note-se que o epitélio OM pode ser facilmente identificadas pela sua cor amarelada.
   8. Protocolos adicionais detalhadas sobre a dissecção da OM pode ser encontrar em um anterior J. Vis. Exp . publicação ^13.
3. Cultura
   1. Coloque OB em solução tamponada de sal de Hank (HBSS) contendo tripsina a 0,1% durante 45 min a 37 ° C.
   2. Coloque OM em HBSS contendo 0,05% de colagenase A durante 45 min a 37 ° C.
   3. Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de meio morno.
   4. Lavar as células com meio e centrifuga-los a 300 xg durante 3 min.
   5. Triturar amostras de 2ml de meio com uma pipeta P1000 até obter uma suspensão homogénea de células é obtido.
   6. Placa as células em frascos pré-revestidas (5-10 x 10 ⁶ células / frasco) com 25 ml de meio morno.
   7. Incubar e cultura das células a 37 ° C com 5% de CO _2.
   8. Mude metade da média a cada 2 dias.
   9. Após 6-8 dias in vitro, verificar a proporção de células positivas para p75 em amostras de células pequenas, assumido ser OECs em roedores, por citometria de fluxo ou por imunocitoquímica. Para estas análises, outros marcadores podem ser estudados como GFAP e S100β.
4. A citometria de fluxo análise
   1. Coletar as células como descrito em (2.2) "O transplante celular".
   2. Incubar com o anticorpo primário p75 (1:100) durante 15 min a 4 ° C.
   3. Lavar as células com 2 ml de PBS-EDTA e centrífuga-los a 300 xg durante 3 min.
   4. Incubar as células com PE de anticorpo anti-ratinho conjugado secundário durante 15min a 4 ° C no escuro (1:200).
   5. Lavar as células com 2 ml de PBS-EDTA e centrífuga-los a 300 xg durante 3 min.
   6. Ressuspender as células em 500 ul de PBS-EDTA.
   7. Analise 10-30 x 10 células com ^3-citómetro de fluxo.
5. Análise imunocitoquímica
   1. Placa as células em placas de 6 poços pré-revestidas durante 48 horas, tal como descrito em "cultura" (secção 1.1.2).
   2. Lavar as células com PBS.
   3. Fixar as células com PFA a 4% durante 15 min à temperatura ambiente.
   4. Lavar as células com PBS.
   5. Incubar as células com PBS / Triton X100 (0,1%) durante 15 min à temperatura ambiente.
   6. Lavar as células com PBS.
   7. Incubar as células com os anticorpos primários (1:200): p75, S100β e GFAP durante a noite a 4 ° C.
   8. Lavar as células com PBS.
   9. Incubar as células com os anticorpos secundários (1:500) durante 1 hora à temperatura ambiente na escuridão.
   10. Lavar as células com PBS.
   11. Incubar as células com Hoechst 10 min a IT na escuridão.
   12. Lavar as células com PBS.
   13. Analisar as células utilizando um microscópio de fluorescência.
6. Células de rotulagem GFP
   1. Cinco dias antes do transplante, infectar OB e OM culturas durante a noite com vetor lentivírus abrigar reforçada GFP (multiplicidade de infecção: 20).
   2. Antes de verificação transplante em pequenas amostras, a taxa de células GFP positivas por citometria de fluxo, como descrito anteriormente em "cultura" (seção 1.1).

2. Cirurgia e Transplante

1. Anastomose do nervo recorrente
   1. Todos os experimentos com animais devem ser previamente aprovados pelo cuidado com os animais e uso comitê da instituição e realizado por pessoal qualificado.
   2. Antes da cirurgia autoclave todos os instrumentos e manter a esterilidade durante os procedimentos cirúrgicos.
   3. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de cloridrato de cetamina (12,5 mg / kg) e cloridrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Avaliar a adequação da anestesia por toe pitada antes da cirurgia.
   4. Coloque o rato em decúbito dorsal.
   5. Realizar de 2 cm verticais incisão cutânea cervical médio com um bisturi.
   6. Uma incisão vertical dos músculos infra-hióideos seguindo a linha branca medial.
   7. Expor laringe usando afastador autostático entre os músculos infra-hióideos.
   8. Exponha o NLR.
   9. Sob o controlo microscópico, cortar o nervo totalmente com microtesouras ao nível do sétimo anel traqueal.
   10. Realize anastomose usando um ponto de 11,0 sutura sob controle microscópico. Esta operação conduz a uma desnervação motor específico da laringe.
2. Transplante celular
   1. Imediatamente antes do transplante, remover as células dos pratos utilizando tripsina a 0,05% de EDTA durante 5 minutos a 37 ° C.
   2. Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de meio morno.
   3. Centrifugar a 300 xg durante 3 min.
   4. Sob um microscópio de contar as células utilizando um hemocitómetro, e ajustar a concentração celular de acordo com o protocolo específico. Neste modelo, as concentrações desejadas foram entre 1,2-6 x 10 ⁶ células em 30 mL de DMEM/F12.
   5. Faça preparação celular com 1:02 mix (30 e 60 mL deste experimento) de DMEM/F12-Matrige l em 1,5 ml do tubo antes de enxertia e colocá-lo no gelo. Para evitar efeitos não específicos, use o fator de crescimento reduzida Matrigel.
   6. Pouco antes de o transplante de segurar o tubo na mão por alguns segundos para aquecer a mistura Matrigel-médio.
   7. Depor o mix no local da anastomose com uma pipeta e espere até que a mistura auto-monta no nervo lesado.
   8. Feche os músculos ea pele com uma sutura 4.0.
   9. Casa dos ratos individualmente e manter sob uma lâmpada de aquecimento para 24 horas.

3. Avaliação

1. A laringoscopia
   1. Anestesiar ratos por intraperitoneal injecção de cloridrato de cetamina (12,5 mg / kg) e cloridrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Confirmam os ratos são anestesiados com uma pitada do dedo do pé, antes de prosseguir com o protocolo.
   2. Coloque o rato em decúbito dorsal.
   3. Insira um 30 ° videolaryngoscope ajustados para proporcionar a melhor visão da laringe. Determine marcos anatômicos para reproduzir o mesmo ponto de vista de cada gravação.
   4. Grave os movimentos das cordas vocais usando o videolaryngoscope (5-10 seqüências / animal). Para cada animal selecionar três seqüências de sucessivas adução e abdução máxima máxima.
   5. Analisar a função da laringe usando o software de análise de imagem. Determine movimento angular absoluta medindo a diferença entre o movimento de abdução máxima e adução máxima das cordas vocais. Determine pontuação dinâmica pela medição da amplitude de movimento. Determine escore funcional medindo a sincinesias e movimentos paradoxais.
2. A eletromiografia (EMG)
   1. Coloque um eletrodo para os músculos isquiotibiais do rato para o isolamento elétrico.
   2. Expor laringe e traquéia, abrindo a pele e músculos, como descrito anteriormente em "anastomose do nervo recorrente" (seção 2.1).
   3. Expor a cartilagem cricothyroid.
   4. Abra a cartilagem cricothyroid para expor o músculo posterior cricoaritenoideo (PCA) com microtesoura.
   5. Introduzir um eletrodo de agulha monopolar (38 x 0,45 mm) no músculo PCA.
   6. Registre a atividade muscular elétrica do músculo PCA através de um sistema de aquisição durante a ventilação espontânea.
   7. Analisar a atividade muscular em termos de riqueza e sincronização com a respiração. Analisar EMGs, atribuir uma pontuação qualitativa 0-3 utilizando a seguinte escala: 0: rastreamento sem rima, sem aumento durante a inspiração, 1: rimado rastreamento com inspiratória aumentando, mas o rastreamento de pobre (neurogen), 2: rimado rastreamento com atividade mais rica, 3: rimado rastreamento, muito rico, constituindo uma ipadrão nterference, semelhante a uma actividade máxima intencional.
   8. Exponha o nervo vago para medir a duração de latência e potencial. O nervo vago é escolhido como o sítio de estimulação porque NLR pode ser danificada durante a estimulação, devido ao seu pequeno tamanho.
   9. Estimular o nervo vago com um eletrodo.
   10. Anote os sinais elétricos no músculo PCA. Medir a latência e duração do potencial. Se possível utilizar um módulo de aquisição para gravar a atividade muscular, latência e duração do potencial como sistema Powerlab.
3. Histologia
   1. Eutanásia do animal com overdose de pentobarbital.
   2. Retire o coto distal do NLR sob controle microscópico. A parte distal do NLR é definida como a parte entre anastomose e da laringe. Note-se que é possível encontrar o local da anastomose várias semanas após a cirurgia, pois a sutura é uma sutura de 11,0 não absorvível.
   3. Coloque a porção distal do NLR em glutaraldeído 2% com fosfato 0,1 M(PH = 7,3) durante 2 horas a 4 ° C.
   4. Orientar cuidadosamente as amostras para realizar cortes coronais.
   5. Lavar as amostras em tampão de fosfato.
   6. Cortadas em segmentos mais pequenos (3-4 mm de comprimento) e sufixo durante 60 minutos à temperatura ambiente em 1% de cacodilato tamponada _OsO4 e desidratados com etanol.
   7. Amostras Orient em moldes de silicone e incorporado nas resinas consistem em POLYBED 812, DDSA e MNA, ao qual foi adicionado 2% da BDMA acelerador.
   8. Faça cortes transversais semi-finos (1 Hm de espessura) utilizando um ultramicrotomia Sistema Pyramitome.
   9. Mancha com 0,1% de azul de toluidina em tetraborato de sódio a 1% durante 75 segundos a 70 ° C.
   10. Analisar amostras NLR com um sistema de análise de contagem. Contar o número de fibras e medir os perfis de fibras nervosas mielinizadas, determinando o limite exterior e interior da bainha de mielina.
4. Transplantação
   1. Preparar células para transplante e transplantar as células como anteriormente descritosem "O transplante celular" (seção 2.2).
   2. Análise
   3. Eutanásia do animal com overdose de pentobarbital. Note-se que a fixação dos animais pode ser realizada utilizando injecção intracardíaca de PFA a 4%.
   4. Retire cerca de 2 cm de NLR. Use proximal e partes distais do NLR.
   5. Fix amostra NLR em nitrogênio líquido.
   6. Armazenar as amostras a -80 ° C.
   7. As amostras cortadas longitudinalmente usando criostato (10-20 mm de espessura).
   8. Analisar amostras sob microscópio fluorescente para a detecção de células positivas para GFP. Note-se que o anticorpo anti-GFP pode ser utilizado para aumentar a emissão de fluorescência e para executar costainings.

Ilustrações com controle e reinervadas (/ anastomosados ​​seção) animais foram escolhidos como os resultados podem variar de acordo com os transplantes celulares realizados (OM, OB ou OM + OB).

Cultura celular
As células aderem rapidamente à superfície do plástico e tornou-se agrupadas em faixas paralelas de células que são alongadas ou afilada, triangular, multipolar, ou em forma de fuso (Figuras 1A e 1B). Após 8 dias de fluxo in vitro A análise por citometria mostra a taxa de células positivas para p75, 71% em OB primária, e 13% em culturas primárias de OM (Figuras 1C e 1D).

Transplante celular e cirurgia
As células são transplantadas para uma mistura de Matrigel em meio anastomosados ​​NLR. A anastomose da NLR é feito por um ponto de 11,0 sutura (Figura 2).

Evaluations
Videolaryngoscopy Dois meses após o transplante, as funções da laringe foram analisados ​​por videolaringoscopia e eletromiografia. Para realizar marcos anatômicos videolaringoscopia foram escolhidos para medir diferença entre abdução e adução (Figura 3).

Eletromiografia
Para completar essas análises estudos EMG foram realizadas utilizando eletrodo de agulha monopolar implantados nos músculos PCA. Traços típicos para (/ anastomosados ​​secção) e animais normais reinervados são apresentados na Figura 4.

As análises histológicas
Para estes animais, as análises histológicas do NLR foi realizada pela coloração azul de toluidina. Perfis de fibras típicas para (/ anastomosados ​​secção) e animais normais reinervados são apresentados nas figuras 5A e 5B. Para completar estas análises histológicas, rastreamento de células GFP positivas foi realizada. Figura 5C ilustra t ele presença de células positivas para GFP no nervo ciático após transplante intra-nervoso. Nervo ciático foi utilizado como controlo, como o tamanho NLR não permite a transplantação intra-nervoso.

Figura 1. Propriedades morfológicas e expressão P75 em culturas primárias de OB (A e C) e OM (B e D), in vitro. (A e B) OECs em OB e OM culturas primárias expressa morfologias alongados, triangulares ou em forma de fuso . (C e D), a expressão à superfície celular de p75 em OB e OM culturas primárias foi determinada por citometria de fluxo. Os números indicam a população total e a percentagem de células presentes nas regiões fechadas indicados. Por favor / 50590fig1highres.jpg "> clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagem de uma anastomose da NLR realizada com 11,0 sutura. (A) Sectioned NLR antes da cirurgia. (B) Anastomose entre o proximal eo coto distal do NLR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Vistas típicas endoscópicos do plano de glote rato. Durante as avaliações, os marcos são determinados, a fim de ter o mesmo campo de visão para cada gravação. Do ponto de vista apresentados tanto o rapto máxima (A) ea adução máxima (B) são medidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Exemplos de traços EMG obtidos durante a respiração no músculo PCA. (A) Os animais do grupo controle apresentou uma atividade muscular elétrica rico, com um aumento durante a inspiração. ( B) traços EMG mostraram que o grupo reinervadas (seção / anastomose) deixou essa atividade sincronizada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Estudos histológicos nervoso. (A e B) Exemplo de cortes coronais do NLR do grupo controle. Esta análise mostrou que o grupo controle apresentou um maior número de fibras mielinizadas. (A) Ampliação 3960 X e (B) ampliação 11.900 X. (C) GFP marcado OB-OECs permaneceu no local da lesão em nervo ciático esmagado rato. Ampliação 100X.

As técnicas apresentadas aqui fazer OECs um modelo útil para estudar transplantes celulares em modelos de lesão de nervos periféricos. O protocolo de cultura de células é relativamente simples e pode ser facilmente levada a cabo. Por outro lado, os procedimentos cirúrgicos, em particular o capítulo / anastomose da NLR, exigem experiência e devem ser realizadas por pessoal qualificado.

Os procedimentos descritos neste protocolo destacar fatores importantes para focar de forma a obter os melhores resultados possíveis. Em primeiro lugar, durante a dissociação da OM, recomendamos dissecção cuidadosa para obter apenas epitélio olfativo e não respiratório. Em segundo lugar, para a anastomose da NLR, recomendamos a realização de apenas um ponto com um 11,0 sutura. Terceiro, durante a avaliação, é muito importante ter a mesma profundidade de anestesia entre todos os animais. Em particular, a anestesia profunda reduz a amplitude de movimento das cordas vocais durante a videolaringoscopia. Recomendamos removing laringoscópio o mais rápido possível para evitar a asfixia dos animais. Durante a gravação de EMG, devido ao tamanho dos músculos PCA recomendamos colocar cuidadosamente o eléctrodo de agulha monopolar. Finalmente, para estudos histológicos é importante para orientar cuidadosamente as amostras NLR obter secções coronais. É também muito importante para remover e analisar a parte distal do NLR em que ocorre degeneração waleriana.

Os protocolos descritos aqui pode ser facilmente modificado para gerar culturas puras de OECs de OB e OM. Para a purificação de OECs de OB recomendamos a técnica descrita por Nash ¹⁴ e para a purificação de OECs de OM recomendamos o método descrito por Bianco ^15. Estes dois métodos de purificação específicas permitem ter altamente purificado de culturas OECs (90%) e têm sido bem descritos anteriormente pelos autores ^14,15. Outra modificação possível é o procedimento de transplante where as células podem ser injectadas directamente num nervo periférico, tal como descrito anteriormente para o nervo ciático ^7. Neste caso, as células podem ser injectadas sem Matrigel. É importante notar que, devido ao tamanho da NLR não é possível injectar células directamente para este nervo. Finalmente outra modificação possível é a otimização do protocolo de EMG. Com efeito, as gravações de actividade muscular dos músculos do PCA e diafragma pode ser realizada em conjunto, eliminando a necessidade de sincronização entre a laringe e os músculos respiratórios.

Os protocolos actuais pode ser aplicado em outros paradigmas de lesões nervosas. Já transplantado OECs em vários modelos de PNI como nervos ciático e vago, estas terapias podem ser facilmente utilizado noutros PNI paradigmas ^8,11,12,16. Mais interessantemente transplante celular de OECs pode ser estendido para as doenças do sistema nervoso central, em particular, a SCI. O método descrito aqui para a medição de laringefunção após a secção NLR / anastomose pode também ser utilizado para outros protocolos de transplantes celulares. De fato, os modelos da laringe pode ser muito poderosa para avaliar rebrota e sincinesias fenômenos axonal.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores gostariam de agradecer ADIR (Aide aux domicílio Insuffisants respiratoires) e Fondation de l'Avenir por seu apoio financeiro e ao Dr. Fanie Barnabé-Heider para a edição do manuscrito.