Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos

Mudanças nos membros musculares contráteis e passiva propriedades mecânicas são biomarcadores importantes para doenças musculares. Este manuscrito descreve ensaios fisiológicos para medir estas propriedades no longus murino extensores dos dedos e tibial anterior.

Os movimentos do corpo são fornecidos principalmente por função mecânica do músculo esquelético. O músculo esquelético é composta de feixes de numerosos miofibras que são revestidos por tecidos conjuntivos intramusculares. Cada fibra muscular contém muitas miofibrilas que correm longitudinalmente ao longo do comprimento da fibra muscular. Miofibrilas são o aparato contrátil do músculo e que são compostos de unidades repetidas contrácteis conhecidos como sarcômeros. Uma unidade sarcômero contém filamentos de actina e miosina que estão espaçados pelos discos Z e proteína titina. A função mecânica do músculo esquelético é definido pelas propriedades contrácteis e passiva do músculo. As propriedades contrácteis são utilizadas para caracterizar a quantidade de força gerada durante a contracção do músculo, o tempo de geração de força e do tempo de relaxamento muscular. Qualquer fator que afeta a contração muscular (como a interação entre filamentos de actina e miosina, homeostase do cálcio, ATP / ADP relação, etc) influencia a prope contrátilrties. As propriedades passivas referem-se às propriedades elásticas e viscosas (rigidez e viscosidade) do músculo, na ausência de contracção. Estas propriedades são determinadas pela extracelular e os componentes estruturais intracelulares (tais como titina) e tecido conjuntivo (principalmente colagénio) ^1-2. As propriedades contráteis e passiva são dois aspectos inseparáveis ​​da função muscular. Por exemplo, a flexão do cotovelo é conseguida pela contracção dos músculos do compartimento anterior do braço superior e estiramento passivo dos músculos no compartimento posterior da parte superior do braço. Para compreender verdadeiramente a função muscular, ambas as propriedades contráteis e passiva deve ser estudado.

As propriedades contráteis e / ou passiva mecânicas do músculo são muitas vezes comprometida em doenças musculares. Um bom exemplo é distrofia muscular de Duchenne (DMD), um músculo desperdiçando grave doença causada por deficiência de distrofina ^3. Distrofina é uma prote cytoskeletalna medida em que estabiliza a membrana celular do músculo (sarcolema) durante ⁴ contracção muscular. Na ausência de distrofina, o sarcolema é danificado pela força de corte geradas durante a transmissão da força. Esta membrana rasgando inicia uma reacção em cadeia que leva à morte da célula muscular e perda de maquinaria contráctil. Como consequência, a força muscular é reduzida e miofibras mortas são substituídos pelos tecidos fibróticos ^5. Esta alteração posterior aumenta rigidez muscular ^6. A medição precisa destas mudanças fornece guia importante para avaliar a progressão da doença e para determinar a eficácia terapêutica do novo gene / célula / intervenções farmacológicas. Aqui, apresentamos dois métodos para avaliar as propriedades contráteis e passiva mecânicas do extensor longo dos dedos (EDL) muscular e as propriedades contráteis do músculo tibial anterior (TA).

1. Avaliação das propriedades contráteis e passiva da EDL vivo Muscle Ex

As propriedades contráteis e passiva do músculo EDL são medidos ex vivo utilizando o Scientific Aurora in vitro sistema de teste muscular. Consulte a Tabela 1 para materiais e equipamentos.

1.1 Preparação Equipment

1. Montar o banho de tecido de órgãos, assegurando o oxytube ao banho de tecidos da água da camisa. Anexar o banho montadas para o aparelho de montagem de músculo. Conecte a linha de gás para o oxytube. Fixar as linhas de circulação de água para o banho de tecido de jaqueta de água e colocar a válvula de agulha no interior do banho de drenagem.
2. Ligar o banho de água circulante e ajustar a temperatura a 30 ° C ^7. Permitir 5 PSI (libras por polegada quadrada) de 95% de O ₂ -5% CO ₂ a fluir através do oxytube. Encha a banheira com tampão de Ringer. Equilibre a memória intermédia para, pelo menos,10 min, com um fluxo de gás constante, ajustando a válvula de oxytube.
3. Ligue os instrumentos (estimulador, de modo duplo sistema de alavanca, e interface de sinal). Carregue a dinâmica muscular controlo de software (DMC) de acordo com as instruções do fabricante.

1,2 dissecção músculo EDL

Todos os estudos com animais devem ser aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso.

1. Anestesiar o rato com injeção intraperitoneal de 2,5 ul / g de peso corporal do coquetel anestésico (consulte a seção de materiais). Durante todo o procedimento cirúrgico, a profundidade de sedação foi verificada através da realização de um aperto do dedo do pé. Um suplemento de 10% da dose inicial do anestésico é administrado quando necessário para manter o animal sob anestesia. Raspar o membro posterior. Manter a temperatura interna do corpo a 37 ° C antes do procedimento de dissecção colocando o rato sobre uma almofada de aquecimento. A temperatura do corpo é monitorizada por medição da temperat constante rectalure utilizando uma sonda térmica.
2. Posicione o mouse sobre a supina bordo dissecção (Figura 1). Retire a pele da perna para expor os músculos dos membros posteriores. Fixar a perna no bloco Sylgard usando dois pinos costureira, uma em pé e outra no músculo gracilis. Coloque uma lâmpada de calor acima do corpo do rato para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Constantemente superfuse todos os músculos expostos com tampão de Ringer. Drenar o excesso de tampão por meio de uma linha de vácuo.
3. Expor o tendão distal TA eo ligamento extensor sob estereomicroscópio dissecando a pele para o pé. Remova cuidadosamente a fáscia que cobre o músculo TA. Cortar o ligamento extensor para liberar o tendão distal TA.
4. Cortar o tendão distal TA e usá-lo para descolar do músculo TA. Remova cuidadosamente o músculo TA em seu anexo proximal. Coloque um pedaço fino de algodão embebido em tampão de Ringer ao lado do músculo EDL para absorver hemorragia causada pela ruptura da vasculatura do músculo TA. Utilizar a linha de vácuo para remover o excesso de tampão e sangue.
5. Atar um nó duplo quadrados seguido de um nó do laço usando uma sutura de seda de pão na junção tendão do músculo (MTJ) do músculo EDL distal (Figura 2). Fazer uma incisão na porção distal do músculo biceps femoris para expor o músculo EDL proximal. Repetir o mesmo conjunto de nós (Figura 2) na MTJ do tendão proximal EDL. Prenda o gancho do braço de alavanca para tanto o proximal ou os nós distais com um nó duplo quadrado usando a mesma linha de sutura. Cortar a linha de sutura restante.
6. Cortar o tendão proximal EDL superior ao nó de sutura proximal. Levantar-se o músculo EDL com o gancho e cortar a vasculatura por baixo do músculo. Cortar o tendão distal EDL inferior para o nó de sutura distal para remover o músculo EDL a partir do membro posterior. Cobrir o membro exposto posterior com um pedaço de algodão Ringer tampão encharcado.
7. Prenda o gancho ao braço de alavanca. Alinhar o músculo verticalmenteentre dois eletrodos. Fixe a linha de sutura distal ao posto fixo. Levante o banho de tecido para submergir o músculo em tampão de Ringer. Ajustar a tensão de repouso de 1,0 g utilizando o estágio de translação dupla grossa / fina e permitir que o músculo se equilibrar durante pelo menos 10 min.

1,3 medir as propriedades contráteis e passiva do músculo EDL

Use a Tabela 2 para configurar os parâmetros no software DMC para cada uma das medidas a seguir. Analisar os dados usando a análise muscular dinâmica (DMA) de software.

1.3.1 A medição das propriedades contráteis do músculo EDL

1. Estimular o músculo EDL três vezes a 150 Hz com 60 seg para além de estabilizar a musculatura ^8.
2. Estimular o músculo EDL com diferentes tensões de repouso para determinar o comprimento óptimo (Lo). O comprimento ideal é o comprimento no qual o músculo desenvolve tensão contração máxima. Permitir que o músculorelaxar durante 2 minutos.
3. Ajuste a tensão de repouso para Lo. Medir a força muscular em contração estimulação única. Determinar a força de contracção absoluta (Pt), tempo para o pico de tensão (TPT) e tempo de semi-relaxamento (½ RT) do Pt. Permitir que o músculo para relaxar durante 2 minutos.
4. Ajuste a tensão de repouso para Lo. Medir a força muscular tetânica gerado em diferentes frequências de estimulação (50, 80, 100, 120, 150 e 200 Hz). Determine a força muscular absoluta tetânica máxima (Po), onde a força muscular atinge o máximo. Meça a TPT e ½ RT do Pó ^9.
5. Permitir a relaxar o músculo durante 5 min. Ajuste a tensão de repouso para Lo. Aplicar 10 ciclos de contrações excêntricas com 2 min de repouso entre os ciclos. Calcular a perda de força relativa do Po após cada ciclo de contração excêntrica.
6. Separe o músculo EDL do aparelho e cortar os tendões no local da sutura. Determinar o peso do músculo molhado e calcular a área transversal muscular seccional (CSA)6,10.

1.3.2 A medição das propriedades passivas do músculo EDL

1. Dissecar o músculo contralateral EDL e anexá-lo ao aparelho, como descrito na Seção 1.2, as etapas de 2 a 7.
2. Submeter o músculo EDL com um protocolo de seis passos de alongamento em que o músculo é esticado em 160% Lo com um incremento de 10% Lo. Analisar o perfil ⁶ tensão-deformação.
3. Avaliar a propriedade viscoso do músculo EDL através da medição da taxa de relaxação de tensão (SRR) nos seguintes intervalos de tempo após o alongamento e segurando o músculo em Lo de 10%: de pico-a-pico de 0,1 s de pós-(pp), de 0,1 a 0,2 s pp, de 0,2 a 0,5 s pp, de 0,5 a 1s pp e de 1 a 1,5 s pp
4. No final do estudo, a eutanásia por deslocamento cervical do rato e / ou a decapitação, enquanto o rato é ainda sob anestesia. Separe o músculo EDL do aparelho e cortar os tendões no local da sutura. Determinar o peso do músculo molhado e calcular o músculo cruz sectional área (CSA) ^{6, 10.}

2. Avaliação das Propriedades contrátil do músculo TA in situ

As propriedades contráteis do músculo TA são mensurados usando a Scientific Aurora no sistema músculo situ teste. Consulte a Tabela 1 para materiais e equipamentos.

2.1 Preparação de Equipamento

1. Aquece-se a fase de termo-controlado dos animais a 37 ° C usando a água circulante banho.
2. Ligue os instrumentos (estimulador, de modo duplo sistema de alavanca, e interface de sinal). Carregue o software DMC de acordo com as instruções do fabricante.

2.2 Preparação do músculo TA na medição de força situ

1. Anestesiar o rato, fazer a barba do membro posterior e expor o músculo TA, como descrito nos passos 1 a 3 na Seção 1.2.
2. Dê um nó duplo quadrado ao redor da patela ligamento using de uma sutura de seda de pão. Dê um nó duplo quadrado seguido por um nó do laço no MTJ do músculo TA distal (Figura 2), amarrar outro nó duplo quadrado deixando um laço ~ 10 mm a partir do nó distal TA tendão utilizando a mesma linha de sutura. Coloque o nó duplo segundo quadrado no lado do circuito.
3. Remova os pinos do membro posterior e posicionar o animal de bruços. Expor o músculo bíceps femoral. Faça uma incisão na linha média para revelar o nervo ciático. Dê um nó duplo quadrado ao redor da extremidade proximal do nervo ciático. Aparar um dos lados das linhas de sutura e cortar o nervo superior ao nó. Delicadamente, puxe o nervo ciático em direção ao joelho usando a linha de sutura e limpar o tecido conectivo a livre ~ 5 mm do seu comprimento. Não esticar o nervo durante este procedimento e constantemente superfuse o nervo com tampão de campainha.
4. Prepare o músculo TA contralateral como descrito nos passos 1 a 3. Cobrir um do membro posterior exposta com um pedaço de Ringer tampão de algodão embebido. Constantemente superfuse ambos os membros posteriores com pré-aquecido (37 ° C) de tampão de Ringer. Remover o excesso de tampão por meio de uma linha de vácuo.
5. Posicione o animal propenso na plataforma animal. Instale o suporte de fixação do joelho para a plataforma animal e proteger os joelhos para o pino de metal com o dobro nós quadrados usando as linhas de sutura do ligamento patelar. Pin os dois pés sobre o bloco Sylgard usando pinos costureira. Fixe a plataforma de animais no palco termo-controlada. Posicionar a lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal central de animais, a 37 ° C.
6. Fixar o suporte de eléctrodo para a plataforma de animais e colocar o nervo ciático no eléctrodo utilizando a linha de sutura. Manter o eléctrodo de distância dos músculos dos membros posteriores. Cortar o tendão TA distal do membro posterior descoberta no local da sutura MTJ. Fixe a distal TA laço de sutura do tendão ao gancho do braço de alavanca. Cubra o músculo do membro exposto posterior com um algodão Ringer quente de tampão encharcado.

2,3 medição das propriedades contráteis do músculo TA

1. Use a Tabela 2 para definir os parâmetros no software DMC. Siga o mesmo protocolo descrito na Seção 1.3.1 para determinar as propriedades contráteis do músculo TA. Analisar os dados usando o software DMA.
2. Após a medição propriedade contrátil, retire a distal TA laço de sutura do tendão do gancho braço nivelador. Retire o músculo TA. Determinar o peso do músculo molhado e calcular o CSA ^10.
3. Medir as propriedades contrácteis do músculo TA contralateral acordo com os passos 1-3 descritos acima. Eutanásia do rato de acordo com directrizes institucionais, no final do estudo.

Os resultados seguintes são uma representação dos seus relatórios anteriores ^6,9. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. A Tabela 3 mostra as propriedades morfométricas do músculo EDL em BL10 normais e deficientes em distrofina (mdx) ratos em 4 a 6 meses de idade. Figura 4 mostra representativos propriedades contrácteis e passiva do músculo EDL de BL10 e mdx ratos. As propriedades contrácteis do músculo EDL são descritos pelos termos seguintes, incluindo o (força absoluta dividida pela CSA) específico força twitch (Figura 4A), a força tetânica específica máxima (Figura 4B), TPT e ½ RT da força máxima absoluta tetânica (Figura 4C e D). O TPT e ½ RT também pode ser calcular a força de contração absoluta. O perfil de tensão-deformação (Figura 4E) e SRR (Figura 4F) umre utilizado para descrever as propriedades passivas do músculo EDL.

Ausência de distrofina tem um impacto significativo sobre as propriedades contráteis e passiva do músculo EDL ^6,9. Twitch específico e as forças tetânica são reduzidos significativamente no músculo EDL mdx. O TPT é significativamente mais rápido, enquanto o ½ RT é significativamente mais lenta no músculo EDL mdx. O perfil de tensão-deformação sugere que a rigidez é aumentada significativamente no músculo EDL mdx. O mdx músculo EDL também produz uma força de resistência significativamente muito maior (stress passiva) antes de chegar ao pico de tensão, enquanto as tensões pós-pico declinar muito mais rápido. Além disso, o SRR foi significativamente mais elevada no músculo EDL mdx em comparação com a do músculo EDL BL10.

A análise estatística

Significância estatística entre os dois grupos é analisada pelo teste t de Student. Para ssignificado tatistical entre vários grupos, de uma forma ou de duas vias análise de variância, seguido de análise post hoc Bonferroni é recomendada a utilização do software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Diferença é considerado significativo quando p <0,05.

Tabela 1. Materiais e equipamento.

Tabela 2. Parâmetros para a avaliação das propriedades mecânicas dos músculos EDL e TA.

Tabela 3. Propriedades morfométricas do músculo EDL. *, O valor em mdratinhos x é significativamente diferente do da mesma idade BL10 ratos.

Figura 1. Um diagrama esquemático da placa de dissecção custom-made mouse. Dissecção A placa é feita de um acrílico ½ polegada de espessura e foi fabricado na loja institucional. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 2. Uma série de imagens digitais que mostram os passos de atar um nó duplo quadrada seguido por um nó laço na MTJ. Asterisk, oMúsculo EDL; Arrow, do tendão distai do músculo EDL.

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Figura 3. Um diagrama esquemático da plataforma feito por medida para ensaio in situ da função muscular TA. A plataforma animais plexiglass e do titular do joelho de aço inoxidável foram concebidos para a montagem sobre o aparelho 809B de rato in situ. *, Haste de aço inoxidável (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR); #, porta-eletrodo Universal (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR) §, haste de fixação do eletrodo (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); ** Sylgard bloco. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 4. Os resultados representativos para as propriedades contráteis e passiva do músculo EDL. Contráteis do músculo EDL caracterizam-se por a força de contração específica (A), a força tetânica específica (B), o tempo para o pico de tensão (C) e o tempo de relaxação da metade (D). As propriedades passivas do músculo EDL são avaliados pelo perfil de tensão de esforço (E) e o SSR. *, Camundongos mdx são significativamente diferentes de mesma idade BL10 ratos.

Neste protocolo, que ilustramos ensaios fisiológicos para medir as propriedades contráteis e passiva músculo EDL e as propriedades contráteis do músculo TA. Uma grande preocupação em estudos de fisiologia do músculo é a oxigenação do músculo alvo. Para grandes músculos (tais como o músculo TA), o na abordagem in situ é a preferida porque a difusão de oxigénio a partir de tampão de Ringer não pode atingir o centro do músculo em um ensaio in vitro. Na abordagem situ não perturbe suprimento de sangue normal e hipóxia associada efeitos artificiais são evitados. O músculo EDL é um dos músculos mais comumente utilizado no estudo da fisiologia. Oxigenação adequada do músculo inteiro pode ser conseguida em um sistema in vitro devido à pequena dimensão do músculo. Além disso, o sistema in vitro fornece um ambiente fechado para manipular a concentração de iões (Ca ^{2 +,} Na ⁺ e K ⁺⁾ e chemicals (ATP e glicose), que são necessárias para a produção óptima força muscular. Isto oferece uma grande oportunidade para estudar o efeito dessas variáveis ​​na produção de força.

Uma medição precisa das propriedades contrácteis e passiva do músculo do membro é crítica para estudar a função do músculo esquelético. Alterações características dessas propriedades são muitas vezes consideradas como as características de várias doenças musculares. As mudanças nestes parâmetros também são indicadores importantes para determinar se uma terapia experimental é eficaz ou não.

Não há conflitos de interesse declarados.

Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (AR-49419, DD), Associação de Distrofia Muscular (DD), e treinamento NIH concessão T90DK70105 (CH).