Gibberella zeae Produkcja Ascospore i Kolekcja dla Eksperymenty mikromacierzy.

Do badania procesów rozwojowych z askospory w Gibberella zeae, procedury zbierania w sterylnych warunkach jest filmowany w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji dla opisu protokołu. Powinno to ułatwić powtarzalność eksperymentu, kluczowym aspektem, gdy pełne testy ekspresji genomu profil są realizowane.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) jest patogenem roślin powoduje chorobę parcha na pszenicy i jęczmienia, która zmniejsza plony i jakość ziarna. F. graminearum powoduje także łodygi i ucha gnije kukurydzy i jest producentem mikotoksyn, takich jak trichotecenów, że skażenie zboża i są szkodliwe dla ludzi i zwierząt gospodarskich (Goswami i Kistler, 2004). Grzyb wytwarza dwa rodzaje zarodników. Askospory, zarodnikami w wyniku rozmnażania płciowego, są głównym źródłem infekcji pierwotnej. Te zarodniki są przymusowo zwolniony z dojrzałych perithecia i rozproszone przez wiatr (Francl i wsp. 1999). Wtórne infekcje spowodowane są głównie macroconidia które są produkowane przez bezpłciowe oznacza na powierzchni roślin. Do badania procesów rozwojowych z askospory w tego grzyba, procedurę ich gromadzenia w dużej ilości w warunkach sterylnych było wymagane. Nasz protokół został nakręcony w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji w celu zrozumienia i powtarzalność; kluczowe aspekty, gdy pełne profile ekspresji genów genomu są generowane i interpretowane. W szczególności, zmienność ascospore kiełkowania i aktywności biologicznej są uzależnione od uprzedniego manipulacji materiału. Korzystanie z wideo dokumentujące każdy krok w ascospore produkcji proponuje w celu zwiększenia standaryzacji, zgodne z coraz bardziej rygorystyczne wymagania dotyczące analizy mikromacierzy. Procedura wymaga tylko standardowych urządzeń laboratoryjnych. Kroki zostały przedstawione w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu i synchronizacji czasu za askospory.

1. Agar marchwi (Klittich i Leslie, 1988) został przygotowany w 9-centymetrowych płytkach Petriego.
2. 2 mm kostka agar zawierający świeży grzybnia uprawiana na ziemniaków dekstroza agar został zastosowany do centrum każdej szalki Petriego.
3. Kultury hodowano w 25 ° C i 12-h oświetlenia do 96 godzin.
4. Jeden ml wodnego 2,5% Tween 60 był stosowany do powierzchni kultury (Trail i Common, 2000) i obejmują kultury plastikowy pręt, delikatnie naciskając.
5. Strzelanie Perithecia askospory opracowane 7-10 dni po tym leczeniu indukcyjnym, gdy jest przechowywany w warunkach wysokiej wilgotności w temperaturze 25 ° C z tym samym fotosyntezy.
6. Spore kolekcji wykonywana jest przez zmianę pokrywy płytki Petriego, pozostawiając perithecia strzelać w ograniczonym czasie (np. 12 godzin) w ciemności.
7. Sterylnej wody dodaje się do pokrywy, zawieszania askospory delikatnie ruchu wody na powierzchni.
8. Askospory gromadzone są w sterylnych probówek Falcon, myte i używane do dalszej analizy.

Protokół przedstawione tutaj opiera się na wcześniejszych procedur stosowanych perithecial produkcji Fusarium. (Klittich i Leslie, 1988; Trail i Common, 2000). Standaryzacja procedury, dzięki której duże ilości askospory (wystarcza do analizy mikromacierzy) były generowane było konieczne dla powtarzalności eksperymentu. Zanotowano, że czynniki środowiskowe, wiek i podłoża różnic biologicznych może zmienić charakter askospory (Beyer i Verreet, 2005). Dlatego stosowanie wideo mogą podkreślić drobnych szczegółów w sposób zarodniki są wytwarzane i gromadzone, które powinny ułatwić powtarzalność. W szczególności wideo procedury powinny poprawić poziom standaryzacji między laboratoriami i ułatwić porównanie całych studiów transkrypcji genomu, które wymagają ascospore produkcji. Ilość RNA niezbędnych do procedury eksperymentu jest stosunkowo wysoki, tak duża liczba Petriego powinny być przetwarzane synchronicznie. Video jest szczególnie przydatne narzędzie, gdy jest niezbędne do wykonania całego genomu transkrypcji badania nad nowymi materiału biologicznego, ustalenie standardu dla przyszłych eksperymentów.

Autorzy dziękują Karen Hilburn za doskonałą pomoc techniczną. Projekt ten był wspierany przez National Initiative Badania państwa USDA Spółdzielnia badań, edukacji i Extension Service (nagroda # 2004-35604-14327). Matias Pasquali jest obsługiwany przez Branco Weiss Fellowship. Pszenica USA i inicjatywy Scab Jęczmień jest także obecna na wsparcie kontynuacji badań.