dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using <em>In Vivo</em> Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

&#x4E24;&#x4E2A;&#x6DF7;&#x5408;&#x7535;&#x538B;&#x611F;&#x5E94;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB; &#xFF08;&#x97F3;&#x54C1;&#xFF09; &#x88AB;&#x7528;&#x4E8E;&#x819C;&#x6F5C;&#x5728;&#x66F4;&#x6539;&#x8BB0;&#x5F55;&#x5728;&#x6A2A;&#x7BA1;&#x7CFB;&#x7EDF; (TTS) &#x548C;&#x6210;&#x5E74;&#x5C0F;&#x9F20;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x808C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7684;&#x8868;&#x9762;&#x819C;&#x3002;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; Farnesylated &#x6216; ECFP (&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-F &#x548C; ECFP F) &#x88AB;&#x7528;&#x4F5C;&#x4E0D;&#x52A8;&#x97F3;&#x54C1;&#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x548C;&#x975E;&#x8367;&#x5149; (dipicrylamine [&#x653F;&#x6CBB;&#x90E8;]&#xFF09; &#x6216;&#x8367;&#x5149;&#x706F; (oxonol &#x67D3;&#x6599; DiBAC(4)(5)) &#x4EB2;&#x8102;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x88AB;&#x7528;&#x4F5C;&#x79FB;&#x52A8;&#x80FD;&#x6E90;&#x53D7;&#x4F17;&#x3002;&#x5C48;&#x808C;&#x8171;&#x77ED; (FDB) &#x808C;&#x808C;&#x8089;&#x88AB;&#x4E0E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9AA8;&#x67B6;-F &#x548C; pECFP F.&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x8F6C;&#x67D3;Farnesylated &#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x4E2D;&#x7684; TTS &#x548C;&#x8868;&#x9762;&#x819C;&#xFF0C;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x8868;&#x793A;&#x3002;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x5149;&#x5B66;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x4ECE;&#x4EE3;&#x987F;&#x548C;&#x5E73;&#x534F;&#x5B9A; &#x300B; &#x88AB;&#x547D;&#x540D;&#x4E3A; QRET &#x77AC;&#x53D8;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x533A;&#x522B;&#x4E8E;&#x97F3;&#x54C1;&#x77AC;&#x53D8;&#x8BB0;&#x5F55;&#x4F7F;&#x7528; DiBAC(4)(5)&#x3002;DeltaF/F QRET &#x77AC;&#x6001;&#x8BF1;&#x53D1;&#x52A8;&#x4F5C;&#x7535;&#x4F4D;&#x523A;&#x6FC0;&#x7684;&#x9AD8;&#x5CF0;&#x671F;&#x662F;&#x4E24;&#x500D;&#x5927;&#x5149;&#x7EA4;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x90A3;&#x4E9B;&#x4E0E;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-F &#xFF08;3.6%&#x4E0E; 7.1%&#xFF09; &#x8868;&#x793A; ECFP F &#x4E2D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x63D0;&#x4F9B;&#x5728;&#x97F3;&#x54C1;&#x7684;&#x5149;&#x8C31;&#x91CD;&#x53E0;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x7684;&#x72EC;&#x7279;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x793A;&#x8303;&#x3002;&#x7535;&#x538B;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x7684; QRET &#x548C;&#x97F3;&#x54C1;&#x4FE1;&#x53F7;&#x88AB;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x4E3A;&#x5BF9;&#x5E94;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x6613;&#x4F4D;&#x7684;&#x5E26;&#x7535;&#x7684;&#x53D7;&#x4F17;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5F53;&#x524D;&#x8BB0;&#x5F55;&#x4E2D;&#x7684;&#x975E;&#x7EBF;&#x6027;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x6E05;&#x5355;&#x3002;&#x4E3A;&#x53D1;&#x5C55;&#x5BA1;&#x6279;&#x5730;&#x533A;&#x56FE;&#xFF0C;&#x7535;&#x6C14;&#x548C; QRET &#x6570;&#x636E;&#x7531;&#x7535;&#x8377;&#x6613;&#x4F4D;&#x7684;&#x6700;&#x5927;&#x65F6;&#x95F4;&#x5E38;&#x6570;&#x5728;&#x5F55;&#x5F97;&#x6CBE; DiBAC(4)(5) &#x5C55;&#x89C8; DeltaF/F &#x632F;&#x5E45;&#x9AD8;&#x8FBE; 28%&#xFF0C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x52A8;&#x4F5C;&#x7535;&#x4F4D;&#x54CD;&#x5E94;&#x7684; 0.6 &#x5973;&#x58EB;&#x97F3;&#x54C1;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x5F84;&#x5411;&#x7535;&#x7F06;&#x6A21;&#x578B;&#x6A21;&#x62DF;&#x9884;&#x6D4B;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5176;&#x4E0A;&#x5347;&#x9636;&#x6BB5;&#x662F;&#x6BD4;&#x90A3;&#x4E9B; QRET &#x4FE1;&#x53F7;&#x901F;&#x5EA6;&#x6162;&#x3002;&#x6A21;&#x578B;&#x6A21;&#x62DF;&#x7535;&#x8377;&#x79FB;&#x4F4D;&#x7684; 1.6 ms &#x4E3A;&#x4E86;&#x9884;&#x6D4B;&#x5F53;&#x524D;&#x548C;&#x70E6;&#x607C;&#x6570;&#x636E;&#x9700;&#x8981;&#x65F6;&#x95F4;&#x5E38;&#x6570;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5DE5;&#x5177;&#x6765;&#x5FEB;&#x901F;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x7684; TTS &#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x8BD5;&#x9A8C;&#xFF0C;&#x4E3A;&#x4EB2;&#x8102;&#x6027;&#x79BB;&#x5B50;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x7528;&#x9014;&#x63D0;&#x4F9B;&#x57FA;&#x7840;&#x3002;

&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x52A8;&#x6001;&#x97F3;&#x54C1;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4ECE;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x808C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x6A2A;&#x5411;&#x795E;&#x6548;&#x3002;

Two hybrid voltage-sensing systems based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) were used to record membrane potential changes in the transverse tubular system (TTS) and surface membranes of adult mice skeletal muscle fibers. Farnesylated EGFP or ECFP (EGFP-F and ECFP-F) were used as immobile FRET donors, and either non-fluorescent (dipicrylamine [DPA]) or fluorescent (oxonol dye DiBAC(4)(5)) lipophilic anions were used as mobile energy acceptors. Flexor digitorum brevis (FDB) muscles were transfected by in vivo electroporation with pEGFP-F and pECFP-F. Farnesylated fluorescent proteins were efficiently expressed in the TTS and surface membranes. Voltage-dependent optical signals resulting from resonance energy transfer from fluorescent proteins to DPA were named QRET transients, to distinguish them from FRET transients recorded using DiBAC(4)(5). The peak DeltaF/F of QRET transients elicited by action potential stimulation is twice larger in fibers expressing ECFP-F as those with EGFP-F (7.1% vs. 3.6%). These data provide a unique experimental demonstration of the importance of the spectral overlap in FRET. The voltage sensitivity of QRET and FRET signals was demonstrated to correspond to the voltage-dependent translocation of the charged acceptors, which manifest as nonlinear components in current records. For DPA, both electrical and QRET data were predicted by radial cable model simulations in which the maximal time constant of charge translocation was 0.6 ms. FRET signals recorded in response to action potentials in fibers stained with DiBAC(4)(5) exhibit DeltaF/F amplitudes as large as 28%, but their rising phase was slower than those of QRET signals. Model simulations require a time constant for charge translocation of 1.6 ms in order to predict current and FRET data. Our results provide the basis for the potential use of lipophilic ions as tools to test for fast voltage-dependent conformational changes of membrane proteins in the TTS.

Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.

Deux hybrides tension de d&#xE9;tection des syst&#xE8;mes bas&#xE9;s sur le transfert d&#x26;#39;&#xE9;nergie par r&#xE9;sonance de fluorescence (FRET) ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;s pour enregistrer les modifications du potentiel de membrane dans le syst&#xE8;me tubulaire transversal (TTS) et des membranes de surface de souris adultes des fibres musculaires squelettiques. Farn&#xE9;syl&#xE9;e EGFP ou ECFP (EGFP-F et-F ECFP) ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;s comme immobile FRET donateurs, et soit non-fluorescente (dipicrylamine [DPA]) ou fluorescent (oxonol colorant DiBAC (4) (5)) anions lipophiles ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;es comme mobile accepteurs d&#x26;#39;&#xE9;nergie. Court fl&#xE9;chisseur des orteils (FDB) des muscles ont &#xE9;t&#xE9; transfect&#xE9;es par &#xE9;lectroporation in vivo avec pEGFP-F et-F pECFP. Farn&#xE9;syl&#xE9;e prot&#xE9;ines fluorescentes ont &#xE9;t&#xE9; efficacement exprim&#xE9;e dans les TTS et les membranes de surface. Voltage-d&#xE9;pendants des signaux optiques r&#xE9;sultant du transfert d&#x26;#39;&#xE9;nergie par r&#xE9;sonance parmi les prot&#xE9;ines fluorescentes &#xE0; la DPA ont &#xE9;t&#xE9; nomm&#xE9;s transitoires QRET, pour les distinguer des FRET transitoires enregistr&#xE9;es &#xE0; l&#x26;#39;aide DiBAC (4) (5). Le pic DeltaF / F de transitoires QRET provoqu&#xE9; par la stimulation du potentiel d&#x26;#39;action est deux fois plus grande dans les fibres exprimant ECFP-F que ceux &#xE0; l&#x26;#39;EGFP-F (7,1% vs 3,6%). Ces donn&#xE9;es fournissent une d&#xE9;monstration exp&#xE9;rimentale unique de l&#x26;#39;importance du chevauchement spectral dans FRET. La sensibilit&#xE9; de tension de QRET et FRET signaux a &#xE9;t&#xE9; montr&#xE9; &#xE0; correspondre &#xE0; la translocation d&#xE9;pendant de la tension des accepteurs charg&#xE9;es, qui manifeste en tant que composants non lin&#xE9;aires dans les enregistrements actuels. Pour DPA, les deux donn&#xE9;es &#xE9;lectriques et QRET ont &#xE9;t&#xE9; pr&#xE9;dits par des simulations de mod&#xE8;les radiaux de c&#xE2;bles dans lequel la dur&#xE9;e maximale constante de la translocation de charge &#xE9;tait de 0,6 ms. FRET signaux enregistr&#xE9;s en r&#xE9;ponse &#xE0; des potentiels d&#x26;#39;action dans les fibres color&#xE9;es avec DiBAC (4) (5) pr&#xE9;sentent DeltaF / F amplitudes aussi grand que 28%, mais leur phase de mont&#xE9;e a &#xE9;t&#xE9; plus lente que celles des signaux QRET. Les simulations du mod&#xE8;le n&#xE9;cessite une constante de temps pour la translocation de charge de 1,6 ms afin de pr&#xE9;dire actuelle et FRET donn&#xE9;es. Nos r&#xE9;sultats fournissent la base pour l&#x26;#39;utilisation potentielle des ions lipophiles comme des outils pour tester rapidement voltage-d&#xE9;pendants des changements de conformation des prot&#xE9;ines membranaires dans les TTS.

Voltage-d&#xE9;pendants dynamique FRET signaux en provenance des tubules transverses dans les fibres musculaires squelettiques de mammif&#xE8;res

Zwei Hybrid Spannung-sensing Systeme basierend auf Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) wurden zur Membrane m&ouml;glichen Ver&auml;nderungen in der Querrichtung R&ouml;hrensystem (TTS) und Oberfl&auml;che Membranen der Erwachsenen M&auml;usen skelettartiger Muskel Fasern aufnehmen. Farnesylated EGFP oder ECFP (EGFP-F und ECFP-F) dienten als unbeweglich FRET-Geber, und nicht-fluoreszierender (Dipicrylamine [DPA]) oder fluoreszierende (Oxonol Farbstoff DiBAC(4)(5)) lipophile Anionen als mobile Energie Acceptors verwendet wurden. Musculus Flexor Digitorum Brevis (FDB) Muskeln wurden durch in-vivo Electroporation mit pEGFP-F und pECFP-F. transfected. Farnesylated fluoreszierende Proteine wurden effizient im TTS und Oberfl&auml;che Membranen ge&auml;u&szlig;ert. Spannung-abh&auml;ngigen optische Signale aufgrund Resonanz-Energie-&Uuml;bertragung aus fluoreszierende Proteine zu DPA hie&szlig;en QRET Transienten, zur Unterscheidung von FRET-Transienten mit DiBAC(4)(5) aufgezeichnet. Der Gipfel DeltaF/F von QRET Transienten hervorgerufen durch Aktionspotential Stimulation ist zweimal gr&ouml;&szlig;ere Fasern ECFP-F als diejenigen mit EGFP-F (7,1 % vs. 3,6 %) zum Ausdruck zu bringen. Diese Daten liefern eine einzigartige experimentelle Beweis f&uuml;r die Bedeutung der spektrale &Uuml;berlappung in FRET. Die Spannung-Empfindlichkeit von QRET und FRET Signalen wurde demonstriert, um die Spannung-abh&auml;ngige Translokation von den aufgeladenen Acceptors entsprechen, die als nichtlineare Komponenten in aktuellen Datens&auml;tze zu manifestieren. DPA beide elektrische und QRET Daten wurden durch radiale Kabel Modellsimulationen, in denen die maximale Dauer-Konstante der kostenlos Translokation 0,6 ms-FRET-Signale aufgezeichnet als Reaktion auf Aktionspotentiale in Fasern gef&auml;rbt mit DiBAC(4)(5) Ausstellung DeltaF/F Amplituden so gro&szlig; wie 28 war % vorhergesagt, aber ihre steigende Phase war langsamer als die der QRET Signale. Modellsimulationen erfordern eine Zeitkonstante f&uuml;r kostenlos Translokation von 1,6 ms um aktuelle Vorhersagen und FRET Daten. Unsere Ergebnisse bilden die Grundlage f&uuml;r die m&ouml;gliche Verwendung von lipophilen Ionen als Werkzeuge f&uuml;r schnelle Spannung-abh&auml;ngigen Konformationsver&auml;nderungen von Membranproteinen in der TTS zu testen.

Spannung-abh&auml;ngigen dynamische Signale FRET von transversalen Tubuli in S&auml;ugetier-Skelett Muskelfasern.

Due rilevazione tensione sistemi ibridi basati sulla fluorescenza resonance energy transfer (FRET) sono stati utilizzati per registrare la membrana potenziali modifiche nel sistema tubolare trasversa (TTS) e la superficie delle membrane delle fibre muscolari scheletriche topi adulti. Farnesylated EGFP o ECFP (F-EGFP ed ECFP-F) sono stati utilizzati come immobile FRET donatori e non fluorescenti (dipicrylamine [DPA]) o fluorescenti (tintura oxonol DiBAC(4)(5)) anioni lipofilici sono stati utilizzati come accettori di energia mobile. Muscoli flessori estensore brevis (FDB) erano transfected dall&#39;elettroporazione in vivo con pEGFP-F e pECFP-F. Le proteine fluorescenti Farnesylated erano efficacemente espressa nel TTS e la superficie delle membrane. Segnali ottici voltaggio-dipendenti, derivanti dal trasferimento di energia per risonanza da proteine fluorescenti a DPA sono stati nominati transitori QRET, per distinguerli dai transitori FRET registrati utilizzando DiBAC(4)(5). Il picco DeltaF/F transitori QRET provocata dalla stimolazione del potenziale d&#39;azione &egrave; due volte pi&ugrave; grande in fibre esprimendo ECFP-F come quelli con EGFP-F (7,1% vs. 3,6%). Questi dati forniscono una dimostrazione sperimentale unico dell&#39;importanza della sovrapposizione spettrale in FRET. La sensibilit&agrave; di tensione dei segnali QRET e FRET &egrave; stata dimostrata da corrispondere per la traslocazione di voltaggio-dipendenti di accettori di caricate, che si manifestano come componenti non lineari nel record corrente. Per DPA, entrambi elettrici e dati QRET erano previsto da simulazioni di modello cavo radiale in cui la costante di tempo massimo di traslocazione carica era 0,6 ms FRET segnali registrati in risposta al potenziale d&#39;azione nelle fibre colorate con DiBAC(4)(5) mostra ampiezze DeltaF/F grande come il 28%, ma la fase di lievitazione &egrave; stato pi&ugrave; lento rispetto a quelli dei segnali QRET. Modello simulazioni richiedono una costante di tempo per traslocazione carica di 1,6 ms al fine di prevedere la corrente e dati si corroda. I nostri risultati forniscono la base per l&#39;uso potenziale di ioni lipofilici come strumenti per il test di veloce voltaggio-dipendente cambiamenti conformazionali delle proteine di membrana in TTS.

Dipendente dalla tensione dinamica FRET segnali da tubuli trasversali nelle fibre del muscolo scheletrici dei mammiferi.

&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#xFF08;FRET&#xFF09;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;2&#x3064;&#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x96FB;&#x5727;&#x691C;&#x77E5;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x6210;&#x4F53;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x9AA8;&#x683C;&#x7B4B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;&#x6A2A;&#x884C;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x7CFB;&#x306E;&#x819C;&#x96FB;&#x4F4D;&#x5909;&#x5316;&#xFF08;TTS&#xFF09;&#x3068;&#x8868;&#x9762;&#x306E;&#x819C;&#x3092;&#x8A18;&#x9332;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E0D;&#x52D5;&#x306F;&#x3001;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x306E;FRET&#x3001;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306E;&#x975E;&#x86CD;&#x5149;&#xFF08;dipicrylamine [DPA]&#xFF09;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x86CD;&#x5149;&#xFF08;&#x30AA;&#x30AD;&#x30BD;&#x30CE;&#x30FC;&#x30EB;&#x8272;&#x7D20;DiBAC&#xFF08;4&#xFF09;&#xFF08;5&#xFF09;&#xFF09;&#x89AA;&#x6CB9;&#x6027;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x304C;&#x643A;&#x5E2F;&#x96FB;&#x8A71;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30D5;&#x30A1;&#x30EB;&#x30CD;&#x30B7;&#x30EB;EGFP&#x307E;&#x305F;&#x306F;ECFP&#xFF08;EGFP-F&#x3068;ECFP-F&#xFF09;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3002;&#x77ED;&#x8DBE;&#x5C48;&#xFF08;FDB&#xFF09;&#x306E;&#x7B4B;&#x8089;&#x306F;&#x3001;pEGFP-F&#x3068;pECFP-F&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;in vivo&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D5;&#x30A1;&#x30EB;&#x30CD;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;TTS&#x3068;&#x8868;&#x9762;&#x819C;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002; DPA&#x3078;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x304B;&#x3089;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#x306B;&#x8D77;&#x56E0;&#x3059;&#x308B;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x306E;&#x5149;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306F;&#x3001;DiBAC&#xFF08;4&#xFF09;&#xFF08;5&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x8A18;&#x9332;&#x3055;&#x308C;&#x305F;FRET&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;QRET&#x904E;&#x6E21;&#x547D;&#x540D;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6D3B;&#x52D5;&#x96FB;&#x4F4D;&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8A98;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;QRET&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x30D4;&#x30FC;&#x30AF;DeltaF / F&#x306F;&#x3001;EGFP-F&#xFF08;3.6&#xFF05;&#x5BFE;7.1&#xFF05;&#xFF09;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;ECFP-F&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E;2&#x500D;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;FRET&#x306E;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x91CD;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3092;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306A;&#x30C7;&#x30E2;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x96FB;&#x5727;QRET&#x306E;&#x611F;&#x5EA6;&#x3068;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;FRET&#x306F;&#x3001;&#x975E;&#x7DDA;&#x5F62;&#x6210;&#x5206;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x73FE;&#x308C;&#x308B;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x30EC;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x5185;&#x306E;&#x8377;&#x96FB;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x8EE2;&#x5EA7;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002; DPA&#x306F;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x96FB;&#x6C17;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;QRET&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x96FB;&#x8377;&#x79FB;&#x52D5;&#x306E;&#x6642;&#x5B9A;&#x6570;&#x306E;&#x6700;&#x5927;&#x6642;&#x9593;&#x306F;0.6&#x30DF;&#x30EA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30E9;&#x30B8;&#x30A2;&#x30EB;&#x30B1;&#x30FC;&#x30D6;&#x30EB;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 28&#x30D1;&#x30FC;&#x30BB;&#x30F3;&#x30C8;&#x3068;&#x540C;&#x3058;&#x5927;&#x304D;&#x3055;DiBAC&#xFF08;4&#xFF09;&#xFF08;5&#xFF09;&#x5C55;&#x793A;DeltaF / F&#x306E;&#x632F;&#x5E45;&#x3067;&#x67D3;&#x8272;&#x3057;&#x305F;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x96FB;&#x4F4D;&#x306B;&#x5FDC;&#x3058;&#x3066;&#x8A18;&#x9332;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;FRET&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4E0A;&#x6607;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x3067;&#x306F;&#x3001;QRET&#x4FE1;&#x53F7;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x9045;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3068;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;FRET&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;1.6 ms&#x306E;&#x96FB;&#x8377;&#x79FB;&#x52D5;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6642;&#x5B9A;&#x6570;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;TTS&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x901F;&#x3044;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x200B;&#x200B;&#x3057;&#x3066;&#x89AA;&#x6CB9;&#x6027;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x4F7F;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x57FA;&#x790E;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x52D5;&#x7684;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x9AA8;&#x683C;&#x7B4B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;&#x6A2A;&#x7D30;&#x7BA1;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3092;&#x3001;FRET

&#xB450; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC804;&#xC555; &#xAC10;&#xC9C0; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; (FRET) &#xAC00;&#xB85C; &#xAD00; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; (TTS)&#xC640; &#xC131;&#xC778; &#xC950; &#xACE8;&#xACA9; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC758; &#xD45C;&#xBA74; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xB9C9; &#xBCC0;&#xD654; &#xAE30;&#xB85D; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. Farnesylated EGFP &#xB610;&#xB294; ECFP (EGFP-F&#xC640; ECFP F) &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC774;&#xAE30; &#xD798; &#xB4DC;&#xB294; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC640; &#xBE44; &#xD615;&#xAD11; (dipicrylamine [DPA]) &#xB610;&#xB294; &#xD615;&#xAD11; (oxonol &#xC5FC;&#xB8CC; &#xBE14;&#xB808;&#xBBF8;&#xC26C; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC218;&#xB77D;&#xC790;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; Dibac(4)(5))&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. PECFP F. pEGFP F&#xC640; in vivo electroporation&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; flexor digitorum brevis (FDB) &#xADFC;&#xC721; &#xD398; &#xD588;&#xB2E4; Farnesylated &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; TTS&#xC640; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xD604; &#xD588;&#xB2E4;. DPA &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xAD11; &#xC2E0;&#xD638; Dibac(4)(5)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAE30;&#xB85D; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xACFC;&#xB3C4; &#xAD6C;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; QRET &#xACFC;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0; &#xC120;&#xC815; &#xB410;&#xB2E4;. &#xD53C;&#xD06C;&#xC758; QRET &#xACFC;&#xB3C4; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC804;&#xC704; &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; elicited DeltaF/F ECFP F EGFP f 3.6% &#xB300; (7.1%)&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xB450; &#xBC88; &#xD07D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xC2A4;&#xD399;&#xD2B8;&#xB7FC; &#xC911;&#xBCF5;&#xC758; &#xC911;&#xC694;&#xC131;&#xC758; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB370;&#xBAA8;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC; &#xB808;&#xCF54;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBE44;&#xC120;&#xD615; &#xAD6C;&#xC131;&#xC73C;&#xB85C; &#xCDA9;&#xC804;&#xB41C; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xC804; &#xC88C;&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xD558;&#xB294; QRET &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xC555; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD588;&#xB2E4;. DPA, &#xC704;&#xD574; &#xBAA8;&#xB450; &#xC804;&#xAE30; &#xBC0F; QRET &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xCDA9;&#xC804; &#xC804; &#xCD5C;&#xB300;&#xD55C; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC0C1;&#xC218;&#xB294; 0.6 &#xC591; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xC2E0;&#xD638; DiBAC(4)(5) &#xC804;&#xC2DC;&#xB85C; &#xC5BC;&#xB8E9;&#xC9C4; DeltaF/F &#xC9C4;&#xD3ED; 28% &#xC815;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xC561;&#xC158; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0; &#xAE30;&#xB85D; &#xB41C; &#xBC29;&#xC0AC;&#xD615; &#xCF00;&#xC774;&#xBE14; &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC608;&#xCE21; &#xB41C; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0C1;&#xC2B9; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB294; QRET &#xC2E0;&#xD638; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB290;&#xB9BD;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xD604;&#xC7AC; &#xC608;&#xCE21; &#xD558; &#xACE0; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; 1.6 ms&#xC758; &#xCDA9;&#xC804; &#xC804; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC0C1;&#xC218;&#xAC00; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xBE60;&#xB978; &#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; TTS&#xC5D0; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB85C; &#xC62E;&#xACA8;&#xC9C0;&#xB294; &#xC774;&#xC628;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;.

&#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xB3D9;&#xC801; &#xBB34;&#xC11C; &#xC6CC; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xACE8;&#xACA9; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xAC00;&#xB85C; tubules&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xD638;.

Dos h&#xED;bridos de detecci&#xF3;n de voltaje de los sistemas basados &#x200B;&#x200B;en la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente (FRET) se utiliza para registrar los cambios de membrana potenciales en el sistema tubular transversal (TTS) y de las membranas superficiales de ratones adultos fibras del m&#xFA;sculo esquel&#xE9;tico. Farnesylated EGFP o ECFP (EGFP-F y ECFP F-) fueron utilizados como inm&#xF3;vil FRET donantes, y, o bien no fluorescente (dipicrylamine [DPA]) o fluorescente (oxonol colorante DiBAC (4) (5)) aniones lipof&#xED;licos se utilizaron como m&#xF3;vil aceptores de energ&#xED;a. Flexor corto de los dedos (FDB), los m&#xFA;sculos fueron transfectadas por electroporaci&#xF3;n in vivo con pEGFP-F y F-pECFP. Farnesiladas prote&#xED;nas fluorescentes se expresaron de manera eficiente en el TTS y las membranas de superficie. Dependientes de voltaje se&#xF1;ales &#xF3;pticas que resultan de la transferencia de energ&#xED;a de resonancia de las prote&#xED;nas fluorescentes a DPA fueron nombrados transitorios QRET, para distinguirlos de FRET transitorios grabados con DiBAC (4) (5). El pico DeltaF / F de los transitorios QRET provocados por la estimulaci&#xF3;n del potencial de acci&#xF3;n es dos veces mayor en las fibras que expresan ECFP-F como aquellos con EGFP-F (7,1% vs 3,6%). Estos datos proporcionan una demostraci&#xF3;n &#xFA;nica experimental de la importancia de la superposici&#xF3;n del espectro en FRET. La sensibilidad de voltaje QRET y FRET se&#xF1;ales se demostr&#xF3; que corresponden a la translocaci&#xF3;n dependiente de la tensi&#xF3;n de los aceptores cargados, que se manifiestan como componentes no lineales en los registros actuales. Para DPA, tanto los datos el&#xE9;ctricos y QRET fueron predichas por las simulaciones de cables radiales modelo en el que el tiempo m&#xE1;ximo constante de desplazamiento de carga fue de 0,6 ms. FRET se&#xF1;ales registradas en respuesta a los potenciales de acci&#xF3;n en las fibras te&#xF1;idas con DiBAC (4) (5) presentan DeltaF / F amplitud tan grande como el 28%, pero su fase ascendente era m&#xE1;s lento que los de las se&#xF1;ales de QRET. Los modelos de simulaci&#xF3;n requieren una constante de tiempo para el desplazamiento de carga de 1,6 m con el fin de predecir la actual y FRET datos. Nuestros resultados proporcionan la base para el uso potencial de los iones lipof&#xED;licas como herramientas para poner a prueba para una r&#xE1;pida dependientes de voltaje cambios conformacionales de las prote&#xED;nas de membrana en el TTS.

Dependiente de la tensi&#xF3;n din&#xE1;mica de FRET se&#xF1;ales procedentes de los t&#xFA;bulos transversales de las fibras musculares esquel&#xE9;ticas de mam&#xED;feros

&#x91CD;&#x590D;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7684;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x808C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x4F1A;&#x5BFC;&#x81F4;&#x51CF;&#x5C11;&#x8DE8;&#x819C; K(+) &#x6E10;&#x53D8;&#x3002;&#x7531;&#x6B64;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&#x819C;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x62DF;&#x5728;&#x808C;&#x8089;&#x75B2;&#x52B3;&#x53D1;&#x75C5;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x91CD;&#x8981;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x63D0;&#x9AD8;&#x80DE;&#x5916; K(+) K(+)(O) &#x6D53;&#x5EA6; ([&#x81F3; 10 &#x6BEB;&#x7C73; K(+)](O)) &#x589E;&#x5F3A;&#x98A4;&#x6410;&#x90E8;&#x961F;&#x4F11;&#x606F;&#x597D;&#x4E86;&#x4E24;&#x6816;&#x7C7B;&#x548C;&#x54FA;&#x4E73;&#x7C7B;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E00;&#x53CC;&#x7684;&#x51E1;&#x58EB;&#x6797;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5411;&#x540C;&#x65F6;&#x8BB0;&#x5F55;&#x52A8;&#x4F5C;&#x7535;&#x4F4D; (AP)&#xFF0C;&#x4ECE;&#x7ECF;&#x77AC;&#x53D8;&#x4F11;&#x606F;&#x9752;&#x86D9;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7531;&#x5355;&#x4E00;&#x548C;&#x7834;&#x4F24;&#x98CE;&#x523A;&#x6FC0; (10 &#x8109;&#x51B2; 100 Hz&#xFF09; &#x6FC0;&#x6D3B;&#x5728;&#x5404;&#x79CD; [K(+)](O) &#x548C;&#x819C;&#x7535;&#x4F4D;&#x3002;Depolarization &#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&#x7535;&#x6D41;&#x6CE8;&#x5165;&#x6216;&#x63D0;&#x51FA; [K(+](O) &#x5236;&#x4F5C;&#x5728;&#x9759;&#x606F;&#x65F6; [&#x7ECF;] &#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x7ECF;&#x77AC;&#x53D8;&#x5355;&#x4E00;&#x523A;&#x6FC0;&#x88AB;&#x5F3A;&#x5316;&#x5230;-60-80 &#x7684;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x7684; mV &#x4F46;&#x660E;&#x663E;&#x6CAE;&#x4E27;&#x7684;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7684;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x3002;&#x957F;&#x65F6;&#x7A0B;&#x589E;&#x5F3A;&#x88AB;&#x53CD;&#x6BD4;&#x7684;&#x632F;&#x5E45;&#x3001; &#x8FC7;&#x51B2;&#x548C; Ap &#x6301;&#x7EED;&#x65F6;&#x95F4;&#x51CF;&#x5C11;&#x3002;&#x8BF1;&#x53D1; 100 Hz &#x5217;&#x8F66;&#x4E00;&#x8109;&#x7ECF;&#x77AC;&#x53D8;&#x627E;&#x5230;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7684;&#x6548;&#x679C;&#x3002;&#x6291;&#x90C1;&#x6216;&#x5757;&#x7684;&#x77AC;&#x6001;&#x54CD;&#x5E94; 100 Hz &#x5217;&#x8F66;&#x7684;&#x4E8C;&#x81F3;&#x5341;&#x8109;&#x51B2;&#x7ECF;&#x5728;&#x5C0F; depolarizations&#xFF0C;&#x770B;&#x5230;&#x4F7F;&#x7528;&#x5355;&#x4E2A;&#x523A;&#x6FC0;&#x65F6;&#x53D1;&#x73B0;&#x7EA2;&#x6F6E;&#x3002;&#x706B;&#x8F66;&#x6CBF;&#x7ECF;&#x77AC;&#x53D8;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x90FD;&#x4E0E;&#x53D7;&#x635F;&#x6216;&#x6D41;&#x4EA7;&#x7684; Ap &#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x63D0;&#x9AD8; [&#x81F3; 10 &#x6BEB;&#x7C73; K(+)](O) &#x5F3A;&#x5316;&#x7ECF;&#x77AC;&#x53D8;&#x5355;&#x4E00;&#x548C;&#x7834;&#x4F24;&#x98CE;&#x7684;&#x523A;&#x6FC0;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x63D0;&#x9AD8; [&#x81F3; 15 &#x6BEB;&#x7C73;&#x7684; K(+)](O) &#x660E;&#x663E;&#x90C1;&#x95F7;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x54CD;&#x5E94;&#x3002;&#x8D85;&#x6781;&#x5316; 10 &#x6BEB;&#x7C73;&#x7ECF;&#x77AC;&#x53D8;&#xFF0C;&#x5BF9; K(+)(O) &#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x90A3;&#x4E9B; 15 &#x6BEB;&#x7C73; K(+)(O)&#xFF0C;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x5B8C;&#x5168;&#x9006;&#x8F6C;&#x3002;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x529B;&#x7684; K(+)(O) &#x53EF;&#x80FD;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x76F8;&#x5173;&#x66F4;&#x6539;&#x5728;&#x9759;&#x606F; [&#x7ECF;] &#x548C;&#x7ECF; 10 &#x6BEB;&#x7C73;&#x7684; potentiating &#x5F71;&#x54CD;&#x91CA;&#x653E;&#xFF0C;&#x5E76;&#x989D;&#x5916;&#x673A;&#x5236;&#x5BF9;&#x90E8;&#x961F;&#x4EE3;&#x53EF;&#x80FD;&#x53C2;&#x4E0E; 15 &#x6BEB;&#x7C73; K(+)(O) &#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

&#x5BF9; Ca (2 +) &#x77AC;&#x53D8;&#x7684;&#x5FEB;&#x901F;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x808C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x819C;&#x53BB;&#x6781;&#x5316;&#x548C;&#x80DE;&#x5916; [K(+)] &#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x808C;&#x8089;&#x75B2;&#x52B3;&#x6240;&#x6D89;&#x7684;&#x95EE;&#x9898;&#x3002;

Repetitive activation of skeletal muscle fibers leads to a reduced transmembrane K(+) gradient. The resulting membrane depolarization has been proposed to play a major role in the onset of muscle fatigue. Nevertheless, raising the extracellular K(+) K(+)(O) concentration ([K(+)](O)) to 10 mM potentiates twitch force of rested amphibian and mammalian fibers. We used a double Vaseline gap method to simultaneously record action potentials (AP) and Ca(2+) transients from rested frog fibers activated by single and tetanic stimulation (10 pulses, 100 Hz) at various [K(+)](O) and membrane potentials. Depolarization resulting from current injection or raised [K(+](O) produced an increase in the resting [Ca(2+)]. Ca(2+) transients elicited by single stimulation were potentiated by depolarization from -80 to -60 mV but markedly depressed by further depolarization. Potentiation was inversely correlated with a reduction in the amplitude, overshoot and duration of APs. Similar effects were found for the Ca(2+) transients elicited by the first pulse of 100 Hz trains. Depression or block of Ca(2+) transient in response to the 2nd to 10th pulses of 100 Hz trains was observed at smaller depolarizations as compared to that seen when using single stimulation. Changes in Ca(2+) transients along the trains were associated with impaired or abortive APs. Raising [K(+)](O) to 10 mM potentiated Ca(2+) transients elicited by single and tetanic stimulation, while raising [K(+)](O) to 15 mM markedly depressed both responses. The effects of 10 mM K(+)(O) on Ca(2+) transients, but not those of 15 mM K(+)(O), could be fully reversed by hyperpolarization. The results suggests that the force potentiating effects of 10 mM K(+)(O) might be mediated by depolarization dependent changes in resting [Ca(2+)] and Ca(2+) release, and that additional mechanisms might be involved in the effects of 15 mM K(+)(O) on force generation.

Effects of membrane depolarization and changes in extracellular [K(+)] on the Ca (2+) transients of fast skeletal muscle fibers. Implications for muscle fatigue.

Activation r&eacute;p&eacute;titive des fibres musculaires squelettiques entra&icirc;ne un gradient transmembranaire r&eacute;duit de k. La d&eacute;polarisation de la membrane qui en r&eacute;sulte a &eacute;t&eacute; propos&eacute;e de jouer un r&ocirc;le majeur dans l&#39;apparition de la fatigue musculaire. N&eacute;anmoins, &eacute;lever la concentration extracellulaire de k K(+)(O) ([K(+)](O)) &agrave; 10 mM potentialise force de la contraction des amphibiens repos&eacute;e et fibres chez les mammif&egrave;res. Nous avons utilis&eacute; une double m&eacute;thode de foss&eacute; Vaseline pour enregistrer simultan&eacute;ment les potentiels d&#39;action (AP) et Ca(2+) transitoires de reposaient fibres grenouille activ&eacute;s par la stimulation de l&#39;unique et t&eacute;tanique (10 impulsions, 100Hz) &agrave; divers [potentiels de membrane et K(+)](O). D&eacute;polarisation r&eacute;sultant de l&#39;injection de courant ou d&eacute;clench&eacute; [K(+](O) produit une augmentation de la mise au repos [Ca(2+)]. Ca(2+) transitoires induites par la stimulation unique sont potentialis&eacute;es par une d&eacute;polarisation de -80 &agrave; -60 mV mais fortement d&eacute;prim&eacute; par une d&eacute;polarisation plue. Potentialisation &eacute;tait inversement corr&eacute;l&eacute;e avec une r&eacute;duction de l&#39;amplitude, la remise des gaz et la dur&eacute;e des AP. Des effets similaires ont &eacute;t&eacute; trouv&eacute;s pour les transitoires de Ca(2+) provoqu&eacute;es par la premi&egrave;re impulsion de trains de 100 Hz. D&eacute;pression ou un bloc de Ca(2+) transitoire en r&eacute;ponse aux impulsions des 2e &agrave; la 10e des trains 100Hz a &eacute;t&eacute; observ&eacute;e &agrave; d&eacute;polarisations plus petites par rapport &agrave; celle observ&eacute;e lors de l&#39;utilisation de la stimulation unique. Changements transitoires de Ca(2+) le long des trains &eacute;taient associ&eacute;s &agrave; APs avec facult&eacute;s affaiblies ou avort&eacute;es. &Eacute;lever [K(+)](O) &agrave; 10 mM potentialis&eacute;e Ca(2+) transitoires induites par la stimulation unique et t&eacute;tanique, tout en &eacute;levant [K(+)](O) 15 mm nettement diminu&eacute; les deux r&eacute;ponses. Les effets de 10 mM K(+)(O) sur Ca(2+) transitoires, mais pas celles de 15 mM K(+)(O), peuvent &ecirc;tre compl&egrave;tement renvers&eacute;es par une hyperpolarisation. Les r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que les force des effets potentiateurs de 10 mM K(+)(O) pourrait &ecirc;tre m&eacute;di&eacute;e par la d&eacute;polarisation des changements d&eacute;pendant au repos [Ca(2+)] et Ca(2+) de sortie, et que des m&eacute;canismes suppl&eacute;mentaires pourraient &ecirc;tre impliqu&eacute;s dans les effets de 15 mM K(+)(O) sur pied d&#39;une force.

Effets de la d&eacute;polarisation de la membrane et les changements dans extracellulaire [k] sur les transitoires de Ca (2 +) des fibres musculaires squelettiques rapide. Implications pour la fatigue musculaire.

Wiederholte Aktivierung von skelettartiger Muskel Fasern f&uuml;hrt zu einer reduzierten Transmembran K(+) Farbverlauf. Die resultierende Membran-Depolarisation ist vorgeschlagen worden, eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Muskelerm&uuml;dung zu spielen. Dennoch heben die extrazellul&auml;re K(+) K(+)(O) Konzentration ([K(+)](O)) bis 10 mM Spurenelement zucken Kraft ausgeruht Amphibien und S&auml;ugetieren Fasern. Wir verwendeten eine doppelte Vaseline L&uuml;cke-Methode, um gleichzeitig aufzeichnen Aktionspotentiale (AP) und Ca(2+)-Transienten von ruhte Frosch Fasern aktiviert durch Einzel- und tetanischen Stimulation (10 Impulse, 100 Hz) bei verschiedenen [K(+)](O) und Membran-Potenziale. Depolarization aus Stromeinspeisung oder ausgel&ouml;st [K(+](O) sogar einen Anstieg in der Ruhe [Ca(2+)]. Ca(2+)-Transienten, die durch einzelne Stimulation hervorgerufen wurden durch Depolarisierung von-80 bis-60 potenzierte mV aber deutlich deprimiert &uuml;ber weitere Depolarisierung. Potenzierung war umgekehrt mit einer Verringerung der Amplitude, der &Uuml;berschreitung und der Dauer der APs korreliert. &Auml;hnliche Effekte wurden f&uuml;r die Ca(2+)-Transienten, hervorgerufen durch den ersten Impuls 100Hz Z&uuml;ge gefunden. Depression oder die Sperrung der Ca(2+) vor&uuml;bergehend als Reaktion auf die 2. &ndash; 10. Impulse von 100 Hz Z&uuml;gen war bei kleineren Depolarizations im Vergleich zu, die bei der Verwendung von einzelnen Stimulierung zu sehen beobachtet. &Auml;nderungen in Ca(2+) Transienten entlang der Z&uuml;ge waren wertgemindert oder abortive APs zugeordnet. Ausl&ouml;sen [K(+)](O) bis 10 mM potenzierte Ca(2+) Transienten hervorgerufen durch Einzel- und tetanischen Stimulation, beim Anheben [K(+)](O) bis 15 mM deutlich dr&uuml;ckten beide Antworten. Die Auswirkungen der 10 mM K(+)(O) auf Ca(2+) Transienten, aber nicht auf die 15 mM K(+)(O), konnte vollst&auml;ndig durch Hyperpolarisation r&uuml;ckg&auml;ngig gemacht werden. Die Ergebnisse darauf hin, dass lassen Sie die Kraft potenzierenden Wirkungen von 10 mM, die K(+)(O) durch Depolarisation abh&auml;ngige &Auml;nderungen in Ruhe [Ca(2+)] und Ca(2+) vermittelt werden k&ouml;nnten, und zus&auml;tzliche Mechanismen an den Wirkungen von 15 mM K(+)(O) auf Streitkr&auml;fteaufwuchs beteiligt werden k&ouml;nnte.

Auswirkungenauf die Ca (2 +)-Transienten schnell skelettartiger Muskel Fasern Membran-Depolarisierung und Ver&auml;nderungen der extrazellul&auml;ren [K(+)]. Auswirkungen auf die Muskelerm&uuml;dung.

Attivazione ripetitiva delle fibre del muscolo scheletrici conduce ad un ridotto gradiente transmembrana K(+). La conseguente depolarizzazione della membrana &egrave; stato proposto di svolgere un ruolo importante nell&#39;insorgenza dell&#39;affaticamento muscolare. Tuttavia, aumentare la concentrazione extracellulare di K(+) K(+)(O) ([K(+)](O)) a 10 mM potenzia forza contrazione delle fibre mammiferi e anfibi riposato. Abbiamo utilizzato un doppio metodo di gap vaselina per contemporaneamente registrare potenziali d&#39;azione (AP) e Ca(2+) transitori da riposato fibre rana attivati dalla stimolazione tetanica e singola (10 impulsi, 100 Hz) a vari [K(+)](O) e membrana potenziali. Depolarizzazione derivanti dall&#39;iniezione di corrente o generato [K(+](O) prodotto un aumento del riposo [Ca(2+)]. CA(2+) transitori hanno suscitati dalla sola stimolazione furono potenziate da depolarizzazione da -80 a -60 mV ma marcatamente depresso da ulteriore depolarizzazione. Potenziamento &egrave; stata inversamente correlata con una riduzione nell&#39;ampiezza, sovraelongazione e la durata dell&#39;APs. Effetti simili sono stati trovati per i transitori di Ca(2+) ha suscitati dal primo impulso dei treni 100 Hz. Depressione o blocco di Ca(2+) transitori in risposta agli impulsi 2 &deg; al 10 &deg; dei treni 100 Hz &egrave; stato osservato a depolarizations pi&ugrave; piccoli rispetto a che visto quando si utilizza la sola stimolazione. Cambiamenti nei transitori di Ca(2+) lungo i treni sono stati associati con APs compromessa o abortivo. Sensibilizzazione [K(+)](O) a 10 mM potenziate Ca(2+) transitori hanno suscitati dalla stimolazione tetanica e singola, mentre alzando [K(+)](O) a 15 mM marcatamente depresso entrambe le risposte. Gli effetti di 10 mM K(+)(O) su Ca(2+) transitori, ma non quelli di 15 mM K(+)(O), potrebbe essere completamente invertiti hyperpolarization. I risultati suggeriscono che rilasciano gli effetti cumulo di forza di 10 mM K(+)(O) potrebbe essere mediata da depolarizzazione modifiche dipendenti in riposo [Ca(2+)] e Ca(2+), e che meccanismi aggiuntivi potrebbero essere coinvolto negli effetti di 15 mM K(+)(O) sulla generazione di forza.

Effetti di depolarizzazione della membrana e cambiamenti in extracellulare [K(+)] sui transitori di Ca (2++) delle fibre muscolari scheletriche veloce. Implicazioni per l&#39;affaticamento muscolare.

&#x9AA8;&#x683C;&#x7B4B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;&#x53CD;&#x5FA9;&#x7684;&#x306A;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x524A;&#x6E1B;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x306B;&#x65BC;&#x3044;&#x3066;&#x30B0;&#x30E9;&#x30C7;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B; &#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x7B4B;&#x8089;&#x75B2;&#x52B4;&#x306E;&#x767A;&#x75C7;&#x3067;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x63D0;&#x6848;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;([K(+)](O)) 10 mM &#x306B;&#x4F11;&#x990A;&#x306E;&#x4E21;&#x751F;&#x985E;&#x3068;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5358;&#x53CE;&#x7E2E;&#x5F35;&#x529B;&#x5897;&#x5F37;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x306B;&#x65BC;&#x3044;&#x3066; K(+)(O) &#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x4E0A;&#x3052;&#x308B;&#x6211;&#x3005; &#x30C0;&#x30D6;&#x30EB; &#x30EF;&#x30BB;&#x30EA;&#x30F3; &#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x65B9;&#x5F0F;&#x306B;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x8A18;&#x9332;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x96FB;&#x4F4D; (AP) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3001;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x4F11;&#x990A;&#x30AB;&#x30A8;&#x30EB;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E; 1 &#x3064;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30C6;&#x30BF;&#x30CC;&#x30B9;&#x523A;&#x6FC0; &#xFF08;10 &#x30D1;&#x30EB;&#x30B9;&#x3001;100 Hz&#xFF09; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x69D8;&#x3005; &#x306A; [K(+)](O) &#x3068;&#x819C;&#x96FB;&#x4F4D;&#x3067;&#x3002;&#x96FB;&#x6D41;&#x6CE8;&#x5165;&#x306B;&#x8D77;&#x56E0;&#x89E3;&#x6D88;&#x5EA6;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x767A;&#x751F; [K(+](O) &#x751F;&#x7523; [&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;] &#x4F11;&#x61A9;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3002;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5358;&#x4E00;&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x5897;&#x5F37;&#x3057;&#x305F;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;-80 &#x304B;&#x3089;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x306B;-60 mV &#x304C;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x843D;&#x3061;&#x8FBC;&#x3093;&#x3067;&#x3002;&#x5897;&#x5F37;&#x306F;&#x3001;&#x632F;&#x5E45;&#x3001;&#x30AA;&#x30FC;&#x30D0;&#x30FC; &#x30B7;&#x30E5;&#x30FC;&#x30C8;&#x3068; APs &#x306E;&#x671F;&#x9593;&#x524A;&#x6E1B;&#x9006;&#x76F8;&#x95A2;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x540C;&#x69D8;&#x306E;&#x52B9;&#x679C; 100 Hz &#x5217;&#x8ECA;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30D1;&#x30EB;&#x30B9;&#x3067;&#x8A98;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3046;&#x3064;&#x75C5;&#x3084;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x904E;&#x6E21; 100 Hz &#x306E;&#x5217;&#x8ECA;&#x306E; 2 &#x301C; 10 &#x30D1;&#x30EB;&#x30B9;&#x3078;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3067;&#x306E;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x523A;&#x6FC0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x3092;&#x898B;&#x3066;&#x3068;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x5206;&#x6975;&#x3092;&#x8A8D;&#x3081;&#x305F;&#x3002;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x5217;&#x8ECA;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x3066;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x969C;&#x5BB3;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5931;&#x6557;&#x306B;&#x7D42;&#x308F;&#x3063;&#x305F;&#x306E; Ap &#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x8ABF;&#x9054; [K(+)](O) &#xFF5E; 10 mM &#x3092;&#x8352;&#x3052;&#x308B;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x3068;&#x30C6;&#x30BF;&#x30CC;&#x30B9;&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8A98;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x5897;&#x5F37;&#x3057;&#x305F; [15 mm K(+)](O) &#x306F;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x843D;&#x3061;&#x8FBC;&#x3093;&#x3067;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B; 10 mM K(+)(O) &#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x4E0A;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x304C;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E; 15 mM K(+)(O)&#x3001;&#x904E;&#x5206;&#x6975;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x9006;&#x306B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D50;&#x679C;&#x3067;&#x306F; 10 mM &#x306E; K(+)(O) [&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;] &#x5B89;&#x9759;&#x6642;&#x306E;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x4F9D;&#x5B58;&#x5909;&#x5316;&#x3068;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x306E;&#x529B;&#x5897;&#x5F37;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x3057;&#x3001;&#x8FFD;&#x52A0;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0; 15 mM K(+)(O) &#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306E;&#x529B;&#x767A;&#x751F;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Ca (2++) &#x904E;&#x6E21;&#x9AD8;&#x901F;&#x9AA8;&#x683C;&#x7B4B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;&#x8131;&#x5206;&#x6975;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916; [&#x306B;&#x65BC;&#x3044;&#x3066;] &#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x7B4B;&#x75B2;&#x52B4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x542B;&#x610F;&#x3002;

&#xACE8;&#xACA9; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC758; &#xBC18;&#xBCF5;&#xC801;&#xC778; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xAC10;&#xC18C; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; K(+) &#xADF8;&#xB77C;&#xB370;&#xC774;&#xC158;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xC5B4;&#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8; &#xACB0;&#xACFC; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; depolarization &#xADFC;&#xC721; &#xD53C;&#xB85C;&#xC758; &#xBC1C;&#xBCD1;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, ([10mm K(+)](O)) potentiates &#xD734;&#xC2DD;&#xB41C; &#xC591;&#xC11C;&#xB958;&#xC640; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC12C;&#xC720; &#xD2B8; &#xC704;&#xCE58; &#xD798; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; K(+) K(+)(O) &#xB18D;&#xB3C4; &#xB192;&#xC774;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xAE30;&#xB85D; &#xC791;&#xC5C5; &#xD6C4;&#xBCF4; (AP)&#xB97C; &#xB354;&#xBE14; &#xBC14; &#xC140; &#xB9B0; &#xAC04;&#xACA9; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; Ca(2+) &#xACFC;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD734;&#xC2DD;&#xC744; &#xAC1C;&#xAD6C;&#xB9AC; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; [K(+)](O)&#xC640; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC804;&#xC704; (10 &#xD384;&#xC2A4;, 100 hz&#xC5D0;&#xC11C;) &#xB2E8;&#xC77C; &#xBC0F; tetanic &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;. &#xD604;&#xC7AC; &#xBD84;&#xC0AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xB798;&#xD55C; depolarization &#xB610;&#xB294; &#xC81C;&#xAE30; [K(+](O) &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD734;&#xC2DD; [Ca(2+)]&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC99D;&#xAC00;. Ca(2+) &#xACFC;&#xB3C4; &#xD55C; &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; elicited depolarization-80&#xC5D0;&#xC11C;-60&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; potentiated &#xD588;&#xB2E4; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xB354; depolarization &#xC5EC; &#xC6B0;&#xC6B8; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; mV. Potentiation&#xB294; &#xBC18;&#xBE44;&#xB840; &#xC9C4;&#xD3ED; &#xC624;&#xBC84; &#xC29B;&#xACFC; Aps&#xC758; &#xAE30;&#xAC04;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xAC10;&#xC18C;&#xC640; &#xC0C1;&#xAD00; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xD6A8;&#xACFC; 100hz &#xC5F4;&#xCC28;&#xC758; &#xCCAB; &#xD384;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; elicited Ca(2+) &#xACFC;&#xB3C4; &#xD2B9;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xC6B8;&#xC99D; &#xB610;&#xB294; ca(2+)&#xC758; 100 Hz &#xC5F4;&#xCC28; 2 10 &#xD384;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACFC;&#xB3C4; &#xBE14;&#xB85D; &#xBCF8; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC790;&#xADF9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB354; &#xC791;&#xC740; depolarizations&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC5F4;&#xCC28;&#xB97C; &#xB530;&#xB77C; Ca(2+) &#xACFC;&#xB3C4; &#xBCC0;&#xD654; &#xC7A5;&#xC560; &#xB610;&#xB294; &#xC870;&#xC0B0; Ap&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC774; [10mm K(+)](O) potentiated Ca(2+) &#xACFC;&#xB3C4; &#xBAA8;&#xAE08; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBC0F; tetanic &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; elicited [15 m m K(+)](O)&#xB294; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xB450; &#xC751;&#xB2F5; &#xC6B0;&#xC6B8;. 10Mm K(+)(O) Ca(2+) &#xACFC;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xADF8; 15 mM K(+)(O), hyperpolarization &#xD558; &#xC5EC; &#xC644;&#xBCBD; &#xD558; &#xAC8C; &#xC804;&#xD658;&#xD560; &#xC218; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xACB0;&#xACFC; K(+)(O) [Ca(2+)] &#xC26C;&#xACE0; depolarization &#xC885;&#xC18D; &#xBCC0;&#xD654; &#xBC0F; ca(2+)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; &#xC218; 10 m M&#xC758; &#xAC15;&#xC81C; potentiating &#xD6A8;&#xACFC; &#xD574;&#xC81C; &#xD798; &#xC0DD;&#xC131;&#xC5D0; &#xCD94;&#xAC00;&#xC801;&#xC778; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; 15mm K(+)(O)&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB420; &#xC218;&#xB3C4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBE60;&#xB978; &#xACE8;&#xACA9; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC758; Ca (2 +) &#xACFC;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xB9C9; depolarization&#xC640; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; [K(+)]&#xC5D0; &#xBCC0;&#xD654;&#xC758; &#xC601;&#xD5A5;. &#xADFC;&#xC721; &#xD53C;&#xB85C; &#xB300; &#xD55C; &#xC758;&#xBBF8;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Activaci&oacute;n repetitiva de fibras de m&uacute;sculo esquel&eacute;ticas conduce a un gradiente transmembrana reducci&oacute;n de capacidad. La despolarizaci&oacute;n de la membrana resultante ha comenzado a desempe&ntilde;ar un papel importante en la aparici&oacute;n de fatiga muscular. Sin embargo, aumentar la concentraci&oacute;n extracelular de k K(+)(O) ([K(+)](O)) a 10 mM potencia fuerza de contracci&oacute;n de fibras mam&iacute;feras y anfibios descansados. Utilizamos un m&eacute;todo doble de brecha de vaselina a potenciales de acci&oacute;n al mismo tiempo r&eacute;cord (AP) y CA transitorios de descansaban fibras rana activadas por estimulaci&oacute;n tet&aacute;nica y sola (10 impulsos, 100Hz) en varios [K(+)](O) y membrana potenciales. Despolarizaci&oacute;n resultando de la inyecci&oacute;n actual o levantado [K(+](O) produjo un aumento en la reclinaci&oacute;n [CA]. CA transitorios provocadas por estimulaci&oacute;n sola fueron potenciados por despolarizaci&oacute;n de -80 a -60 mV pero notablemente deprimido por despolarizaci&oacute;n m&aacute;s. Potenciaci&oacute;n se correlacion&oacute; inversamente con una reducci&oacute;n de la amplitud, el rebasamiento y la duraci&oacute;n de la APs. Efectos similares fueron encontrados por los transitorios de CA sacados por el primer pulso de 100 Hz trenes. Depresi&oacute;n o bloque de CA transitoria en respuesta a los impulsos del 2 al 10 de trenes de 100 Hz se observ&oacute; en despolarizaciones m&aacute;s peque&ntilde;as en comparaci&oacute;n con el ve cuando usando el &uacute;nico. Cambios en CA transitorios a lo largo de los trenes se asociaron con APs deterioradas o abortivas. Cr&iacute;a [K(+)](O) a 10 mM potencia CA transitorios provocadas por estimulaci&oacute;n tet&aacute;nica y sola, aumentando [K(+)](O) a 15 mM notablemente deprimido ambas respuestas. Los efectos de 10 mM K(+)(O) en CA transitorios, pero no los de 15 mM K(+)(O), podr&iacute;an revertirse completamente por hiperpolarizaci&oacute;n. Los resultados sugieren que los efectos de refuerzo de fuerza 10 mm K(+)(O) podr&iacute;a estar mediado por cambios dependientes de despolarizaci&oacute;n en la reclinaci&oacute;n [CA] y CA liberan, y que mecanismos adicionales podr&iacute;an estar implicados en los efectos de 15 mM K(+)(O) en la generaci&oacute;n de fuerza.

Efectos de despolarizaci&oacute;n de la membrana y cambios en extracelular [k] en los transitorios de Ca (2 +) de fibras de m&uacute;sculo esquel&eacute;ticos r&aacute;pido. Implicaciones para la fatiga muscular.

&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (EGFP) &#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;-&#x6807;&#x8BB0; &alpha;1sDHPR &#x53D8;&#x79CD;&#x5BF9; Ca2 + &#x7535;&#x6D41; &#xFF08;ICa&#xFF09; &#x6536;&#x53D6;&#x8FD0;&#x52A8; (Q) &#x548C; SR Ca2 + &#x91CA;&#x653E;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x682A;&#x6210;&#x5E74;&#x5C0F;&#x9F20;&#x7684;&#x808C;&#x8089;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x3002;&#x5C48;&#x808C;&#x8171;&#x77ED; (FDB) &#x808C;&#x808C;&#x8089;&#x7531;&#x4F53;&#x5185;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x8F6C;&#x67D3;&#x4E86;&#x8D28;&#x7C92;&#x7F16;&#x7801;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-&alpha;1sDHPR-wt &#x548C;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-&alpha;1sDHPR-T935Y (&#x4F0A;&#x62C9;&#x5730;&#x5E73;&#x4E0D;&#x654F;&#x611F;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;)&#x3002;&#x53CC;&#x5149;&#x5B50;&#x6FC0;&#x5149;&#x626B;&#x63CF;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C; &#xFF08;TPLSM&#xFF09; &#x7528;&#x4E8E;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x800C; ICa&#x3001; Q &#x548C; Ca2 + &#x91CA;&#x653E;&#x4E86;&#x7814;&#x7A76;&#x80BA;&#x9759;&#x8109;&#x548C;&#x5149;&#x5B66;&#x7535;&#x538B;&#x94B3;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7684;&#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x3002;TPLSM &#x56FE;&#x50CF;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0; &alpha;1sDHPR &#x6B63;&#x786E;&#x7684;&#x5BF9;&#x8C61;&#x662F;&#x6A2A;&#x5411;&#x7684;&#x7BA1;&#x72B6;&#x7CFB;&#x7EDF; (TTS)&#x3002;&#x8F6C;&#x67D3;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7684;&#x7C97;&#x63D0;&#x53D6;&#x7269;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#x6CD5;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x5584;&#x610F;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-&alpha;1sDHPR-wt &#x6570;&#x91CF;&#x76F8;&#x5F53;&#x4E8E;&#x672C;&#x673A; &alpha;1sDHPR &#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x53D8;&#x79CD; &#xFF08;&alpha;1sDHPR&#xFF09; &#x4E8C;&#x6C22;&#x5421;&#x5576;&#x7C7B;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684; &alpha; &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x9020;&#x6210; Q &sim;50%&#x7684;&#x589E;&#x957F;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60CA;&#x8BB6;&#x5E76;&#x4E0D;&#x5F71;&#x54CD;&#x6700;&#x5927; Ca2 + &#x7535;&#x5BFC; (&#x67AA;&#x652F;) &#x4E5F; SR Ca2 + &#x91CA;&#x653E;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5982;&#x6B64;&#xFF0C;&#x8868;&#x8FBE;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-&alpha;1sDHPR-T935Y &#x7EA4;&#x7EF4;&#x5C55;&#x51FA;&#x8FBE;&#x4F0A;&#x62C9;&#x5730;&#x5E73;&#x4E0D;&#x533A;&#x5206; ICa (ICa ins) &#x4E0E;&#x6743;&#x5229;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x76F8;&#x6BD4;&#xFF0C;&#x5728;&#x63A7;&#x5236;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x4E2D;&#x7684; 70%&#x3002;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;Qand SRCa2 + &#x91CA;&#x653E;&#x8FD8;&#x663E;&#x793A;&#x53F3;&#x8F6C;&#x5411;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x8868;&#x8FBE;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-&alpha;1sDHPR-T935Y&#x3002;&#x4E0E;&#x4E4B;&#x76F8;&#x53CD;&#x4E2D;, &#x70B9;&#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x67AA;&#x652F;&#x7BA1;&#x5236;&#x6CD5; &#x300B;&#xFF0C;Q &#x548C; Ca2 + &#x7684;&#x91CA;&#x653E;&#x5E76;&#x4E0D;&#x6709;&#x522B;&#x4E8E;&#x63A7;&#x5236;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x6574;&#x4F53;&#x8868;&#x8FBE;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;-&alpha;1sDHPR-&#x586B;&#x5145;&#x7269;&#x7684;&#x7EA4;&#x7EF4;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0; &alpha;1sDHPRs &#x662F;&#x6B63;&#x786E;&#x7684;&#x8D29;&#x8FD0;&#x548C; TTS &#x819C;&#xFF0C;&#x5728;&#x63D2;&#x5165;&#x548C;&#x53EF;&#x89C2;&#x7684;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5BFC;&#x7535; Ca2 + mworks &#x6E20;&#x9053;&#x80FD;&#x591F;&#x751F;&#x7406;&#x63A7;&#x5236;&#x91CA;&#x653E; Ca2 + &#x7684; sr&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x770B;&#x4F3C;&#x5408;&#x7406;&#x7684;&#x5FC5;&#x7136;&#x7ED3;&#x679C;&#x662F;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684; &alpha;1sDHPR &#x57FA;&#x56E0;&#x53D8;&#x5F02;&#x5BFC;&#x81F4;&#x66F4;&#x6362;&#x7684;&#x672C;&#x673A;&#x6E20;&#x9053;&#x4E0E;&#x5170;&#x5C3C;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53; 1 &#xFF08;RyR1&#xFF09;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x8868;&#x660E;&#x5728;&#x6210;&#x4EBA;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x808C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x9ED1;&#x793E;&#x4F1A;&#x5206;&#x5B50;&#x6539;&#x9020;&#x7684;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x8FDB;&#x884C;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;

&#x529F;&#x80FD;&#x901A;&#x9053;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0; 1sDHPR &#x6210;&#x5E74;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x808C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x3002;

We investigated the effects of the overexpression of two enhanced green fluorescent protein (EGFP)-tagged Î±1sDHPR variants on Ca2+ currents (ICa), charge movements (Q) and SR Ca2+ release of muscle fibres isolated from adult mice. Flexor digitorum brevis (FDB)muscles were transfected by in vivo electroporation with plasmids encoding for EGFP-Î±1sDHPR-wt and EGFP-Î±1sDHPR-T935Y (an isradipine-insensitive mutant). Two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) was used to study the subcellular localization of transgenic proteins, while ICa, Q and Ca2+ release were studied electrophysiologically and optically under voltage-clamp conditions. TPLSM images demonstrated that most of the transgenic Î±1sDHPR was correctly targeted to the transverse tubular system (TTS). Immunoblotting analysis of crude extracts of transfected fibres demonstrated the synthesis of bona fide transgenic EGFP-Î±1sDHPR-wt in quantities comparable to that of native Î±1sDHPR. Though expression of both transgenic variants of the alpha subunit of the dihydropyridine receptor (Î±1sDHPR) resulted in âˆ¼50% increase in Q, they surprisingly had no effect on the maximal Ca2+ conductance (gCa) nor the SR Ca2+ release. Nonetheless, fibres expressing EGFP-Î±1sDHPR-T935Y exhibited up to 70% isradipine-insensitive ICa (ICa-ins) with a right-shifted voltage dependence compared to that in control fibres. Interestingly, Qand SRCa2+ release also displayed right-shifted voltage dependence in fibres expressing EGFP-Î±1sDHPR-T935Y. In contrast, the midpoints of the voltage dependence of gCa, Q and Ca2+ release were not different from those in control fibres and in fibres expressing EGFP-Î±1sDHPR-wt. Overall, our results suggest that transgenic Î±1sDHPRs are correctly trafficked and inserted in the TTS membrane, and that a substantial fraction of the mworks as conductive Ca2+ channels capable of physiologically controlling the release of Ca2+ from the SR. A plausible corollary of this work is that the expression of transgenic variants of the Î±1sDHPR leads to the replacement of native channels interacting with the ryanodine receptor 1 (RyR1), thus demonstrating the feasibility of molecular remodelling of the triads in adult skeletal muscle fibres.

Functional expression of transgenic 1sDHPR channels in adult mammalian skeletal muscle fibres.

Nous avons &#xE9;tudi&#xE9; les effets de la surexpression de deux prot&#xE9;ine fluorescente verte (EGFP)-tagg&#xE9;s variantes &#x3B1;1sDHPR sur les courants Ca 2 + (ICA), les mouvements de charge (Q) et SR lib&#xE9;ration de Ca 2 + des fibres musculaires isol&#xE9;es de souris adultes. Court fl&#xE9;chisseur des orteils (FDB) des muscles ont &#xE9;t&#xE9; transfect&#xE9;es par &#xE9;lectroporation in vivo avec des plasmides codant pour l&#x26;#39;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-poids et EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y (un mutant isradipine insensible &#xE0; la casse). Microscopie &#xE0; deux photons &#xE0; balayage laser (TPLSM) a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;e pour &#xE9;tudier la localisation subcellulaire des prot&#xE9;ines transg&#xE9;niques, alors que l&#x26;#39;ICA, Q et lib&#xE9;ration de Ca2 + ont &#xE9;t&#xE9; &#xE9;tudi&#xE9;es par &#xE9;lectrophysiologie et optiquement sous voltage-clamp conditions. Images TPLSM d&#xE9;montr&#xE9; que la plupart des &#x3B1;1sDHPR transg&#xE9;nique a &#xE9;t&#xE9; correctement cibl&#xE9;e au syst&#xE8;me tubulaire transversal (TTS). Immunoblotting l&#x26;#39;analyse d&#x26;#39;extraits bruts de fibres transfect&#xE9;es d&#xE9;montr&#xE9; la synth&#xE8;se de bonne foi transg&#xE9;nique EGFP-&#x3B1;1sDHPR-poids en quantit&#xE9;s comparables &#xE0; celle de &#x3B1;1sDHPR natif. Bien que l&#x26;#39;expression des deux variantes de la sous-unit&#xE9; transg&#xE9;niques alpha du r&#xE9;cepteur aux dihydropyridines (&#x3B1;1sDHPR) a abouti &#xE0; ~ augmentation de 50% Q, ils &#xE9;tonnamment eu aucun effet sur la Ca2 + de conductance maximale (GCA), ni le Ca 2 + SR communiqu&#xE9;. N&#xE9;anmoins, les fibres exprimant l&#x26;#39;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y expos&#xE9; jusqu&#x26;#39;&#xE0; 70% isradipine insensible &#xE0; l&#x26;#39;ICA (ICA-ins) avec une d&#xE9;pendance d&#xE9;cal&#xE9; &#xE0; droite de tension par rapport &#xE0; celle des fibres de contr&#xF4;le. Fait int&#xE9;ressant, qand SRCa2 + communiqu&#xE9; a &#xE9;galement affich&#xE9; d&#xE9;cal&#xE9; &#xE0; droite fonction de la tension dans les fibres exprimant l&#x26;#39;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y. En revanche, les milieux de la d&#xE9;pendance de tension de GCA, Q et lib&#xE9;ration de Ca2 + n&#x26;#39;&#xE9;taient pas diff&#xE9;rents de ceux en fibres de contr&#xF4;le et dans les fibres exprimant l&#x26;#39;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-poids. Dans l&#x26;#39;ensemble, nos r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que &#x3B1;1sDHPRs transg&#xE9;niques sont correctement victimes de la traite et ins&#xE9;r&#xE9;e dans la membrane TTS, et qu&#x26;#39;une fraction importante de la mworks comme conductrices canaux Ca2 + physiologiquement capables de contr&#xF4;ler la lib&#xE9;ration de Ca2 + du RS. Un corollaire plausible de ce travail est que l&#x26;#39;expression des variants transg&#xE9;niques de la &#x3B1;1sDHPR conduit au remplacement de cha&#xEE;nes indig&#xE8;nes qui interagissent avec le r&#xE9;cepteur de la ryanodine 1 (RYR1), d&#xE9;montrant ainsi la faisabilit&#xE9; du remodelage mol&#xE9;culaire des triades dans les fibres musculaires squelettiques adultes.

Expression fonctionnelle de canaux 1sDHPR transg&#xE9;niques dans des mammif&#xE8;res adultes fibres musculaires squelettiques

Wir untersuchten die Wirkungen von der eine &Uuml;berexpression von zwei erweiterte gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (EGFP)-markiert &alpha;1sDHPR Varianten auf Ca2 + Str&ouml;mungen (ICa), Bewegungen (Q) berechnen und SR Ca2 + Release von Muskelfasern, die von Erwachsenen M&auml;usen isoliert. Musculus Flexor Digitorum Brevis (FDB) Muskeln wurden durch in-vivo Electroporation mit Plasmiden, die Codierung f&uuml;r EGFP-&alpha;1sDHPR-wt und EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y (ein Isradipin-unempfindliche Mutant) die transfected. Zwei-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie (TPLSM) wurde verwendet, um die subzellulare Lokalisation von transgenen Proteinen, w&auml;hrend ICa, Q und Ca2 + Release wurden electrophysiologically untersucht und optisch unter Spannung Klemm-Bedingungen zu studieren. TPLSM Bilder gezeigt, dass die meisten der transgenen &alpha;1sDHPR zielte nun korrekt auf die quer R&ouml;hrensystem (TTS). Immunoblotting Analyse der grobe Extrakte transfizierte Fasern demonstriert die Synthese von bona-fide transgenen EGFP-&alpha;1sDHPR-wt in Mengen, die vergleichbar mit der nativen &alpha;1sDHPR. Obwohl &sim;50 % Anstieg Q Ausdruck der beiden transgenen Varianten von der alpha-Untereinheit des Dihydropyridin-Rezeptors (&alpha;1sDHPR) gef&uuml;hrt, hatten sie &uuml;berraschenderweise keinen Einfluss auf die maximale Ca2 + Leitwert (gCa) noch die SR Ca2 +-Freigabe. Dennoch stellte Fasern auszudr&uuml;cken-EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y bis zu 70 % Isradipin-unempfindliche ICa (ICa-ins) mit rechts verschoben Spannung Abh&auml;ngigkeit mit dem Steuerelement Fasern verglichen. Interessanterweise angezeigt qund SRCa2 + Version auch rechts verschoben Spannung Abh&auml;ngigkeit in Fasern-EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y zum Ausdruck zu bringen. Im Gegensatz dazu die Mittelpunkte von der Spannung-Abh&auml;ngigkeit der gCa, Q und Ca2 + Release waren nicht anders als diejenigen im Steuerelement Fasern und in Fasern EGFP-&alpha;1sDHPR-WT insgesamt auszudr&uuml;cken, unsere Ergebnisse legen nahe, dass transgene &alpha;1sDHPRs korrekt gehandelt und in die TTS-Membran eingef&uuml;gt und ein wesentlicher Teil der Mworks als leitf&auml;hige Ca2 + Kan&auml;le k&ouml;nnen physiologisch die Freisetzung von Ca2 + aus der SR. Eine plausible Folge dieser Arbeit ist, dass der Ausdruck der transgene Varianten von der &alpha;1sDHPR auf den Ersatz des systemeigenen Kan&auml;le, die Interaktion mit den Ryanodin-Rezeptor 1 (RyR1), so zeigen die Machbarkeit der molekularen Umbau der Triaden in Erwachsenen Skelettartiger Muskelfasern f&uuml;hrt.

Funktionaler Ausdruck der transgenen 1sDHPR Kan&auml;le in Erwachsenen S&auml;ugetier-Skelett Muskelfasern.

Abbiamo studiato gli effetti della sovraespressione di due proteina fluorescente verde migliorato (EGFP)-messo &alpha;1sDHPR varianti sulle correnti Ca2 + (ICa), carica movimenti (Q) e SR Ca2 + rilascio di fibre muscolari isolate da topi adulti. Muscoli flessori estensore brevis (FDB) erano transfected dall&#39;elettroporazione in vivo con plasmidi codifica per EGFP-&alpha;1sDHPR-wt ed EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y (un mutante Isradipina-insensibile). Due-fotone laser scanning microscopy (TPLSM) &egrave; stato usato per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine transgeniche, mentre ICa, Q e Ca2 + release sono stati studiati destre e otticamente in condizioni di tensione-morsetto. Immagini TPLSM ha dimostrato che la maggior parte del transgenico &alpha;1sDHPR correttamente &egrave; stato mirato al sistema tubulare trasverso (TTS). Immunoblotting analisi degli estratti grezzi di fibre transfected ha dimostrato la sintesi di bona fide transgenici EGFP-&alpha;1sDHPR-wt in quantit&agrave; paragonabile a quella dei nativi &alpha;1sDHPR. Anche se l&#39;espressione di entrambe le varianti transgeniche della subunit&agrave; alfa del recettore diidropiridinico (&alpha;1sDHPR) ha portato in aumento del &sim;50% Q, sorprendentemente non avevano alcun effetto su maximal Ca2 + conduttanza (gCa) n&eacute; la SR Ca2 + release. Ci&ograve; nonostante, fibre esprimendo EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y esposto fino al 70% ICa Isradipina-insensibile (ICa-ins) con una dipendenza di tensione spostato a destra rispetto a quello in fibre di controllo. &Egrave; interessante notare, Qand SRCa2 + rilascio anche visualizzato dipendenza tensione spostato a destra in fibre esprimendo EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y. In contrasto, i punti centrali della dipendenza tensione di gCa, Q e Ca2 + release non erano diverse da quelle in fibre di controllo e in fibre esprimendo EGFP-&alpha;1sDHPR-WT in generale, i nostri risultati suggeriscono che &alpha;1sDHPRs transgenici correttamente sono trafficate e inserito nella membrana TTS, e che una frazione sostanziale di mworks come conduttivo Ca2 + channels in grado di controllare fisiologicamente il rilascio di Ca2 + da Sr. Un corollario di questo lavoro plausibile &egrave; che l&#39;espressione di varianti transgeniche del &alpha;1sDHPR conduce alla sostituzione di canali nativi interagendo con il recettore rianodinico 1 (RyR1), dimostrando la fattibilit&agrave; di rimodellamento molecolare delle triadi in fibre di muscolo scheletrico adulto.

Espressione funzionale dei canali 1sDHPR transgenici nelle fibre del muscolo scheletrico mammifero adulto.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;2&#x3064;&#x200B;&#x200B;&#x306E;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;EGFP&#xFF09;&#x30BF;&#x30B0;&#x4ED8;&#x304D;&#x306E;Ca2 +&#x96FB;&#x6D41;&#xFF08;ICA&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x96FB;&#x8377;&#x79FB;&#x52D5;&#xFF08;Q&#xFF09;&#x3068;SR&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x6210;&#x4F53;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x304B;&#x3089;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x7B4B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;+&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x3B1;1sDHPR&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x77ED;&#x8DBE;&#x5C48;&#xFF08;FDB&#xFF09;&#x306E;&#x7B4B;&#x8089;&#x306F;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-WT&#x3068;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y&#xFF08;&#x30A4;&#x30B9;&#x30E9;&#x30B8;&#x30D4;&#x30F3;&#x3068;&#x5C0F;&#x6587;&#x5B57;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#xFF09;&#x3092;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;in vivo&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3057;&#x305F;&#x3002; ICA&#x3001;Q&#x3068;Ca2 +&#x653E;&#x51FA;&#x306F;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x96FB;&#x6C17;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5149;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x4E00;&#x65B9;&#x3001;&#x4E8C;&#x5149;&#x5B50;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x8D70;&#x67FB;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#xFF08;TPLSM&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5C40;&#x5728;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; TPLSM&#x753B;&#x50CF;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x3B1;1sDHPR&#x306E;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x304C;&#x6B63;&#x3057;&#x304F;&#x6A2A;&#x884C;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x7CFB;&#xFF08;TTS&#xFF09;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E;&#x7C97;&#x62BD;&#x51FA;&#x7269;&#x306E;&#x30A4;&#x30E0;&#x30CE;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x89E3;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x3B1;1sDHPR&#x306B;&#x5339;&#x6575;&#x3059;&#x308B;&#x91CF;&#x3067;&#x6B63;&#x771F;&#x6B63;&#x9298;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-WT&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30D4;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;&#x3B1;1sDHPR&#xFF09;&#x306E;&#x3B1;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3001;Q&#x306E;&#x7D04;50&#xFF05;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3082;&#x306E;&#x306E;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x9A5A;&#x304F;&#x3079;&#x304D;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x6700;&#x5927;&#x306E;Ca2 +&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#xFF08;GCA&#xFF09;&#x3084;SR Ca2 +&#x653E;&#x51FA;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3055;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306F;&#x3001;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E;&#x3082;&#x306E;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x53F3;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3068;70&#xFF05;&#x30A4;&#x30B9;&#x30E9;&#x30B8;&#x30D4;&#x30F3;&#x3068;&#x5C0F;&#x6587;&#x5B57;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3057;&#x306A;&#x3044;ICA&#xFF08;ICA&#x30D7;&#x30E9;&#x30B0;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF09;&#x307E;&#x3067;&#x51FA;&#x5C55;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;Qand SRCa2 +&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x3067;&#x306F;&#x3001;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x3067;&#x53F3;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3057;&#x305F;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;GCA&#x3001;Q&#x3068;Ca2 +&#x653E;&#x51FA;&#x306E;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x306E;&#x4E2D;&#x70B9;&#x306F;&#x3001;&#x5236;&#x5FA1;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x3068;EGFP-&#x3B1;1sDHPR-WT&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E;&#x3082;&#x306E;&#x3068;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x3067;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5168;&#x4F53;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x3B1;1sDHPRs&#x304C;&#x6B63;&#x3057;&#x304F;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3068;TTS&#x819C;&#x306B;&#x633F;&#x5165;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;SR&#x304B;&#x3089;&#x306E;Ca2 +&#x306E;&#x653E;&#x51FA;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x5C0E;&#x96FB;&#x6027;Ca2 +&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;mworks&#x306E;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x5272;&#x5408;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x4F5C;&#x54C1;&#x306E;&#x3082;&#x3063;&#x3068;&#x3082;&#x3089;&#x3057;&#x3044;&#x63A8;&#x8AD6;&#x306F;&#x3B1;1sDHPR&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x6210;&#x4EBA;&#x9AA8;&#x683C;&#x7B4B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x306E;&#x4E09;&#x3064;&#x7D44;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3001;&#x30EA;&#x30A2;&#x30CE;&#x30B8;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;1&#xFF08;RYR1&#xFF09;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x4EE3;&#x66FF;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x5927;&#x4EBA;&#x306E;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x9AA8;&#x683C;&#x7B4B;&#x306E;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;1sDHPR&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x767A;&#x73FE;

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xB450; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (EGFP) overexpression&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC; &#xC870;&#xC0AC;-&#xCDA9;&#xC804; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC784; (Q) &alpha;1sDHPR &#xBCC0;&#xC885; Ca2 + &#xC804;&#xB958; (ICa)&#xC5D0; &#xD0DC;&#xADF8;&#xC640; SR Ca2 + &#xC131;&#xC778; &#xC950;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB41C; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC758; &#xCD9C;&#xC2DC;. Flexor digitorum brevis (FDB) &#xADFC;&#xC721; wt-&alpha;1sDHPR-EGFP EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y (isradipine&#xC744; &#xAD6C;&#xBD84; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xC744; &#xD558;&#xB294; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC640; in vivo electroporation&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD398; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB450; &#xAD11;&#xC790; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xC2A4;&#xCE90;&#xB2DD; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95; (TPLSM) &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, ICa, Q &#xBC0F; Ca2 + &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4; electrophysiologically &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xAD11;&#xD559; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; subcellular &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. TPLSM &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xC124;&#xBA85; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC740; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &alpha;1sDHPR &#xC62C;&#xBC14;&#xB974;&#xAC8C; &#xAC00;&#xB85C; &#xAD00; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; (TTS)&#xC744; &#xD45C;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4;. Immunoblotting &#xBD84;&#xC11D;&#xC758; transfected &#xC12C;&#xC720;&#xC758; &#xC6D0;&#xC720; &#xCD94;&#xCD9C; &#xBB3C; &#xD0C0;&#xACE0; &#xB09C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; EGFP-&alpha;1sDHPR-wt &#xC218;&#xB7C9; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &alpha;1sdhpr&#xC758; &#xBE44;&#xAD50; &#xD569;&#xC131; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD588;&#xB2E4;. Dihydropyridine &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (&alpha;1sDHPR)&#xC758; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &#xB450; &#xBCC0;&#xC885;&#xC758; &#xC2DD; Q &sim;50% &#xC99D;&#xAC00; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4;, &#xBE44;&#xB85D; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xB180;&#xB77C;&#xC6B8; &#xC815;&#xB3C4;&#xB85C; &#xCD5C;&#xB300;&#xD55C; Ca2 + &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; (gCa)&#xB3C4; SR Ca2 + &#xCD9C;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC544;&#xBB34;&#xB7F0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xC9C0;&#xB97C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, &#xC12C;&#xC720; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; EGFP-&alpha;1sDHPR-T935Y isradipine&#xC744; &#xAD6C;&#xBD84; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xB294; ICa (ICa &#xAE30;&#xB2A5;) &#xC624;&#xB978;&#xCABD; &#xC774;&#xB3D9; &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874;&#xB3C4;&#xC640; &#xADF8; &#xC81C;&#xC5B4; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xCD5C;&#xB300; 70% &#xC804;&#xC2DC;. &#xD765;&#xBBF8;&#xB86D;&#xAC8C;&#xB3C4;, Qand SRCa2 + &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xB3C4; EGFP-&alpha;1sDHPR-t935y&#xC744; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xC624;&#xB978;&#xCABD; &#xC774;&#xB3D9; &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874;&#xB3C4;&#xB97C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, gCa, &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874;&#xC758; &#xC911;&#xAC04;&#xC810; Q &#xBC0F; Ca2 + &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4; &#xD588;&#xB2E4; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xB978;&#xACFC; &#xC12C;&#xC720; &#xD45C;&#xD604; EGFP-&alpha;1sDHPR-&#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xC81C;&#xC548; &#xBC0F; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC77C;&#xBD80;&#xBD84;&#xC73C;&#xB85C; &#xC804;&#xB3C4;&#xC131; Ca2 + mworks &#xC21C;&#xC218;&#xB294; &#xBBF8;&#xC2A4;&#xD130;&#xC5D0;&#xC11C; Ca2 +&#xC758; &#xCD9C;&#xC2DC;&#xB97C; &#xC81C;&#xC5B4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &alpha;1sDHPRs &#xC62C;&#xBC14;&#xB974;&#xAC8C; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4; &#xB418; &#xACE0; TTS &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC0BD;&#xC785; &#xC774; &#xC791;&#xD488;&#xC758; &#xADF8;&#xB7F4;&#xB4EF;&#xD55C; &#xCD94;&#xB860; &#xB41C; &alpha;1sdhpr&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; &#xBCC0;&#xD615; &#xC2DD; ryanodine &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; 1 (RyR1), &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xBD84;&#xC790; &#xC131;&#xC778; &#xACE8;&#xACA9; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; triads&#xC758; &#xB9AC; &#xBAA8;&#xB378;&#xB9C1;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xAD50;&#xCCB4;&#xB97C; &#xB9AC;&#xB4DC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC131;&#xC778; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xACE8;&#xACA9; &#xADFC;&#xC721; &#xC12C;&#xC720;&#xC5D0; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xD615; 1sDHPR &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xD45C;&#xD604;.

Se investigaron los efectos de la sobreexpresi&#xF3;n de dos aumento de prote&#xED;na verde fluorescente (EGFP)-etiquetados &#x3B1;1sDHPR variantes en las corrientes de Ca2 + (ICA), los movimientos de carga (Q) y SR Ca2 + liberaci&#xF3;n de las fibras musculares aisladas de los ratones adultos. Flexor corto de los dedos (FDB), los m&#xFA;sculos fueron transfectadas por electroporaci&#xF3;n in vivo con los pl&#xE1;smidos que codifican para EGFP-&#x3B1;1sDHPR-peso y EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y (un mutante isradipina y min&#xFA;sculas). De dos fotones microscop&#xED;a de escaneo l&#xE1;ser (TPLSM) se utiliz&#xF3; para estudiar la localizaci&#xF3;n subcelular de las prote&#xED;nas transg&#xE9;nicas, mientras que Ica, Q y Ca2 + en libertad se estudiaron electrofisiol&#xF3;gicamente y &#xF3;pticamente en condiciones de fijaci&#xF3;n de voltaje. Im&#xE1;genes TPLSM demostrado que la mayor&#xED;a de la &#x3B1;1sDHPR transg&#xE9;nico fue dirigido correctamente al sistema tubular transversal (TTS). Immunoblotting an&#xE1;lisis de los extractos crudos de fibras transfectadas demostraron la s&#xED;ntesis de buena fe transg&#xE9;nico EGFP-&#x3B1;1sDHPR en peso en cantidades comparables a la de &#x3B1;1sDHPR nativo. Aunque la expresi&#xF3;n de ambas variantes transg&#xE9;nicas de la subunidad alfa del receptor de dihidropiridina (&#x3B1;1sDHPR) dio lugar a ~ 50% de aumento en Q, que sorprendentemente no tuvo efecto sobre la Ca2 + m&#xE1;xima conductancia (GCA) ni el Ca2 + liberaci&#xF3;n SR. Sin embargo, las fibras que expresan EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y exhiben hasta el 70% isradipina insensible a Ica (Ica-ins) con una dependencia de la derecha con desplazamiento de tensi&#xF3;n en comparaci&#xF3;n a la de las fibras de control. Curiosamente, Qy SRCa2 + liberaci&#xF3;n tambi&#xE9;n se muestra de derecha cambi&#xF3; la dependencia de la tensi&#xF3;n en las fibras que expresan EGFP-&#x3B1;1sDHPR-T935Y. Por el contrario, los puntos medios de la dependencia de voltaje de la ACG, Q y la liberaci&#xF3;n de Ca2 + no eran diferentes a las de las fibras de control y en las fibras que expresan EGFP-&#x3B1;1sDHPR en peso. En general, nuestros resultados sugieren que &#x3B1;1sDHPRs transg&#xE9;nicos est&#xE9;n correctamente v&#xED;ctimas de la trata y se inserta en la membrana de TTS, y que una fracci&#xF3;n sustancial de la mworks como conductores de canales de Ca2 + fisiol&#xF3;gicamente capaces de controlar la liberaci&#xF3;n de Ca2 + desde el SR. Un corolario posible de este trabajo es que la expresi&#xF3;n de las variantes transg&#xE9;nicas de la &#x3B1;1sDHPR conduce a la sustituci&#xF3;n de los canales de nativos que interact&#xFA;an con el receptor de rianodina 1 (RYR1), lo que demuestra la viabilidad de la remodelaci&#xF3;n molecular de las tr&#xED;adas en adultos fibras del m&#xFA;sculo esquel&#xE9;tico.

Marbella Quinonez

Department of Physiology

David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Marbella Quinonez

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David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Department of Physiology