솔루션 <ul><li> 신경절 세포에 대한 세포 솔루션 (MM)를 100 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코 </li><li> 양극성 세포 (MM)을위한 세포 솔루션 : 90 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코 </li><li> 세포외 링어의 솔루션 (MM)을 : 112 NaCl, 5 포도당, 5 HEPES, NaOH와 산도 = 7.75로 조정이 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2. 솔루션의 산소가 필요하지 않습니다. </li></ul> 녹화 실 준비 우리의 기록 챔버 다른 접착제의 잘라 작은 실리콘 블록이 잘 조직 조각에 대한 안정성을 제공하기 위해 배치됩니다 잘되는 접착제와 현미경 슬라이드로 구성되어 있습니다. 망막 조각의 준비 photoreceptors의 표백 피하기 위해, 절개는 IR 또는 희미한 붉은 빛 라이트에서 수행됩니다. 하나는 막대 경로에서 응답을 녹음에 관심이있다면, 오직 IR 빛이 (IR는 현미경없이 실내 조명을 해부. 추가 적외선 고글이 현미경으로하지 절차를 사용해야합니다) 사용해야합니다. 하나는 주로 원추 라이트 응답, 희미한 붉은 방 조명이나 붉은 손전등을 기록에 관심이있다면 사용할 수 있습니다. 현미경 그러나, 여전히 IR oculars 있어야합니다. photoreceptor 입력이 실험을 위해 관련이없는 경우, 절차는 일반 현미경을 사용하여 일반 룸 라이트에서 진행하실 수 있습니다. <ol><li> 잘 접착제 실리콘 두 개의 현미경 슬라이드 준비 : (필터를 밀어 각 슬라이드에 실리콘 그리스의 두 병렬 밴드 (약 0.5 cm 간격)을 작성하고 슬라이드의 한쪽 거름종이의 사각형 조각을 배치, 모두 그리스 밴드를 건너 그것이 잘 슬라이드에 첨부되도록 면도날의 일부와 함께 종이) </li><li> 동물 후 참수를 두 번 pithed, 30 분 동안 얼음 욕조에 배치됩니다 설립 프로토콜에 따라 도롱뇽을 희생. </li><li> 샐러맨더 머리에서 눈을 제거하고 조직 종이에 해부 현미경으로 그것을 장소는 얼음처럼 차가운 링어의 솔루션 moistened </li><li> 눈에서 결합 조직을 제거 </li><li> 각막에 작은 상처를 만들기 위해 면도날을 사용하여 </li><li> 눈에하기 위해 첨부 파일을 함께 가위로 그것을 제거하는 동안 집게로 각막을 절단 잡아 </li><li> 포셉와 렌즈를 제거 </li><li> 포셉로 방어막을 누른 상태에서 조리개를 제거 오라 세라타 따라 컷 </li><li> 이 직사각형 조각으로 세안 컵 컷 </li><li> (아주 조심스럽게 그것을 아래로 밀어하면서 조각을 평평하게해야합니다) 조각 중 하나를 선택하고 필터 종이에 공막엔 측면을 장소 </li><li> 부드럽게 지금 필러 용지에 첨부되어야하는, 망막에서 공막엔 리프트 </li><li> 신속하게 잘하는 얼음처럼 차가운 링어의 솔루션을 추가 </li><li> 두 번째 작품에 대해 동일한 단계를 반복 </li><li> 200 - 300μm 다양한 조각 잘라 사용자 정의 만든 기계에 위치 면도날을 사용합니다. </li><li> 필터 종이의 측면에서 조각을 데리러 포셉 한 켤레를 사용하여 망막의 레이어가 표시되기 때문에 그들을 넘겨주하고, 진공 그리스 밴드에 장소를 </li><li> 손상되지 않은 외모와 망막의 레이어 (배율이 충분히 높지 않을으로 레이어를 한 일부 겹겹이 인식할 수있다면 그러나 슬라이스 일반적으로 충분이며, 때로는 해부 현미경 아래에서 볼 수 어렵습니다을 나타내는 수평 밴드를 보여줍니다 슬라이스를 선택하십시오. 가) 직립 현미경으로 볼되면 슬라이스를 사용하는 여부에 대한 최종 결정은, 그러나, 만들 수 있습니다. 두 슬라이드 사이에 링어 다리를 구축하여 녹음 챔버 슬라이드로 이동 </li><li> 슬라이스가 (신경절 세포와 photoreceptors가 동시에 초점이되어야합니다) 기울어져되지 않도록 필터 종이는 기록 챔버에있는 고무 블록에 대한 강요되어 있는지 확인 </li></ol> 레코딩 장비에서 조직을 배치 <ol><li> 녹음 슬라이드는 현미경으로 위치하고 중력 재관류의 syste 통해 링어의 솔루션과 perfused입니다 </li><li> 준비는 10X와 40x 물 침지 목적으로 직립 현미경 시각이다. </li><li> 다시 말하지만, 우리는 photoreceptors의 표백 방지하기 위해 IR 조명을 사용합니다. IR 카메라는 TV 화면에 연결되어있는 현미경의 측면 포트에 첨부되어 있습니다. </li></ol> 시각적 자극 시각적 자극은 Psychtoolbox를 사용하여 Matlab에서 프로그래밍하고 현미경 이미지 주입기 (Mbf bioscience)를 사용하여 현미경의 상단에 포트를 통해 망막에 투영됩니다. 비트 + + 디지털 비디오 프로세서 (캠브리지 연구 시스템)는 14bit 휘도 규모를 구하고 synchr하는 데 사용됩니다데이터 수집과 자극 프레 젠 테이션을 onize. 이 동영상에 사용되는 시각적 자극이 지속적으로 균일한 배경 (두 초 동안 제시되었다 100 % 대비 밝은 또는 어두운 바 (폭 = 460μm)입니다 휘도 = 8 * 10 4 광자 / μm의 / s의 크기 : 1.84 X 1.38mm). 전기 생리학 <ul><li> micropipette의 풀러와 함께 : 패치 전극은 borosilicate 유리 (1.5mm, ID 84mm.. OD)에서 가져온 있습니다. 신경절 세포의 경우, resistances 2 4 MOhms 사이입니다. 양극성 세포의 경우, 4, 8 MOhms 사이에 높은 resistances이 사용됩니다. </li><li> 전압 클램프 녹음은 Multiclamp 700A (분자 장치), 앰프 및 Labview에서 프로그램 연구실 내부 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. </li><li> 약물은 8 채널 재관류 시스템을 통해 perfused 수 있습니다. microperfusion 전극은 슬라이스 (조직 가시가에서 재관류를 켜고 때 이동해야 하나 요구 압력이 슬라이스가 여과지에서 분리 될 수 있도록 너무 강하지 않다는 것을 조심)에 가까이 위치합니다. 실험 동안 microperfusion 끊임없이 녹음에 재관류를 스위칭 및 해제에 의해 방해받지 않도록합니다 (약물이 필요하지 않은 경우 perfusing 제어 솔루션)을 설정해야합니다. </li></ul>

<ol>
	<li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(C)+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina.">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li><li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation.">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li><li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells.">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li></ol>

장점 : <ol><li> 모든 세포 유형은 액세스할 수 있습니다 </li><li> 셀 유형을 쉽게 식별은 특히 형광 염료는 전극 솔루션에 추가하는 경우 </li><li> 약리 요원들은 쉽게 표적 세포에 도달할 수 </li><li> 패치 클램프 기술은 망막 계산 서로 다른 이온 채널의 역할을 조사 할 수 있습니다. 동일한 정보는 날카로운 전극과 extracelluar 스파이크 녹음하거나 녹음을 통해 얻을 수 없습니다. </li><li> 이 기술은 다른 동물 모델에 적용할 수있는 </li></ol> 단점 : <ol><li> 프로세스는 깔끔히의 과정에 차단받을 수 있습니다. 따라서 공간 수용 분야에 초점을 연구 어려울 수 있습니다. </li><li> 전기 생리학에 사용되는 체외 준비 가장 망막 마찬가지로, 안료 상피는 photoreceptors의 표백으로 이어질 수있는, 제거됩니다. 높은 광 강도와 자극이 필요하거나 많은 적응 상태에서 망막을 연구해야 할 연구는이 기술을 어려움에 빠질수도 있습니다. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Patch Clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Dissection Micropscope</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Upright Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Microscope image injector</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-channel perfusion system</td><td>Microperfusion</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Digital Video Processor</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared Oculars</td><td>Other</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive silicone wells</td><td>Other</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>20mm diameter, 1.0mm deep</td></tr><tr><td>Membrane Filters</td><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Electrode glass</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters</td><td>Filter</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing</td></tr><tr><td>IR camera</td><td>Micropscope mounted camera</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7W video camera</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole-4-acetic acid sodium salt</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larval tiger salamanders</td><td>Animal</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell recordings of light evoked excitatory synaptic currents in the retinal slice

우리는 시냅스 회로 망막에 underlies 시각 정보 처리 연구를 전체 세포 패치 클램프 기법을 사용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 망막 슬라이스 준비에서 개별 세포의 빛을 evoked 흐름 전체 세포 레코딩을 수행하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 우리는 동물 모델로 수생 호랑이 도롱뇽을 사용합니다. 우리는 눈 해부를 설명함으로써 시작하고 조각이 electrophysiological 레코딩을위한 마운트하는 방법 보여줍니다. 슬라이스가 기록 챔버에 배치되면, 우리는 전체 셀 전압 클램프 레코딩을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 빛이 - evoked 현재 답변을 이끌어내는 수있는 통에 photoreceptors에 시각적 자극이 프로젝트를 만듭니다. 8 채널 재관류 시스템을 우리가 신속하게 다른 에이전트 사이를 전환할 수있게 의하여 기록하는 동안 우리는 약리 요원으로 슬라이스를 perfuse. 망막 슬라이스 준비 널리 특히 전체 마운트 준비에 액세스할 수 없습니다 amacrine 또는 바이폴라 세포를 연구, 망막의 패치 클램프 녹음에 사용됩니다.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K 조회수.  Boston University. 이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

비디오: Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal cells in the murine split retina(쥐 분할 망막의 양극성 및 수평 신경 세포 연구)

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

저자 스포트라이트: 접근성 향상 및 실험 가속화를 위한 Split Retina 기법 사용 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

요약

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어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

이미징 CA

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

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어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 + 영상

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

이미징 CA

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

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패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}