우리는 위장관을 모방하고 살아있는 돼지와 비교하고 수송 특성에 초점을 맞추기 위해 오가노이드 기반 모델을 개발 및 특성화하는 것을 목표로 합니다. 고전적인 동물 실험에서 변화. 위장 생리학의 우리 분야에서.
생체 내 상황을 모방한 오가노이드 기반 체외 모델. 우리는 오가노이드의 소장과 대장에 대한 우리의 모델을 결합했습니다. 이를 통해 운송 특성을 실시간으로 조사하여 모델과 살아있는 돼지 상황을 비교할 수 있습니다.
특히 가축 관련 연구 분야에서는 고전적인 동물 실험에 대한 대안 모델이 드뭅니다. 우리는 돼지 장관의 오가노이드 기반 모델을 사용하여 이러한 한계를 극복합니다. 우리는 오가노이드 기반 장 모델을 사용하여 돼지 병원성 박테리아의 영향을 연구할 계획입니다.
이것은 이러한 박테리아의 병원성 메커니즘을 이해하는 것을 목표로 합니다. 시작하려면 갓 해동한 기저막을 1:40의 비율로 원뿔형 튜브에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS와 혼합합니다. 이 혼합물 200마이크로리터를 멸균 플레이트 내 각 인서트의 정점 구획에 추가합니다.
웰 플레이트의 뚜껑을 교체하고 섭씨 37도에서 최소 1.5시간 동안 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 배양 후에는 멤브레인을 건드리지 않도록 용액을 조심스럽게 흡입하십시오. 3차원 crypt organoids를 포함하는 well에서 오가노이드 배지를 제거합니다.
기저막을 용해하려면 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 웰에 넣고 P1000 팁으로 위아래로 피펫팅합니다. 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS가 미리 채워진 15ml 튜브에 용해된 모든 오가노이드를 수집합니다. 튜브를 250G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.
상층액을 흡인시킨 후 펠릿을 1ml의 따뜻한 0.05% 트립신 EDTA에 다시 현탁시킵니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에 올려 반응을 멈춥니다. P1000 팁을 사용하여 피펫을 위아래로 20회 반복하여 오가노이드를 완전히 재현탁한 다음 P200 팁이 위에 부착된 P1000 팁을 사용하여 다시 15회 반복합니다.
이제 10%의 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 얼음처럼 차가운 DMEM 10ml를 추가합니다. 튜브를 1000G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버린 후, 펠릿을 1 밀리리터의 단층 매체에 다시 현탁시킵니다.
Neubauer 챔버를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 밀리리터당 살아있는 세포의 수를 결정하십시오. 이제 정점 구획의 코팅 용액을 섭씨 37도에서 템퍼링된 500마이크로리터의 단층 매체로 교체하고 3ml의 단층 매체를 기저 측면 구획에 추가합니다. 정점 단층 매체를 제거합니다.
2D 배양의 경우, 적절한 양의 세포를 포함하는 500마이크로리터의 단층 배지를 각 트랜스웰의 정점 챔버에 추가하고 세포를 배양합니다. 경 상피 전기 저항 또는 TEAR 측정을 위해 젓가락 전극을 70% 에탄올로 세척하고 완전히 건조시킵니다. 젓가락 전극의 짧은 팔을 정점 구획에 도입하고 긴 팔을 인서트의 기저 측면 구획에 삽입합니다.
그런 다음 전원을 켜고 허용합니다. 안정적인 측정을 위해 미터 평형을 유지한 다음 저장 버튼을 클릭하여 TEAR 값을 기록합니다. 마지막 웰을 측정한 후 저장을 클릭하여 USB 장치에 데이터를 저장합니다.
각 플레이트 뒤와 측정이 끝날 때 전극을 청소하십시오. 보관하기 전에 전극을 완전히 건조시키십시오. 측정된 세포 값에서 세포를 seeding하기 전에 결정된 blank TEAR 값을 뺍니다.
매체를 교체하고 2-3일마다 TEAR를 측정하여 매체를 변경하기 전에 TEAR를 측정합니다. 500마이크로리터 또는 3밀리리터의 신선하고 따뜻한 분화 배지를 정점 및 기저 구획에 조심스럽게 추가합니다. 제주날 오가노이드의 경우 18일째, 대장 오가노이드의 경우 9일째에 파종 후 기능적 실험을 진행한다.
점막 및 혈청 완충액을 섭씨 37도까지 예열하고 발암물질로 폭기합니다. 각 개별 챔버에 대해 빈 인서트를 사용하여 단일 챔버를 조립하고 트랜스웰의 정점 면이 모두 같은 방향을 향하도록 합니다. 모든 챔버를 5ml의 예열된 점막 완충 용액으로 채웁니다.
vol의 모든 전극을 연결하십시오.tage clamp 제조업체의 지침에 따라 개별 챔버에 연결합니다. Ussing 챔버 소프트웨어를 보정하려면 전압 클램프 소프트웨어에서 RFDPI 버튼을 클릭하십시오. 모든 빈 인서트의 저항이 약 70옴이고 전류가 약 0밀리볼트인지 확인합니다.
모든 전극을 제거하고 사용한 버퍼 용액을 폐기하십시오. 개별 챔버를 열고 빈 인서트를 제거하고 챔버의 순서를 유지하십시오. 이제 안전 캐비닛 아래에서 플레이트에서 기저측 및 정점 매체를 조심스럽게 흡인합니다.
정점 챔버에서 500마이크로리터의 따뜻한 점막 완충액으로 세포를 세척하고 기저측 챔버에서 3ml의 혈청 완충액으로 세포를 세척합니다. 플레이트에서 인서트를 제거하고 지지대를 부드럽게 제거합니다. 인서트를 Ussing 챔버에 배치하고 방향이 교정 단계와 일치하는지 확인합니다.
개별 챔버를 조립한 후 세포의 기저측 쪽을 향하는 챔버에 5ml의 장막 완충액을 채우고 정점 쪽을 향하는 챔버에 5ml의 점막 완충액을 채웁니다. 전극과 폭기 튜브를 각 개별 챔버에 연결하고 Ussing 소프트웨어에서 측정을 시작합니다. 소프트웨어에서 조건을 개방 회로에서 단락 모드로 변경합니다.
5-10분 평형 후 혈청 챔버에 10마이크로몰 포스콜린을 추가합니다. 15분 후 측정을 중지하고 챔버에서 폭기관과 전극을 제거한 다음 챔버를 분해합니다. 경상피 전기 저항 값은 재배 중에 점진적으로 증가하여 18일 후에는 제주넘의 경우 150옴 x 센티미터 제곱으로, 9일 후에는 결장 오가노이드의 경우 200옴 제곱으로 최고조에 달했습니다.
기초 단락 전류 값은 결장 오가노이드보다 제주눔 오가노이드에서 유의하게 낮았으며, 기초 저항 값은 유의한 차이를 보이지 않았습니다. 포스콜린 처리는 제주날 오가노이드의 기초 단락 전류 값을 제곱센티미터당 0.86에서 27.78마이크로암페어로, 결장 오가노이드에서 제곱센티미터당 3.83에서 28.78마이크로암페어로 크게 증가시켰습니다.
