CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

먼저, 500마이크로리터의 배지가 있는 Matrigel 코팅된 P24 웰 플레이트에 인간 배아 줄기 세포 현탁액을 파종합니다. 세포가 부착될 수 있도록 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 폴리브렌 밀리리터당 8마이크로그램과 함께 10의 감염 빈도로 부착된 세포를 감염시킵니다.

섭씨 37도에서 8시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 배지를 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 신선한 배지로 교체하되 암석 억제제는 사용하지 않습니다. 세포가 90% 밀도에 도달하면 단백질에 puromycin의 밀리리터당 0.8마이크로그램을 보충하여 선택 과정을 시작합니다.

약 4-6일 후, 안정된 세포를 1:4 비율로 분할하고 동결 보존 및 추가 분석을 위해 확장합니다. 단일 세포 선택을 수행하려면 10mL의 완전 성장 배지에 500개 세포에 해당하는 세포 현탁액을 준비합니다. 이 현탁액의 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다.

세포를 인큐베이터에서 3일 동안 방해받지 않고 두었다가 더 자라는지 관찰합니다. 그런 다음 단일 클론이 들어있는 우물을 표시하십시오. 이틀에 한 번씩 배지를 교체하고 콜로니가 추가 확장, 냉동 보존 및 분석을 위한 충분한 크기에 도달할 때까지 배양하며, 이는 일반적으로 2주가 소요됩니다.

먼저, 신경외배엽의 운명을 향해 분화된 인간 배아 줄기 세포를 얻으십시오. 세포가 90% 밀도에 도달하면 200나노몰의 LDN193189와 100%의 녹아웃 혈청 교체 매체에 SB431542 10마이크로몰로 처리합니다. 초기 24시간이 지나면 추가로 2일 동안 XAV939 마이크로몰 2개로 세포를 배양합니다.

3일 후, 8일에 걸쳐 녹아웃 혈청 교체 배지의 비율을 75%에서 50%로, 그 다음에는 25%로, 마지막으로 100%N2 배지로 점차적으로 줄입니다. 12일째에는 Pax6를 신경 외배엽 마커로 사용하여 면역 염색을 위해 세포를 고정합니다. 중배엽 운명 결정 연구를 위해 최종 내배엽 배지에서 CHIR 99021 마이크로몰 3개로 70% 합류 세포를 24시간 동안 처리합니다.

나중에 brachyury를 중배엽 특이적 마커로 사용하여 면역염색을 위해 세포를 고정합니다. 내배엽 단계를 연구하려면 CHIR 99021이 없는 최종 내배엽 배지를 추가하고 추가로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 배아체 형성 분석을 위해 Matrigel을 생략하고 부착이 낮은 세포 표면에 세포를 파종하여 현탁 조건에서 배양합니다.

knockout 세포주 A1, A5, B4는 대조 세포와 비교하여 OCT4, NANOG 및 SOX2 마커에 대한 면역염색에 의해 측정된 다능성 전위의 변화가 없었습니다. 세포 증식 마커인 KI67에 대한 면역염색은 대조군에 비해 knockout 세포주의 증식 속도에 변화가 없는 것으로 나타났습니다. 콜로니(colony)와 배아체(embryoid body) 형성은 대조군에 비해 knockout 세포주에서 영향을 받지 않았습니다.

Knockout 세포주 A1, A5, B4는 대조 세포에 비해 분화 전위의 변화 없이 Pax6, brachyuri 및 FOXA2 마커에 대한 면역염색으로 확인된 바와 같이 3개의 생식층 세포로 분화할 수 있는 능력을 유지했습니다.