이 프로토콜은 배양된 지방세포 또는 생체외 지방 조직에서 지방세포 지방분해 비율의 결정을 자세히 설명하여 쥐 모델 또는 처리 간의 지방 분해율을 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜은 직렬 샘플링을 사용하여 지방 분해가 선형 위상에서 측정되고 있음을 내부적으로 검증하고 측정 오류를 줄일 수 있습니다. 최적화를 통해 이 프로토콜은 갈색 지방 조직, 다른 유기체의 지방 조직 또는 지방 생성 세포주에서 지방 분해를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
생체 외 조직은 배지에서 BSA에 의해 방출된 유리 지방산을 격리할 수 있도록 일정한 크기와 모양의 작은 덩어리로 잘게 썰어야 합니다. 시작하려면 페놀 레드가 없는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 100밀리리터에 5g의 소 혈청 알부민(BSA)을 용해하여 5% BSA 배지를 준비합니다. 용액을 부드럽게 저어 BSA를 용해시킵니다.
그런 다음 제어 및 자극 매체의 작동 농도를 준비하십시오. 사용하기 전에 미디어를 섭씨 37도까지 예열하십시오. 배지 수집을 위해 96웰 플레이트에 라벨을 붙입니다.
멸균 흄 후드 내부에서 100% confluent primary preadipocytes의 분리 및 분화를 수행합니다. 2 내지 3 일마다, 인슐린을 함유하는 배양 배지를 웰 당 1 밀리리터의 부피를 유지하도록 변화시킨다. 이 연구에서는 차별화율이 90% 이상이고 그룹 간에 유사한 배양물만 사용합니다.
그런 다음 지방 분해를 측정하기 전에 인슐린이 없는 배지에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 세포를 DPBS로 한번 세척하여 배양 배지로부터 잔류 혈청을 제거한다. 각 반복실험에 대해 하나의 웰이 있는 48웰 플레이트를 준비합니다.
사용할 각 웰에 400마이크로리터의 실온 DMEM을 넣습니다. 마우스당 조직당 2-4개의 대조군과 2-4개의 자극 웰을 사용합니다. 각 마우스로부터 채취하고자 하는 각 조직에 대해 하나의 웰이 있는 6-웰 플레이트를 준비하고, 사용할 각 웰에 4밀리리터의 실온 DMEM을 넣는다.
수집된 생식선 지방 조직을 6웰 플레이트에 넣습니다. 우물에서 티슈를 제거하십시오. 실리콘 매트 위에 놓고 가위로 5-7 밀리그램 덩어리로 자릅니다.
깨끗한 수건에 티슈를 닦아 미디어를 제거합니다. 그런 다음 각 분석 웰에 대해 5 개 또는 6 개의 조직 덩어리에 해당하는 25-30 밀리그램의 무게를 측정하고 이전에 준비된 48 웰 분석 플레이트에 넣습니다. 티슈를 제거한 후 웨이트 보트의 무게를 측정하고 남은 잔여물의 무게를 기록합니다.
샘플 사이에 웨이트 보트를 깨끗하게 닦고 필요한 경우 다시 찢습니다. 각 조직에 새 웨이트 보트를 사용하십시오. 모든 조직 샘플의 무게를 측정한 후 48웰 분석 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 10% 이산화탄소 하에서 15분 동안 넣습니다.
멸균 흄 후드에서 미디어 수집을 수행합니다. 시간 0에서 배지를 제거한 후 웰당 400마이크로리터의 대조군 또는 자극 배지를 추가하고 분석 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 10%의 인큐베이터에 넣습니다. 생체 외 조직 배양의 경우 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 제거하고 흡입을 사용하지 마십시오.
때때로 1, 2, 3, 4시간에 200마이크로리터의 배지를 수집하고 200마이크로리터의 적절한 대조군 또는 자극 배지로 교체한 다음 분석 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 수집 접시를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 샘플을 해동하고 혼합하십시오.
시약을 실온으로 데우고 용매 A 1병을 사용하여 컬러 시약 A 1병과 용매 B 1병을 사용하여 컬러 시약 B 1병을 용해합니다. 유리 지방산 또는 FFA 표준 곡선, 피펫 표준물질 및 샘플을 96웰 분석 플레이트에 만듭니다. 권장 시료량은 웰당 10마이크로리터입니다. 150 마이크로리터의 시약 A를 각 웰에 첨가하고 혼합한다.
분석 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 550 나노 미터 및 660 나노 미터에서 플레이트의 흡광도를 읽고 이것을 판독 A.75 마이크로 리터의 시약 B를 각 웰에 넣고 혼합합니다. 분석 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 플레이트의 흡광도를 550 및 660 나노미터에서 다시 읽습니다. 이 판독 값을 판독 값으로 참조하십시오. B. 유리 글리세롤 시약을 36 리터의 초순수로 재구성하고 실온에 순응시킵니다. 샘플을 해동하고 혼합하십시오.
글리세롤 표준용액을 7.2배 연속 희석하고 워터 블랭크를 만들어 글리세롤 표준물질 곡선을 만듭니다. 각 표준물질 및 샘플을 25 마이크로리터로 피펫팅하여 96-웰 분석 플레이트에 넣는다. 175 마이크로 리터의 유리 글리세롤 시약을 각 웰에 첨가하고 혼합하십시오.
분석 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 540 나노 미터에서 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 텍스트에 설명된 단계에 따라 각 R 제곱 값의 지방 분해 비율을 계산합니다.
그런 다음 각 샘플에 대한 FFA 및 글리세롤 생성 속도를 개별 데이터 포인트로 사용하여 통계 분석을 수행하고 서로 다른 지방 분해 비율을 비교하는 경우 값을 표시합니다. 유전자형에 따른 생체 외 지방 분해 비율을 비교하는 경우 동물당 2개 또는 3개의 샘플을 기술 복제로 사용하고 샘플이 동물 수와 같도록 동물당 하나의 데이터 포인트에 대한 평균을 사용합니다. 그런 다음 데이터로 통계 분석을 수행합니다.
시험관내 분화된 지방전구세포에서의 FFA 및 글리세롤 생산은 4시간 분석 동안 선형이었다. 자극된 지방 분해 비율은 기저 비율보다 유의하게 높았습니다. 자극된 세포에서, FFA 대 글리세롤 몰비는 약 3이었고, 이는 현저한 재흡수 또는 보유 없이 트리글리세라이드 지방분해를 나타낸다.
자극되지 않은 세포에서, 비율은 약 1이었고, 이는 글리세롤의 비-지방분해성 공급원을 시사한다. 생체외 배양에서, 더 낮은 표면적 대 부피 비율을 갖는 더 큰 조직 덩어리는 더 높은 FFA 보유를 나타내었고, 그 결과 더 낮은 FFA 대 글리세롤 몰비를 나타냈다. 25밀리그램 조직 덩어리에서 FFA 보유는 지방 분해 속도에 부정적인 영향을 미쳤습니다.
매우 작은 조직 덩어리는 또한 감소된 지방 분해 속도를 나타냈습니다. 배지에서 BSA의 감소는 FFA와 글리세롤 방출을 모두 유의하게 감소시켰습니다. 24시간 자극 후 5% BSA 매체의 FFA 축적은 5밀리몰인 반면 0.5% BSA 매체의 FFA 축적은 0.6밀리몰에 불과했습니다.
수집 된 매체의 FFA 수준은 3 시간 만에 2.3 밀리몰의 위험 영역에 도달했습니다. 4시간째 배지 FFA와 글리세롤의 증가가 없는 것은 피드백 억제를 시사했다. 4 시간 시점을 제외하면 방출 속도가 작지만 크게 증가했습니다.
FFA 방출 속도는 일반적인 시점 사이에서도 선형이었습니다. 생체 외 지방 분해 샘플에서 배지를 제거할 때 조직 덩어리가 파이펫에 의해 우발적으로 제거되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 결과를 적절하게 정규화하기 위해 이러한 샘플의 단백질 또는 지질 함량을 측정해야 할 수도 있습니다.
