Questo protocollo descrive in dettaglio la determinazione del tasso di lipolisi adipocitaria negli adipociti in coltura o nel tessuto adiposo ex vivo, consentendo il confronto dei tassi lipolitici tra modelli murini o trattamenti. Questo protocollo utilizza il campionamento seriale, che consente di convalidare internamente che la lipolisi viene misurata nella fase lineare e riduce l'errore di misurazione. Con l'ottimizzazione, questo protocollo può essere utilizzato per misurare la lipolisi nel tessuto adiposo bruno, nel tessuto adiposo di altri organismi o nelle linee cellulari adipogeniche.
I tessuti ex vivo devono essere tagliati in piccoli pezzi di dimensioni e forma consistenti per consentire il sequestro degli acidi grassi liberi rilasciati da BSA nei media. Per iniziare, preparare il terreno 5% BSA sciogliendo cinque grammi di albumina sierica bovina, o BSA, in 100 millilitri di terreno di aquila modificato di Dulbecco, o DMEM, senza rosso fenolo. Mescolare delicatamente la soluzione per sciogliere la BSA.
Quindi preparare concentrazioni di lavoro di mezzi di controllo e stimolazione. Prima dell'uso, riscaldare il supporto a 37 gradi Celsius. Etichettare una piastra da 96 pozzetti per la raccolta dei supporti.
All'interno di una cappa aspirante sterile, eseguire l'isolamento e la differenziazione dei preadipociti primari confluenti al 100%. Ogni due o tre giorni, cambiare i terreni di coltura contenenti insulina mantenendo un volume di un millilitro per pozzetto. Per questo studio, utilizzare solo colture con tassi di differenziazione superiori al 90% e simili tra i gruppi.
Quindi coltivare le cellule in terreni privi di insulina per 24 ore prima di misurare la lipolisi. Lavare le cellule con DPBS una volta per rimuovere il siero residuo dai terreni di coltura. Preparare una piastra da 48 pozzetti con un pozzetto per ogni replica.
Posizionare 400 microlitri di DMEM a temperatura ambiente in ciascun pozzetto da utilizzare. Utilizzare da due a quattro pozzetti di controllo e da due a quattro pozzetti stimolati per tessuto per topo. Preparare una piastra a sei pozzetti con un pozzetto per ogni tessuto da raccogliere da ciascun topo e mettere quattro millilitri di DMEM a temperatura ambiente in ciascun pozzetto da utilizzare.
Posizionare il tessuto adiposo gonadico raccolto nella piastra a sei pozzetti. Rimuovere il tessuto dal pozzo. Mettilo su un tappetino di silicone e taglialo in pezzi da cinque a sette milligrammi con le forbici.
Asciugare i fazzoletti su un asciugamano pulito per rimuovere qualsiasi supporto. Quindi pesare da 25 a 30 milligrammi, equivalenti a cinque o sei pezzi di tessuto, per ciascun pozzetto di analisi e posizionarli nella piastra di dosaggio a 48 pozzetti precedentemente preparata. Pesare il peso barca dopo aver rimosso i tessuti e registrare il peso di eventuali residui lasciati indietro.
Pulire la barca di peso tra i campioni e il retear, se necessario. Utilizzare una nuova barca di peso per ogni tessuto. Una volta pesati tutti i campioni di tessuto, posizionare la piastra di dosaggio a 48 pozzetti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius sotto il 10% di anidride carbonica per 15 minuti.
Eseguire la raccolta multimediale in una cappa aspirante sterile. Al tempo zero, dopo aver rimosso il supporto, aggiungere 400 microlitri di mezzi di controllo o di stimolazione per pozzetto e posizionare la piastra di analisi in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 10% di anidride carbonica. Per la coltura tissutale ex vivo, rimuovere con cautela i fluidi utilizzando una pipetta ed evitare di applicare l'aspirazione.
A volte una, due, tre e quattro ore, raccogliere 200 microlitri di media, sostituirli con 200 microlitri del mezzo di controllo o di stimolazione appropriato e restituire la piastra di analisi all'incubatore. Conservare il piatto di raccolta a quattro gradi Celsius. Scongelare e mescolare i campioni.
Riscaldare i reagenti a temperatura ambiente e sciogliere un flacone di reagente colorante A usando un flacone di solvente A e un flacone di reagente colorante B usando un flacone di solvente B.Dopo aver creato una curva standard di acidi grassi liberi o FFA, pipettare standard e campioni in una piastra di dosaggio a 96 pozzetti. Il volume del campione consigliato è di 10 microlitri per pozzetto. Aggiungere 150 microlitri di reagente A a ciascun pozzetto e mescolare.
Incubare la piastra di analisi a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Leggere l'assorbanza della piastra a 550 nanometri e 660 nanometri e fare riferimento a questo come lettura A.Aggiungere 75 microlitri di reagente B a ciascun pozzetto e mescolare. Incubare la piastra di analisi a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, leggere nuovamente l'assorbanza della piastra a 550 e 660 nanometri. Fare riferimento a questa lettura come lettura B.Ricostituire il reagente di glicerolo libero con 36 litri di acqua ultrapura e acclimatarlo a temperatura ambiente. Scongelare e mescolare i campioni.
Creare una curva standard del glicerolo effettuando una diluizione seriale di 7,2 volte della soluzione standard di glicerolo e un bianco d'acqua. Pipettare 25 microlitri di ogni standard e prelevare campioni nella piastra di dosaggio a 96 pozzetti. Aggiungere 175 microlitri di reagente glicerolo libero a ciascun pozzetto e mescolare.
Incubare la piastra di analisi a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, leggere l'assorbanza della piastra a 540 nanometri. Seguire i passaggi descritti nel testo per calcolare i tassi lipolitici nei rispettivi valori R quadrati.
Quindi, utilizzando i tassi di produzione di FFA e glicerolo per ciascun campione come singolo punto dati, eseguire analisi statistiche e tracciare i valori se vengono confrontati diversi tassi lipolitici. Se si confrontano i tassi lipolitici ex vivo tra i genotipi, utilizzare due o tre campioni per animale come repliche tecniche e utilizzare la media per un punto dati per animale in modo che la dimensione del campione sia uguale al numero di animali. Quindi eseguire analisi statistiche con i dati.
La produzione di FFA e glicerolo nei preadipociti differenziati in vitro è stata lineare durante il test di quattro ore. I tassi lipolitici stimolati erano significativamente più alti dei tassi basali. Nelle cellule stimolate, il rapporto molare FFA-glicerolo era di circa tre, indicando la lipolisi dei trigliceridi senza significativa ricaptazione o ritenzione.
Nelle cellule non stimolate, il rapporto era di circa uno, suggerendo una fonte non lipolitica di glicerolo. Nelle colture ex vivo, pezzi di tessuto più grandi con un rapporto tra superficie e volume inferiore hanno mostrato una maggiore ritenzione di FFA, con conseguenti rapporti molari FFA-glicerolo più bassi. Nei pezzi di tessuto da 25 milligrammi, la ritenzione di FFA ha avuto un impatto negativo sui tassi di lipolisi.
Pezzi di tessuto molto piccoli hanno anche mostrato tassi lipolitici ridotti. La riduzione della BSA nei mezzi ha ridotto significativamente sia l'FFA che il rilascio di glicerolo. L'accumulo di FFA nel mezzo 5% BSA dopo 24 ore di stimolazione era di cinque millimolari mentre quello del mezzo 0,5% BSA era solo 0,6 millimolare.
I livelli di FFA nei media raccolti hanno raggiunto la zona di pericolo di 2,3 millimolari in tre ore. La mancanza di aumento dell'FFA medio e del glicerolo a quattro ore ha suggerito l'inibizione del feedback. L'esclusione del punto temporale di quattro ore ha causato un piccolo, ma significativo aumento dei tassi di rilascio.
Il tasso di rilascio di FFA era lineare anche tra i soliti punti temporali. Quando si rimuovono i mezzi dai campioni di lipolisi ex vivo, è importante assicurarsi che i pezzi di tessuto non vengano rimossi accidentalmente dalla pipetta. Potrebbe essere necessario misurare il contenuto proteico o lipidico in questi campioni per normalizzare correttamente i risultati.
