성상 세포는 직접적인 신경 프로그래밍을 목표로 삼는 흥미로운 자가 집단입니다. 이 프로토콜은 다른 영역 또는 중추 신경계로부터 고순도로 배양 성상 세포를 분리하는 신뢰할 수있는 기술을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시작 집단의 성상 세포 순도 차이와 같은 교란 요인없이 성상 세포가 기능적 뉴런으로 재 프로그래밍 될 수있는 능력을 조사하도록 설계 및 최적화되었습니다.
이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사후 연구원 인 Bob Hersbach와 실험실의 기술 지원 인 Tatiana Simon이 수행합니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 몸통을 35mm 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관하십시오. 가위로 피부를 열고 작은 가위로 척추를 제거하십시오.
그런 다음 척수를 추출하여 얼음 위의 해부 완충액에 넣으십시오. 2 배 배율의 정위 해부 현미경에서 집게를 사용하여 분리 된 척수에서 수막을 제거하고 해부 및 청소 된 척수 조직을 C 튜브로 옮겼습니다. 신경 조직 해리 키트에서 50 마이크로 리터의 효소 P와 미리 준비된 30 마이크로 리터의 효소 혼합물을 각 C 튜브에 추가합니다.
C 튜브를 뒤집어 가열된 해리 위에 올려 모든 조직이 튜브 뚜껑에 수집되도록 합니다. 800 마이크로리터의 성상세포 배양 배지를 첨가하고 포함된 플런저로 컬럼 밖으로 세포를 밀어내는 분리기로부터 컬럼을 제거하여 세포를 회피시킨다. 플레이트 세포는 이전에 제조된 배양 플라스크에 4.2 밀리리터의 성상세포 배양 배지를 첨가하여 EGF 및 bFGF의 밀리리터당 10 나노그램이 보충되었다.
다른 뇌 영역에서 분리된 성상교세포에 대해 배양 플라스크를 코팅할 필요는 없지만 척수에서 분리된 성상세포에 더 나은 기질을 제공합니다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 세포를 배양하십시오. 안전 수준이 1인 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 성상세포 안착을 수행하고 텍스트 원고에 설명된 대로 Poly-D-Lysine 코팅 유리 커버 슬립이 있는 24웰 플레이트를 준비합니다.
도금을 위해 P2 마우스에서 6 개의 척수를 분리하면 약 1 백만 개의 세포가 생성됩니다. 배양된 성상세포를 포함하는 T-12.5 배양 플라스크에서 배지를 흡인하고 1x PBS로 1회 세척합니다. 0.05% 트립신 EDTA 0.5밀리리터를 첨가하여 배양 플라스크에서 성상세포를 분리하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.
플라스크의 측면을 부드럽게 두드려 배양 플라스크 표면에서 세포를 방출하고 10배 배율을 사용하여 명시야 현미경으로 분리 상태를 확인합니다. 2.5 밀리리터의 성상 세포 배양 배지로 트립시 나제 화를 중단하고 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 수집하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 300RCF로 원심분리합니다.
상청액을 흡인하고 1 밀리리터의 성상 세포 배양 배지에서 세포를 재보냅니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용하여 세포 농도를 계산합니다. 세포 수에 기초하여, EGF 및 bFGF가 보충된 새로운 성상세포 배지로 세포 현탁액을 인자당 밀리리터당 10나노그램으로 희석한다.
이전에 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양 세포를 추가합니다. 49 밀리리터의 기본 배양 배지에 1 밀리리터 B27 보충제를 추가하여 신경 분화 배지를 준비하십시오. 24 내지 48 시간 후, 세포가 형질 도입되었는지 또는 형질 주입되었는지에 따라, 성상 세포 배지를 웰 당 1 밀리리터 뉴런 분화 배지로 대체한다.
세포를 섭씨 37도에서 9%이산화탄소로 배양합니다. 리프로그래밍 효율을 높이려면 성상세포 배지를 분화 배지로 교체할 때 포스콜린과 도르소모르핀으로 뉴런 분화 배지를 각각 30마이크로몰 및 1마이크로몰의 최종 농도로 보충합니다. 포스콜린 및 도르소모르핀으로 세포를 치료하기로 선택할 때 초기 치료 2일 후에 도르소모르핀의 두 번째 용량을 제공합니다.
이 두 번째 처리를 배양 배지에 직접 추가합니다. 성상 세포의 1 차 배양은 자기 보조 세포 분류 및 도금 후 7 일에서 10 일 사이에 80-90 % confluency에 도달했습니다. 도금 다음 날, 셀은 전형적으로 커버 슬립 표면의 50 내지 60%를 덮었다.
배양은 주로 이 단계에서 성상교세포로 구성되었지만 신경 모세포와 같은 다른 세포 유형은 사실상 없었습니다. 형질도입 또는 형질감염 후 7일째에, 유도된 뉴런 세포는 성상세포와 명확하게 구별될 수 있었다. 뉴런 세포 소마는 재프로그래밍되지 않은 성상세포보다 작았으며 과정이 길었고 뉴런 마커, 베타 3 튜불린에 대해 양성이었고 성상세포 마커 GFAP에 대해 음성이었습니다.
형질도입 또는 형질주입 후 21일째에 많은 유도 뉴런이 활동 전위를 발화할 수 있었고 성숙한 뉴런 마커 NeuN 및 범시냅스 단백질 시냅토피신에 대해 양성이었습니다. 관심 영역을 적절하게 해부하는 것이 필수적입니다. 주변 조직의 오염을 방지합니다.
격리 된 척수에서 수막과 등근 신경절을 제거하는 데주의를 기울여야합니다. 이 방법은 대뇌 피질, 등쪽 중뇌 및 소뇌를 포함한 중추 신경계의 다양한 영역에서 성상 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 앞으로이 기술을 통해 우리는 지역 성상 세포에 대한 지식과 기능적 뉴런으로 재 프로그래밍 될 수있는 잠재력을 확장 할 수 있습니다.
