생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

본 프로토콜은 마우스 턱밑샘에서 단단한 내피 접합부의 기능을 평가하기 위한 생체내 초세포 투과성 검출 측정을 기술한다. 그럼에도 불구하고 2 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경은 기존의 컨 포칼 현미경의 장점을 가질뿐만 아니라 더 깊은 조직과 이미지를보다 명확하게 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 이 실험은 다른 조직, 특히 동물의 표면 조직과 기관의 혈관 투과성을 평가하기위한 좋은 방법 측정을 제공합니다.

투과성 분석을 위한 형광 신호 간의 간섭을 최소화하기 위해 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 표지된 덱스트란 및 로다민 B(뚜렷한 여기 방출 스펙트럼을 갖는 표지된 덱스트란)와 같은 적절한 추적자를 선택하는 것으로 시작하십시오. 미량의 멸균 인산염 완충 식염수를 밀리리터 당 100 밀리그램으로 희석하고 빛으로부터 보호 된 분취량을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 8 내지 10주령의 수컷 야생형 마우스를 마취시킨 후, 마우스의 머리와 목을 부드럽게 잡고 안구의 한쪽이 약간 돌출되도록 한다.

100 마이크로 리터의 형광 추적 용액 혼합물이 들어있는 인슐린 주사기를 눈의 모서리를 따라 눈과 직각으로 삽입하십시오. 주사 후 팔다리와 머리를 테이프로 붙인 앙와위 자세로 골판지 위에 마우스를 빠르게 놓습니다. 턱밑샘 또는 SMG 분리의 경우 입체 현미경으로 일반 조직 가위로 목의 표피를 절단하여 SMG의 양쪽을 노출시킵니다.

다음으로, 무딘 조직 분리 바늘을 사용하여 샘 조직, 혈관 및 선 구조를 손상시키지 않고 샘 표면에서 캡슐을 부드럽게 분리합니다. 맞춤형 홀더를 음압 장치에 연결하고 음압 효과가 사전에 제대로 달성되었는지 확인하십시오. 노출된 SMG를 맞춤형 홀더에 부드럽게 놓고 가능한 한 마우스 몸에서 멀리 떨어진 음압 흡입으로 조직을 빨아들여 호흡 및 기타 조건으로 인한 운동 아티팩트를 줄입니다.

글 랜드 부위가 선택된 직후 이미징을 시작하십시오. Z축을 따라 순차적인 이미지를 획득하여 글랜드 표면으로부터 2 미크론까지 떨어져 최대 70 내지 140 미크론의 조직을 3차원 구축하여 생성한다. 다음으로, SMG에서 혈관 투과성을 측정하기 위해 혈관의 타임 랩스 이미징을 획득합니다.

탐색기 대화 상자에서 새 폴더 추가"를 클릭하고 파일 이름을 변경하십시오. 그런 다음 획득 열로 돌아갑니다. XY에서 형식은 512 x 512이고 속도는 400Hz입니다.

양방향 X"를 켜고 줌 비율을 0.75 및 줌 1.5로 설정합니다. 그런 다음 획득 모드"에서 XYT를 선택하여 타임랩스 이미징을 획득합니다. 실험 필요에 따라 지속 시간을 20초, 30분 이상으로 설정합니다.

조건을 설정 한 후 라이브"를 클릭하여 사진 형성 프레임에서 두 채널과 겹치는 채널의 혈관 영상을 관찰하고 관심 영역을 선택합니다. 클릭 스타트"이미징을 시작합니다. 생체내 혈관 투과성 분석, 및 마우스의 혈관의 3차원 이미지.

턱밑 땀샘이 여기에 표시됩니다. 대조군에서는 두 추적자 모두 SMG의 혈관에 존재했습니다. 분자량이 작기 때문에 FD4는 혈관에서 acini와 덕트의 기저부로 누출되어 acini와 덕트의 모양을 명확하게 묘사 할 수있었습니다.

RD70은 대형 혈관과 미세 혈관에 분포되었습니다. 덕트 결찰 그룹에서 FD4와 RD70은 모두 acini의 기저측으로 혈관을 외유출했으며, 이는 덕트 결찰이 내피 장벽 기능을 방해하고 큰 분자에 대한 투과성을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다. 또한, FD4 및 RD70 형광 강도 반정량 결과 이러한 관찰을 확인하였다.

3차원 이미지는 대조군에 비해 결찰 그룹의 혈관 주위에 FD4 및 RD70의 형광이 훨씬 더 가려진 것으로 나타났습니다. 신중한 SMG 분리와 적절한 배치 및 현미경은 성공적인 검출을 위한 필수 전제 조건입니다. 절차에 따라 적혈구의 움직임을 결합하여 혈류 속도를 계산할 수 있으며 형광 표지 된 혈액 세포의 침윤을 추적 할 수 있습니다.