EV의 심층적인 특성화는 어려울 수 있으며, 개별 파라미터를 설명하기 위해 여러 계측기가 필요합니다. 나노-유세포분석과 같은 단일 기술로 이러한 주요 기준을 측정하면 여러 EV 하위 집단을 동시에 설명합니다. 따라서 각 EV는 형광을 결정하기 전에 직경이 14나노미터보다 큰 입자를 라벨 없이 식별하여 개별적으로 측정됩니다.
이렇게 하면 가양성을 제거하여 강력한 데이터 집합을 만들 수 있습니다. 나노 유세포 분석은 혈장, CSF 및 배양 배지에서 농축 된 것을 포함하여 다양한 소스의 EV에 적용될 수 있습니다. 이 기술은 바이러스, 지질 나노 입자 및 나노 물질의 분석에도 사용됩니다.
라벨링 프로토콜을 최적화하는 것이 중요합니다. 이것은 완충액에 남아 있는 잔류 형광과 비교하여 입자와 관련된 모든 형광을 최대화합니다. 시작하려면 기기를 켜고 Nano-Flow 프로페셔널을 로드한 다음 시스 플로우 드롭다운 메뉴에서 시작을 선택하고 로딩 베이에 물을 로드한 다음 시스 플로우 드롭다운 메뉴에서 부스트를 선택합니다.
QC 비드를 0.6 마이크로리터 튜브의 증류수에 1에서 100까지 희석하고 로딩 베이에 넣어 샘플을 시스템에 도입합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 샘플을 45초 동안 부스트하여 이전 샘플, 물 또는 세척액을 완전히 대체합니다. 부스팅하는 동안 QC 비드에 대한 사전 설정 템플릿에 대한 레이저 출력을 250나노미터 FL QC 표준으로 설정합니다.
나중에 시스템 압력을 줄이려면 동일한 드롭다운 메뉴에서 샘플링 압력을 선택하고 자동 샘플링 압력을 1킬로 파스칼로 설정하여 일정한 압력을 유지합니다. 그런 다음 획득 컨트롤에서 기록 시간을 선택하여 1분 분석을 시작합니다. 데이터는 측면 산란 강도에 대한 로그 스케일과 선택된 형광 강도를 보여주는 점도표에 플롯됩니다.
파일을 저장하기 전에 파일 이름과 샘플 희석액을 삽입하십시오. 그런 다음 언로드를 선택하여 로딩 베이에서 튜브를 제거합니다. QC 비드를 150마이크로리터의 세척액으로 교체하고 부스팅을 선택하여 30초 이상 청소합니다.
150마이크로리터의 물이 포함된 튜브를 사용하여 팁을 물에 담가 모세관 팁에서 과도한 세척액을 제거합니다. 그런 다음 크기 표준 비드를 물에 1 내지 100으로 희석하고 로딩 베이 내로 100 마이크로리터를 적재한다. 이제 레이저 출력을 사전 설정 템플릿 S16 EXO 68을 155나노미터로 설정합니다.
이 설정은 크기 표준과 200나노미터보다 작은 EV를 포함하는 샘플 모두에 적용됩니다. 샘플링을 선택하고 1분 동안 샘플 기록을 진행합니다. 물 또는 PBS 샘플로 세 번째 측정을 수행하여 블랭크 측정 평가 절하를 생성하여 소프트웨어에서 제거할 오탐을 식별합니다.
표지되지 않은 EV 샘플을 nFCM 분석을 위해 밀리리터당 1배 내지 10 내지 8회 내지 5회 10 내지 8번째 입자의 적합한 입자 농도 범위로 PBS 중에 희석한다. 그리고 10 내지 100 마이크로리터의 희석된 샘플을 로딩 베이에 로딩한다. 입자 농도를 알 수 없는 경우 EV 샘플을 1-100회 희석하여 시작합니다.
시료 농도는 부스팅 중 CCD 카메라의 레이저 스폿 크기 또는 샘플링 중 이벤트 버스트 트레이스 관찰을 통해 빠르게 근사화할 수 있습니다. 로드된 샘플이 45초 동안 부스트되면 1분 동안 기록하고 앞에서 설명한 대로 파일을 저장합니다. 기록 후이 데이터 분석을 시작하고 수집 탭에서 분석 탭으로 전환하고 저장된 NFA 파일을 엽니 다.
정확한 샘플 측정을 위해 샘플링 측정 전에 수행 한 두 개의 표준 측정을 사용하여 샘플 비교 값과 블랭크를 설정하십시오. 크기 표준 파일을 선택하고 임계값 설정 도구를 사용하여 측면 산란-지름 변환을 위한 크기 표준 곡선을 생성합니다. 이벤트 버스트 추적에 표시되는 임계값은 이벤트가 중요한 것으로 간주되는 데 필요한 최소 신호 강도를 식별합니다.
임계값을 설정한 상태에서 점도표 파라미터 X축의 SS-H 또는 SS-A와 Y축의 FITC-A를 확인합니다. 표준 곡선 생성 도구를 열고 크기 조정 템플릿으로 S16 EXO 68 - 155나노미터를 선택합니다. 피크 찾기를 클릭하여 피크 측면 산란 강도를 68, 91, 113 또는 155나노미터 직경의 입자로 식별합니다.
창을 닫기 전에 지름 곡선으로 산란된 변이 R 값이 1에 가까운 생성되었는지 확인합니다. 농도 표준을 설정합니다. 저장된 파일을 선택하고 표준 카운트를 클릭 한 다음 표준의 입자 농도를 입력하십시오.
표준 정보를 설정합니다. EV 샘플 파일을 선택하고 임계값을 설정합니다. 빈 파일을 선택하고 공백으로 설정을 클릭하여 샘플 수에서 제거할 가양성 수를 식별합니다.
PDF 생성 도구가 열리면 샘플의 크기, 농도 및 희석을 확인합니다. 그런 다음 샘플의 농도와 입자의 크기 분포를 보여줍니다. 원고에 설명된 대로 EV 샘플을 라벨링한 후 라벨링된 샘플 1마이크로리터를 취하여 0.6밀리리터 튜브의 PBS에서 1 내지 50으로 희석합니다.
샘플을 로딩 베이에 넣고 45초 동안 부스팅 압력을 가합니다. 또한 올바른 레이저 설정과 적절한 렌즈가 로드되었는지 확인하십시오. 이제 샘플링 압력으로 전환하고 기록 할 시간을 선택하십시오.
1분 동안 수집한 후 데이터 파일의 이름을 지정하고 저장합니다. 샘플을 언로드하고, 세척액으로 교체하고, 이전에 설명된 대로 다음 라벨이 부착된 샘플을 로드하기 전에 세척액을 30초 이상 부스트합니다. PDF 생성의 경우 이전에 설명한 것과 동일한 표준을 적용합니다.
공백 측정만 다르게 설정됩니다. 샘플 파일을 선택하고 임계값을 설정합니다. 게이팅 도구를 선택하고 왼쪽 클릭을 사용하여 형광 양성 모집단을 구분하는 선을 그립니다.
표현할 이름과 색상을 설정합니다. 빈 파일을 설정하고 공백으로 설정을 클릭하여 각 다른 모집단에서 제거할 가양성 수를 식별합니다. PDF 생성 도구를 열고 형광 양성 부분집단의 크기 분포, 농도 및 백분율을 식별합니다.
점도표에서 Y축을 변경하여 녹색 또는 빨간색 채널의 형광 측정값을 표시합니다. 공백을 설정하고 앞에서 설명한 대로 PDF를 생성합니다. 점도표에서 X축을 FITC로 설정하고 Y축을 APC로 설정합니다.
사분면 도구를 활용하여 이중 형광 양성 집단을 식별합니다. 대표할 이름과 색상을 설정한 다음 PDF 파일을 열고 형광 부분집단을 선택합니다. C2C12 유래 EV는 약 50%CD9, 30%CD63 프리젠테이션을 나타냈으며, 70%인구는 3개의 EV 마커 중 하나 이상을 나타냈다.
단일 테트라스파닌 표지 EV 하위 집단에 대한 크기 프로파일은 전체 입자 집단에 비해 약 75 내지 85 나노미터의 더 큰 중간 크기 및 65 나노미터 미만의 EV 미만을 나타내었다. SW620 유래 EV는 약 40%CD9, 7%CD63 프리젠테이션 및 42%의 입자가 3가지 마커 중 하나 이상을 갖는 것으로 나타났습니다. SW620 유래 테트라 스파닌 표지 EV는 개별 테트라 스파닌 양성 하위 집단간에 유사한 분포를 갖는 90에서 110 나노 미터 사이의보다 정규 분포와 더 큰 중앙값 직경을 보였다.
멤브레인 라벨링은 C2C12 및 SW620 유래 EV의 80% 양성을 반복적으로 보여주었습니다. 측면 산란 강도는 C2C12 및 SW620의 점도표에서 FITC 강도와 상관 관계가 있습니다. 이중 양성 백분율은 테트라 스파닌 양성 백분율과 매우 유사합니다.
그리고 CD63 표지는 막 표지와 가장 약한 상관 관계를 보이는 것으로 보입니다. 백분율 양성 측정은 추가 막 표지가 있는 항체 표지와 없는 항체 표지 간에 유사했습니다. C2C12 유래 EV의 형광 집단에 대한 평균 형광 강도는 CD9 EV에 비해 CD63 및 CD81의 더 낮은 발현을 시사하는 반면, SW620은 세 가지 항체를 모두 사용하는 것이 개별 항체 표지보다 더 큰 형광 신호를 제공한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜에서 일반적인 EV 마커는 형광 표지되었지만 많은 항체 표적을 선택하여 EV 기원을 보여줄 수 있습니다. EV 기능 또는 질병 상태.
