This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.

자성 나노 입자의 1. 커플 링 (MNPS) <ol><li> 상업 커플 링 절차 및 항체 (ABS)과 커플 MNPS에 시약 (일반적으로 1 mg)을 사용합니다. 카복실산 반응성기를 갖는 산화철 나노 입자가 사용된다. <ol><li> 항체는 부피 이상 0.5 ㎖의 경우, 100,000의 농축기를 이용하여 농축시킨다. 3 ~ 5 분 동안 2,000 XG에 스핀. </li></ol></li><li> 프로 시저의 끝에서, 급냉 완충액 10 μl를 첨가 한 후, 12mm X 75mm 튜브 MNPS 전송 및 3 mL의 세척 / 저장 버퍼를 추가한다. 자기 분리기의 중심 구멍에 튜브를 넣고 4 ℃에서 하룻밤 둡니다. </li><li> MNPS 모두 튜브의 측면에 수집 한 후 신중하게 모든 액체를 피펫 있는지 확인합니다. 신선한 세척 / 저장 버퍼 3 ML을 추가, 다시 자석에 배치합니다. </li><li> 몇 시간 후, MNPS는 상기 튜브 측으로 수집되었는지 확인하고 액체를 피펫. 에 세척 / 저장 버퍼 2 ㎖를 사용하여MNPS을 재현 탁하고 4 ℃에서 저장한다. </li><li> (2 절에 설명 된대로 캡처를위한 마우스 단일 클론 순이를 사용하는 경우 예를 들어, 염소 항 - 마우스) 애비는 관련 형광 팹 항체 단편을 라벨에 의해 MNPS에 연결되어 있는지 확인하고 흐름 cytometer에서 실행됩니다. </li></ol> MNPS에 결합 2. 라벨 항체 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 캡처 순이의 이소 특정 MNPS의 (조건에 따라) 60 μL (3.9 × 10 (12) 입자) 및 (200 μg의 / ㎖ 상용 솔루션의) 5 ㎕를 표시 Fab 단편을 결합합니다. </li><li> 계속 혼합하면서 30 분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션. </li><li> 5 분 동안 1,500 XG에서의 microcentrifuge에 인산염 완충 식염수 (PBS)와 스핀의 300 μL와 10 만 집중을 사전 젖은. </li><li> 10 만 열 레이블이 단지를 정화. 200 ㎕의 PBS로 세척, 5 분 동안 1,500 XG에서의 microcentrifuge 단계 2.2에서 혼합물을 스핀, 그리고 회복초기 볼륨. </li></ol> 레이블이 AB-MNP 단지의 3.는 관심의 입자 (바이러스 또는 전기 자동차)를 캡처하기 <ol><li> HIV (60 μL) 또는 EV 준비 (100 μL)을 미리 표시 MNPS 60 μL (3.9 × 10 (12) 입자)를 품어. <ol><li> 다양한 방법을 사용하여 EV 준비를 준비합니다. 여기에, 자당 그라디언트에 전기 자동차를 정화 엑소 좀 침전 시약을 사용하여 혈소판 가난한 플라즈마에서 그들을 수집 또는 플라즈마에서 직접 분리 8. 주 : 최적 비율은 각 실험에 대해 결정해야하고 준비 바이러스 / EV의 농도에 의존한다. MNP-Ab의 분율은 ~를 초과 10 6 바이러스 / EV 분획의 농도와 비교해야한다. </li></ol></li><li> 바이러스 부드러운 혼합 37 ° C에서 40 분, 또는 전기 자동차 4 ° C에서 1 시간을 품어. </li><li> , 된 Fc 부드럽게, 소용돌이 결합 차단 실온에서 3 ~ 5 분 부화 2.5 % 마우스 IgG의 / 인간 IgG를 추가합니다. </li><li>각 검출 애비의 제조업체 권장 또는 역가 농도를 추가하고, 실온에서 추가로 20 분을 품어. </li></ol> 언 바운드 항체의 MNP-캡처 비리 (또는 전기 자동차가) 자기 열을 사용하여 4. 분리 <ol><li> 분리 자석에 배치하여 사용하기위한 자기 분리 컬럼을 준비합니다. </li><li> 세척 완충액 (2 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA), 0.5 % 소 혈청 알부민에 PBS (BSA)) 500 μL와 열을 사전 습윤. 세척 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 허용한다. </li><li> 컬럼에 MNP 바이러스 / MNP-EV 단지를 추가하고 모든 액체가 흐를 수 있습니다. 전체 볼륨이 통과 할 수 있도록 컬럼에 세척 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 세척 버퍼 2 회 이상으로 반복 세척. </li><li> 유지 된 MNP 바이러스 / MNP-EV 단지의 수집을위한 X 75mm 튜브 12mm 자석과 장소에서 열을 제거합니다. 열이 3 분의 자석 오프 튜브에 서 보자. PBS의 200 μl를 추가하자구슬은 PBS의 또 다른 200 μl를 추가, 중력에 의해 아래로 흘러 용출 후 200 ㎕를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정한다. 참고 : 파라 포름 알데히드는 발암 물질로 의심하고 통풍이 잘되는 후드에서 처리되어야하며, 장갑을 착용한다. </li><li> 하나의 비리를 정량화하기 / 전기 자동차는 높은 처리량 샘플러 (HTS) 또는 직전 취득 카운트 구슬 세포 계측법 잘 혼합 된 흐름을 추가에 체적 설정을 사용합니다. </li></ol> MNPS-캡처 바이러스의 5 분석 / 플로우 사이토와 전기 자동차 <ol><li> 30 분 동안 유동 세포 계수기를 따뜻하게. </li><li> 실행 품질 관리 구슬. </li><li> MNPS 또는 라벨이 바이러스 / 전기 자동차 중 하나의 형광에 설정 임계 값. 배경 &quot;노이즈&quot;를 감소 임계 값에 대해 PBS 필터 0.22 μm의를 사용합니다. 이벤트를 필터링 PBS가 더 제공 여기서 레벨의 PMT 전압을 조정하여 임계 값을 설정하지 않거나 거의. </li><li> 낮에 실행 샘플. 합니다 (뒤에 직렬로 배치 칼집 유체에 대한 추가 0.04 μm의 인라인 필터를 사용하여표준 0.2 μm의 외장 필터 추가) 거짓 이벤트를 제거합니다. </li></ol> 캡처 효율 6. 평가 <ol><li> 3.1, 3.2에 기술 된 바와 같이 형광 표지 된 전기 자동차 또는 MNP-애비와 HIV를 캡처합니다. (전기 자동차는 막 염료 또는화물을 통해 중 하나를 표시 할 수 (15); HIV 유전자 부호화 염료 (16)를 통해 어느 표지 또는 막 염색 12, 17)으로 할 수있다. </li><li> (4.1-4.2)에 설명 된대로 자기 분리 컬럼을 준비합니다. </li><li> 컬럼에 MNP 바이러스 / MNP-EV 단지를 추가하고 모든 액체 (분수를 통해 흐름)를 통과 할 수 있습니다. 튜브 부분을 통해 흐름을 수집합니다. </li><li> (4.4-4.5)에 설명 된대로 열을 유지 비율을 진행합니다. </li><li> 이후 분리 (4.1-4.5)와 6.3에서 분수를 통해 흐름에 반복 캡처 절차. </li><li> 첫 번째 캘리포니아에서 유지 분수를 분석그 사이토을에 실행하여 pture와 두 번째 촬영은 전기 자동차 또는 HIV의 형광 라벨에 트리거에 설정되어 있습니다. 효율을 평가하기 위해, 두 분획의 이벤트의 수를 비교한다. </li></ol> 특정 작업에 대한 의정서 7. 적응 주의 : 전술 한 바와 같이, 프로토콜 DENV의 분석, HIV 및 전기차의 분석에 적용 할 수 있지만, 다음과 같은 변형이 도입되어야한다 : <ol><li> RT에서 30 분 동안 어두운 데에서 1 μM DII와 비리 부화. 부화 후없이 브레이크와 4 ° C에서 1.5 시간 동안 240,000 XG에 밀도 구배 매체에서 원심 분리 (10 %, 20 %, 25 % 및 35 %)에 의해 스테인드 바이러스를 정화. 20 % 및 25 %의 밀도 구배 매질 층 (14) 사이에서 분획을 수집한다. </li><li> DII는 실온에서 20 분 동안 2.5 % 마우스의 IgG의 존재 검출 순이의 제조업체 권장 또는 역가 농도 DENV 1 × 10 7 (60 μl를) 표시 품어. </li><li> Incub부드러운 혼합 37 ° C에서 40 분 동안 미리 라벨링 60 μL (3.9 × 10 (12) 입자) MNP 캡처 Ab의 복합체와의 혼합물을 먹었다. </li><li> 상기 한 바와 사이토 흐름 분석으로 자기 열에 언 바운드 애비에서 분리 된 결과 단지. </li></ol>

<ol>
	<li>Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+host-encoded+proteins+by+nascent+HIV-1.">The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1.</a> Immunol Today. 19 (8), 346-351 (1998).</li><li>Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-producing+cells+determine+the+host+protein+profiles+of+HIV-1+virion+cores.">Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores.</a> Retrovirology. 9, 65 (2012).</li><li>Wolf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+significance+of+platelet+products+in+human+plasma.">The nature and significance of platelet products in human plasma.</a> Br J Haematol. 13 (3), 269-288 (1967).</li><li>Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microparticles:+pathophysiology+and+clinical+implications.">Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications.</a> Blood Rev. 21 (3), 157-171 (2007).</li><li>Bernal-Mizrachi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+circulating+endothelial+microparticles+in+patients+with+acute+coronary+syndromes.">High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes.</a> Am Heart J. 145 (6), 962-970 (2003).</li><li>Rozmyslowicz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-+and+megakaryocyte-derived+microparticles+transfer+CXCR4+receptor+to+CXCR4-null+cells+and+make+them+susceptible+to+infection+by+X4-HIV.">Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV.</a> Aids. 17 (1), 33-42 (2003).</li><li>Bhattarai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GB+virus+C+particles+inhibit+T+cell+activation+via+envelope+E2+protein-mediated+inhibition+of+TCR+signaling.">GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling.</a> J Immunol. 190 (12), 6351-6359 (2013).</li><li>Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+composition+of+single+nano-sized+extracellular+blood+vesicles.">Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles.</a> Nanomedicine. 11 (3), 489-498 (2015).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+flow+virometry+for+the+analysis+of+individual+virions.">Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions.</a> J Clin Invest. 123 (9), 3716-3727 (2013).</li><li>Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemiluminescent+labels+released+from+long+spacer+arm-functionalized+magnetic+particles:+a+novel+strategy+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+pathogen+infections.">Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (1), 774-781 (2015).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+based+on+magnetic+enrichment+and+magnetic+separation.">Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation.</a> Theranostics. 3 (2), 85-92 (2013).</li><li>Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+separations+in+biotechnology.">Magnetic separations in biotechnology.</a> Biotechnol Adv. 31 (8), 1374-1385 (2013).</li><li>Xi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+HBsAg-Specific+DNA+Aptamers+Based+on+Carboxylated+Magnetic+Nanoparticles+and+Their+Application+in+the+Rapid+and+Simple+Detection+of+Hepatitis+B+Virus+Infection.">Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11215-11223 (2015).</li><li>Zicari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+maturation+of+individual+Dengue+virions+with+flow+virometry.">Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry.</a> Virology. 488, 20-27 (2016).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nat Commun. 6, 7029 (2015).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> J Cell Biol. 159 (3), 441-452 (2002).</li><li>Morcock, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+retroviral+infectivity+by+N-ethylmaleimide+with+preservation+of+functional+envelope+glycoproteins.">Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins.</a> J Virol. 79 (3), 1533-1542 (2005).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Flow Cytometry. , 101-223 (2005).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

종래의 유동 세포 계측기 개별 레벨 (18)에 물리적, 화학적 특성에 기초하여 세포를 분석하기위한 중요한 도구가 남아있다. 흐름의 기본 원리는 계측법 개발 이후 변경되지 않았 : 레이저 빔을 통과하여 빛을 산란 세포는 세포 - 결합 형광성 항체에 의해 방출 된 형광 스펙트럼의 기록을 트리거하는 이벤트를 구성한다. 그들은 대부분 18 광 수집하지 않습니다 사이토 흐름하는 더 큰 각도에 따라 더 많은 빛을 산란으로 300 나노 미터 아래 작은 입자는 사이토의 측면 산란에 의해 감지 할 수 없습니다. 여기에 설명 된 기술은 식별 및 형광 트리거링과 기존의 유동 세포 계측기에 의한 다수의 개별 바이러스 나 전기 자동차에 여러 항원의 분석을 할 수 있습니다. 프로토콜 내의 중요한 단계는 MNPS에 대한 항체의 결합이다. 우리의 실험은 perfor했다메드 반응성기를 카르 복실 산으로 15 nm의 산화철 나노 입자를 사용하는 것은 전술 한 바와 같이 9. 제조사에 따라, 각 15 nm의 MNP 20 항체에의 최대 결합 수있다; 우리는 약 15 nm의 MNP 당 10 항체를 결합한다. 이 추정은 이전 및 이후에 결합 된 항체의 양 및 나노 입자 특성 및 크기 조정 수단에 의해 측정 된 비드 / ㎖의 수에 기초한다. 원칙적으로, 커플 링은 입자의 응집을 일으켜 바람직하지 못하다있다. 그 집계가 우리의 프로토콜 발생하지 않습니다 확인하기 위해, 우리는 나노 입자의 특성 및 크기 조정 계기로이 문제를 확인했습니다. 이 악기는 코팅 및 항체 층이 아닌 만 15 나노 코어를 포함하는 입자의 유체 역학적 직경을 측정한다. 우리는 결합 구슬의 대부분이 단일 피크에있는 것을 (73 ± 7.3 nm의 아래에있는 모든 이벤트의 90 %와 64.7 ± 4.2 nm에서 피크를 의미) 발견했다. AB-MNP 공동의 혼합오른쪽 비례 비리 또는 전기 자동차와 mplexes는 MNPS가 전기 자동차 / 비리보다 몇 배의 농도에 매우 중요하다. 이것은 하나의 전기 자동차가 / 비리 분석되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 저 유량에서 사이토 실행하여 이벤트의 우연을 피하십시오. 형광의 포착을 트리거하고 캡처 엔티티의 농도를 측정 체적 컨트롤을 사용하여 확인. 그러나 MNPS는 가교하거나 같은 나노 입자에 두 개 이상의 비리의 결합에 의해 전기 자동차 나 비리를 집계 할 수 있습니다. 이를 확인하기 위해,도 4에 기재된 바와 같이 응집에 대한 테스트가 수행되어야한다. 비록 개별적으로 포착 비리 나 전기차 동시에 흐름 cytometer의 레이저 광을 입력 할 수있다. 이 두 개의 서로 다른 항원에 대한 거짓 양성을 만들 것입니다. 이를 방지하기 한 바와 같이 플로우 사이토 설정되어야하며, 제제는 희석한다. 하나는이를 사용하여 일치 일어나고 있는지 확인할 수이전 지점에 설명 된대로 전략. 또한, 일치의 부족 제제의 희석액을 분석 및 형광 염색 항원의 평균 형광 강도 모든 희석액 (도 5)에서 일정하게 유지하면서 이벤트 수가 희석 선형 적으로 감소하는 것이 증명에 의해 확인 될 수있다. 또 다른 문제는 너무 적은 바이러스 / 전기차가 포착 될 수 있다는 것이다. 이는 바이러스 /가 특정 MNPS에 의해 포착되는 항원을 수행하는 전기 자동차의 진정한 부족을 할 수 있습니다. 대안 적으로, 포획 효율은 다양한 원인 낮다 (예를 들어, MNPS,이 프로토콜을 위해 개발 된 비리 온 / 전기차에 MNPS의 비율로부터의 편차 등의 비효율적 항체 결합). 후자의 가능성을 방지하기 위해 캡처의 효율이 구체적으로 평가되어야한다. 전형적으로, 효율은도 6에서와 같이 약 90 %이어야한다. 다른 항체에 의한 방해 할 수 있습니다서로 또는 MNPS에 결합 된 항체와 입체 장해. 이 무료 부동 애비에서 이후의 분리와 AB-MNP 복합체에 의해 최초의 형광 검출 복근으로 염색해야 제 7 간단히, 비리 또는 전기 자동차에 설명하고 포착 역 캡처 프로토콜 (테스트해야합니다 발생하지 않았 음을 확인하려면 자기 열입니다. 흐름 virometry는 비리 또는 전기 자동차의 항원 성분의 분석 기존의 방법에 대하여 상당한 이점이있다. 일상적인 생화학 적 방법은 준비에서 특정 단백질의 일반적인 존재에 대해보고 있지만, 비리 또는 전기 자동차의 이질성에 관한 정보를 제공합니다. 이 대형 시중에서 판매하는 입자에 비리 또는 전기 자동차의 immunocapture을 포함한다. 이러한 입자는 직경이 수 미크론의 통상적으로 그들 각각은 비리 나 전기차의 수백 또는 수천을 포착 할 수있다. 따라서, 이후 분석 평균화 비리 / 전기 자동차의 특성하나의 입자에 의해 캡처. 대조적으로, 플로우 virometry 이벤트 중 적어도 90 %가 단일 비리 또는 단일 EV를 나타내는 직경과 설명 프로토콜 10-15 nm 인 MNPS를 사용한다. 주요 제한은 준비 비리 또는 전기 자동차의 전체 인구가 분석되지 않을 수 있다는 것입니다,하지만 그 포착되는. 따라서, 비리 나 전기차가 캡처되는 항원의 선택이 중요해진다. 또한, 다른 항원의 개수 (상이한 항원에 대한 형광 항체 수) 계측법 달리 흐름 비리 나 전기차의 작은면에 의해 제한된다. 마지막으로, 다른 항체를 입체적으로 인해 작은 (세포에 비하여) 표면에 다시 서로 간섭 할 수있다. 현재의 프로토콜들이 포착 될 수있는 특정 항체를 사용할 수 있는지, 어떠한 바이러스 나 원산지 EV 분석하도록 구성 될 수있다. 개인 비리 허가에 항원 분석의 연구자들은 바이러스 집단의 다른 분수의 발병을 해결합니다. 또한, 플라즈마에서 개별 전기 자동차의 식별이 가능한 특정 세포에 전기 자동차의 출처를 추적하고 정상 또는 병적이 세포의 조건들이 상주하는 기관에 대해보고 할 수 있습니다.

다세포 생물의 세포는 특정 세포에 대해 고유 될 적어도 세포의 고유 한 그룹에 속할 수 많은 개인 기능을 가지고 있습니다. 자신의 다양한 형태에 의해 입증도 배양 복제 된 세포는 각각의 특성을 보여줍니다. 또한, 셀의 개성이 분비 제품에 반영된다. 바이러스 감염의 경우, 바이러스 입자들을 생성 세포로부터 단백질을 수행 할 수있다. 예를 들어, HIV 많은 숙주 세포 단백질은 바이러스 외피에 포함되어 다른 셀들에 의해 생성 된 바이러스는 단백질 특성이 1, 2 또는 &quot;셀 서명&quot;을 운반 할 수있다. 심지어 감염없이, 세포는 주변 매체 작은 세포 외 소포 (전기 자동차)에 놓습니다. 이 소포 많은 경우에 그 구조의 생합성은, 바이러스의 특히 레트로 바이러스를 그 유사. 최근 몇 년 동안이 명백 해졌다초기 &quot;혈소판 먼지&quot;(3)로 간주 하였다 전기차는 세포 간 통신의 중요한 생리 학적 시스템을 구성하고있다. 함께 간 통신, 즉 세포 - 세포 접촉 상호 작용과 발표 수용성 분자의 두 개의 다른 시스템과, 전기 자동차 정상적인 생리를 조정하고 다양한 병리 바이러스 감염 6, 7을 포함, 4, 5로 변경된다. 발표 바이러스 입자와 세포 외 소포 모두가 매우 다양하지만, 그들은 그들의 각각의 특성이 손실되는 대량 분석에 의해 주로 특징이다. 서로 다른 표면 항원에 기초하여 세포 표현형을 유세포 유사한 방법이, 각각의 바이러스 및 바이러스 - 유사 입자를 특성화하는데 필요하다. 불행히도, 전기 자동차 또는 작은 비리 표준 플로우 사이토을 사용하여 분석 할 수없는metry 방법은 대부분의 세포 계측기가 트리거 의존하는 광 산란 신호를 생성하기에는 너무 작기 때문이다. 이 한계를 회피하기 위해, 트리거 형광 적용 할 수있다. 전기 자동차 또는 비리가 형광 항체로 염색하는 경우 그러나, 그것은 때문에 비슷한 형광과 유사한 크기의 무료 항체 및 집계 구별하기가 어렵습니다. 최근에, 우리는 규칙적인 흐름 세포 계측기 8, 9를 사용하여 각각의 작은 입자에 항원의 특성을 가능하게하는 나노 기술 기반의 높은 처리량 방법을 개발했다. 다양한 어플리케이션 10, 11, 12, 13 다른 그룹에 의해 기술 된 바와 같이 우리가 관심 immunocapture 입자에 고용 MNPS; 그러나, 우리의 새로운 기술은 개별 정시의 캡처 할 수 있습니다FIC 대상 무료 부동 항체의 간섭없이, 빛의 산란이 아닌 트리거 형광을 사용하여 유동 세포 계측법에 의해이 캡처 된 입자의 표현형 하였다. 이 방법은 광범위한 응용을 가지며, 생체 내에서 세포에 의해 생성 된 viral- 비 바이러스 작은 입자의 항원 성 조성물을 특성화하는데 사용될 수 있고 체외 표면 항원에 대한 특이 항체를 형광의 가용성을 제공 하였다. 우리는 이미 여러 생물학적 문제를 연구하는이 기술을 적용했습니다. 특히, 우리는 각각의 HIV-1 입자 9 숙주 세포 마커의 분포를 평가, 우리는 그 표면 단백질 (14)의 분석에 기초하여 개개의 뎅기 바이러스 (DENV)의 성숙을 연구 건강한 지원자 및 환자의 혈류로 방출 전기차 조사 급성 관상 동맥 증후군 (ACS)와 함께. 유사한 원리에 기초하지만,새로운 기술의 적용은 아래에 설명되어 특정 프로토콜의 개발이 필요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Materials</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits</td>
			<td style="width:164px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:119px;">ICK-15-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:164px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC810024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">DEPC treated water</td>
			<td>Quality Biological&#160;</td>
			<td style="width:119px;">351-068-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperMAG-01 magnetic separator&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:119px;">SuperMAG-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1&#160;Labeling Kit</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Z25055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k</td>
			<td style="width:164px;">Pall Corp</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">EDTA 0.5M</td>
			<td style="width:164px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin solution</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9576-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde, EM Grade, Purified</td>
			<td style="width:164px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">123count eBeads&#160;</td>
			<td style="width:164px;">eBioscience</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">CytoCount beads</td>
			<td style="width:164px;">Dako</td>
			<td>S2366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">AccuCheck count beads</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PCB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytometer Setup &#38; Tracking Beads Kit (CST)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>642412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Vybrant DiI Cell-Labeling Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Equipment</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#181;MACS column&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">OctoMACS Separator magnet</td>
			<td style="width:164px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">NanoSight NS300</td>
			<td style="width:164px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">BD LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:164px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">none</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:423px;">Software</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Flowjo software</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">BD FACSDiva software</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow virometry to analyze antigenic spectra of virions and extracellular vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

HIV-1 비리에 의한 세포 항원의 선택적 캡처 &quot;흐름 virometry&quot;으로 개별 바이러스 입자에 휴대 항원을 시각화 할 수있게되었습니다. 예를 들어, 우리는 HIV-1, LFA-1 및 HLA-DR에 의해지지 개의 세포 항원에 초점을 맞추었다. 이전 두 항원 벌크 (1) 분석 HIV-1 제제에 확인되었다. 우리는 MNPS가 봉투 HIV 단백질 VRC01에 대한 항체 중 하나와 결합하고, (말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 생성 된 HIV-1 LAI.04 또는 HIV-1 SF162)이 MNPS HIV-1 비리로 촬영 준비했다. 또한, 우리는 2G12, 다른 항 봉투 항체 이러한 비리 스테인드. 흐름 virometry은 LFA-1 및 HLA-DR의 존재에 대한 HIV-1 비리 높은 얼룩이 보였다. 평균 16.7 ± 2.0 %에서 (N = 6) 및 8.6 ± 0.3 % (N = 3) LFA-1과 HLA-DR 실시 HIV-1 LAI.04 비리의,각기. 만 4.8 ± 0.6 % (N = 3) 모든 비리의 두 항원에 양성이었다. 다른 HIV-1 균주에서 HIV-1 SF162,이 항원은 20.0 ± 4.4 %에 존재했다 (N = 6) 및 10.8 ± 1.3 % (N = 6) 각각 비리의 두 항원은 6.5 ±에 의해 수행되었다 반면, 0.4 % (그림 1). 세포 단백질의 분포는 바이러스 복제 세포에 의존적이었다. PBMC를 감염에 의해 생성 된 것과 상이한 항원 비리 생성 된 Jurkat 세포를 HIV가 감염. 된 Jurkat 세포에 의해 생성 된 HIV-1 비리 LAI 0.4 1.6 ± 1.4 %를 수행 (N = 3) 1.6 ± 0.7 % (N = 4) LFA-1 및 HLA-DR 각각. 된 Jurkat 세포에서 생성 된 HIV-1 비리 SF162, 이들 파라미터 (N = 4) 7.2 ± 2.5 % (N = 3) 5.6 ± 2.7 %였다. 따라서, (적어도 HLA-DR 및 LFA-1) 항원 메이크업은 HIV-1 LAI.04 개의 상이한 세포에 의해 생성 달랐다유형 (P &lt;0.02). 뎅기 바이러스 평가에 적용 virometry 흐름 DENV 성숙은 비리에 PRM 단백질의 발현과 관련된다. 우리는 성숙한 바이러스를 구성 BHK-1에서 제조 DENV의 어떤 부분과 LoVo 세포에서 평가하는 흐름 virometry을 적용했다. 비리는 지질 염료 DII으로 염색 하였다. 개별 캡처 비리의 분석은 48.2 ± 5.3 %에 PRM을 밝혀 (N = 8) DENVs의. 대조적으로, 84.5 ± 3.4 % (N = 4) DENV PRM의 실시 LoVo 세포에서 생성. 비리의 나머지 각각 51.8 ± 5.3 % (N = 8) 및 15.5 ± 3.4 % (N = 4)이었다 PRM 마이너스 (그림 2). 따라서, 유동 virometry 미숙 (또는 부분적으로 성숙) DENV 비리에서 완전히 성숙한 DENV 개인을 구별 할 수있다. 세포 외 소포 건강의 혈류로 방출급성 관상 동맥 증후군을 가진 자원 봉사자들과 환자 (ACS) ACS와 건강한 환자에서 다른 EV의 하위 집합을 조사하기 위해, 우리는 형광 CD31, CD41a, 또는 CD63에 대한 항체와 MNPS 결합하여 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)에서 전기 자동차를 붙 잡았다. CD31-MNPS에 의하여 촬영 된 전기 자동차는 CD41a-MNPS에 의하여 촬영 된 전기 자동차는 CD31과 CD63에 대한 염색, CD41a 및 CD63에 대한 염색 및 CD63-MNPS에 의하여 촬영 된 전기 자동차는 CD31 및 CD41a (그림 3)에 대한 염색 하였다. ACS 환자에서 검출 항체의 하나 또는 두 개의 양성 CD31-MNPS 의해 캡처 전기차의 양은 3359 [2328이었다; 5472] 전기 자동차는 / 1272 [(714)에 비해 μL; 2157] 전기 자동차 / 건강한 지원자 (P = 0.001) μL. 건강한 지원자와 비교 ACS 환자에서 CD63에 의해 캡쳐 전기차의 총량은 3541 [1318이었다; 5173] 전기 자동차 / ㎕의 대 (806) [488] 2112] 전기 자동차 / μL (P = 0.007). 4752 [3238 있었다; 건강한 지원자의 플라즈마에이 숫자가 유의하게 낮았다 반면 7173] 전기 자동차는 /, CD41a-MNPS에 의해 캡처 ACS 환자의 혈장에서 2623 [1927을 μL; 4188] 전기 자동차 / μL (P = 0.015). 일반적으로, 우리의 결과는 EV 금액은 대부분 ACS 환자에서 증가하는 동안, 증가의 크기가 전기 자동차의 서로 다른 하위 집단에서 달랐다을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig1.jpg" /> 그림 1 : 서로 다른 세포 유형에 복제 HIV-1 비리의 세포 항원의 선택적 결합. PBMC를 나 된 Jurkat 세포에 의해 발표 HIV (HIV-1 LAI.04 또는 HIV-1 SF162) 비리는 VRC01-MNPS 캡처 및 제 항 gp120의 항체 2G12와 HLA-DR과 LFA-1에 대한 특이 항체로 염색 하였다. 염색 제제가 HLA-DR (흰색 막대)과 LFA-1 (검은 BA 대한 분석을 흐르게 하였다RS). 3 ~ 6 실험 (9)의 ± SEM을 의미합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55020/55020fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig2.jpg" /> 그림 2 : DENV의 비리의 성숙 상태입니다. 제조 DENV BHK-21 세포 (A, B) 또는 LoVo 세포 (C, D)에서 2H2 항체 (A, C) 나와 PRM 단백질에 대해 염색 밀도 구배 배지에서 초 원심 분리 한 후, 지질 염료 DII 표지되었고 이소 제어의 IgG2a (B, D)과. 표지 된 비리 온은 3H5-1-MNPS로 촬영 분석 (14)가 흐르도록 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55020/55020fig2large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그림. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig3.jpg" /> 그림 3 : ACS 환자와 건강한 대조군에서 전기 자동차의 분석. 플라즈마 전기 자동차는 CD31-MNPS, CD63-MNPS 또는 CD41a-MNPS 캡처 및 CD31 및 CD41a에 대한 CD41a 및 CD63,에 대하여 각각 CD31 및 CD63, 대한 항체로 염색 하였다. 검출 복근 적어도 하나 물들 캡처 전기차는 시각과 유동 해석에 열거 하였다. 데이터는 중앙값과 사 분위 범위 (IQR)와 도트 플롯으로 제시했다. 녹색 기호 : 건강한 지원자 (컨트롤), 갈색 심볼 : ACS 환자. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55020/55020fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig4.jpg" /> 그림 4 : Evaluati개별 비리를 나타내는 플로우 이벤트의 분획에. (A) HIV-1. 비리의 서스펜션은 두 부분으로 나누어 하나 DID (왼쪽 패널) 또는 DIO (중간 패널)로 염색 하였다. 혼합 한 후, 두 개의 차동 스테인드 비리 함유 현탁액, VRC01-MNPS로 캡처 virometry (오른쪽 패널)을 흐르게 하였다. 집계 (이중 색 이벤트) 전체 사건의 10 % 미만을 구성. (B - D) DENV. 1 : 2 : DII 묻은 비리의 서스펜션은 직렬 1에서 두 배 희석 한 256 및 유동 세포 계수기 (B)에 HTS에 인수했다. DII-DENVs가 2H2 항체 (C) 또는 DII-DENVs으로 표시 하였다는 3H5-1-MNPS (D)로 촬영했다. 1 : 2 : 준비 C와 D는 직렬 1에서 두 배 희석 한 256 및 HTS (14)에 인수했다. 비리가 모든 경우에 이후 집계하지 않는 것희석 인자 및 이벤트의 수 사이의 선형 관계이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55020/55020fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig5.jpg" /> 그림 5 : 사이토의 흐름에 의한 단일 입자의 검출. 1 : 2 : DII 묻은 DENV 서스펜션 직렬 1에서 두 배 희석 2048 및 사이토 흐름 상에 HTS를 사용하여 인수했다. 희석 인자의 함수로서 검출 된 바이러스의 (A) 수. (B) 중간 형광 강도 (MFI) DII의는 DENV (14)을 표시. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55020/55020fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img의 고도 = &quot;그림 6&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 55020 / 55020fig6.jpg&quot;/&gt; 그림 6 : 비리와 특이 항체에 결합 MNPS로 촬영 한 세포 외 소포의 비율의 평가. 레이블이 HIV-1 비리 또는 전기 자동차는 MNPS 특이 항체에 결합 virometry 흐름을 실시로 촬영되었다. 자기 열에 분리 한 후, 흐름을 통해은 (유지되지 않음) 분수 첫 번째 실행에서 누락 된 비리 또는 관심의 전기 자동차의 존재에 대해 분석 하였다. (A) 레이블이 HIV-1 BAL의 비리는 2G12-MNPS (왼쪽 패널)로 촬영했다. 플로우 스루 분획을 수복하고 virometry (오른쪽 패널)을 흐르게 하였다. 첫 번째 사이클에 대한 관심의 비리의 약 95 %가 포착되었다. (B) 레이블이 전기 자동차는 항 CD81 MNPS로 촬영 및 자기 열 (왼쪽 패널)에 격리되었다. 플로우 스루 분획 다시 캡처 (우측 패널)을 분석 하였다. 처음에는관심있는 소포의주기 약 99 %가 8 붙 잡았다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55020/55020fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles at JoVE.com

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

flow-virometry-to-analyze-antigenic-spectra-virions-extracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K 조회수.  Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

비디오: Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration and differentiation, and cytokine production. All of these events are tightly linked to the energy status of the cell, and therefore studying the energy-producing pathways may give clues about the overall functionality of these cells. The extracellular flux analyzer is a commonly used device for evaluating the performance of glycolysis and mitochondrial respiration in many cell types. This system has been used to study immune cells in a few published reports, yet a comprehensive protocol optimized particularly for lymphocytes is lacking. Lymphocytes are fragile cells that survive poorly in ex vivo conditions. Oftentimes lymphocyte subsets are rare, and working with low cell numbers is inevitable. Thus, an experimental strategy that addresses these difficulties is required. Here, we provide a protocol that allows for rapid isolation of viable lymphocytes from lymphoid tissues, and for the analysis of their metabolic states in the extracellular flux analyzer. Furthermore, we provide results of experiments in which the metabolic activities of several lymphocyte subtypes at different cell densities were compared. These observations suggest that our protocol can be used to achieve consistent, well-standardized results even at low cell concentrations, and thus it may have broad applications in future studies focusing on the characterization of metabolic events in immune cells.

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

최적화 된 프로토콜은 림프구에 해당 작용과 미토콘드리아 호흡을 분석하는

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for vaccination as well as understand how pathogenic antibody responses develop in allergies and autoimmune disease. Generating robust antigen-specific antibody responses is not always trivial. In mouse models, it often requires multiple rounds of immunizations with adjuvant that leads to a great deal of variability in the levels of induced antibodies. One example is in mouse models of peanut allergies where more robust and reproducible models that minimize mouse numbers and the use of adjuvant would be beneficial. Presented here is a highly reproducible mouse model of peanut allergy anaphylaxis. This new model relies on two key factors: (1) antigen-specific splenocytes are adoptively transferred from a peanut-sensitized mouse into a na&#239;ve recipient mouse, normalizing the number of antigen-specific memory B- and T-cells across a large number of mice; and (2) recipient mice are subsequently boosted with a strong multivalent immunogen in the form of liposomal nanoparticles displaying the major peanut allergen (Ara h 2). The major advantage of this model is its reproducibility, which ultimately lowers the number of animals used in each study, while minimizing the number of animals receiving multiple injections of adjuvant. The modular assembly of these immunogenic liposomes provides relatively facile adaptability to other allergic or autoimmune models that involve pathogenic antibodies.

Described is the preparation of antigenic liposomal nanoparticles and their use in stimulating B-cell activation in vitro and in vivo. Consistent and robust antibody responses led to the development of a new peanut allergy model. The protocol for generating antigenic liposomes can be extended to different antigens and immunization models.

질병-특정 항 체의 생성에 대 한 항 원 리

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...