아밀로이드 플라크는 알츠하이머 병의 진단에 필요합니다. 그러나 그들은 충분하지 않습니다. 이 사실에도 불구하고, 그들은 부분적으로 그들의 내용을 특성화하는 데 어려움을 겪기 때문에 수수께끼로 남아 있습니다.
우리의 프로토콜은 고순도에서 아밀로이드 피브릴을 분리하는 데 매우 효율적이며 구조 및 구성의 미세한 세부 사항을 이해하는 데 매우 적합합니다. 아밀로이드 플라크의 단백질 함량을 알면 축적을 지연, 간섭 또는 예방할 수있는 치료 개입의 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 질병 발병을 지연시킵니다.
이 방법은 퇴화 된 뇌 조직 및 다른 단백질 경로의 단백질 응집체에서 단백질 침전물을 추출하는 데 매우 적합합니다. 갓 해부되거나 스냅 냉동 된 뇌 조직 영역을 갓 준비된 얼음 냉간 균질화 버퍼에 여섯 ~ 여덟 개의 세라믹 비드가 들어있는 두 밀리리터 튜브에 배치하여 시작하십시오. 그 후 비드 밀 호모게나이저를 이용하여 4, 000 rpm에서 30초 온 및 오프 펄스의 두 사이클로 조직을 분쇄한다.
이제 9 밀리리터의 얼음 차가운 균질화 버퍼를 1 밀리리터의 뇌 조직 균질 물과 15 밀리리터 튜브에 추가하고 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉하십시오. 견고한 가용화를 보장하려면 튜브를 섭씨 네 도에서 밤새 회전시키십시오. 다음날, 고체 수크로스를 조직 추출물 현탁액에 첨가하여 1.2 몰의 최종 농도로 한다.
잘 섞고 원심분리기는 섭씨 4도에서 45분 동안 250, 000 x g를 가졌다. 상청액을 폐기한 후, 펠렛을 섭씨 4도에서 45분 동안 125, 000 x g에서 분쇄하고 원심분리하여 1.9몰 수크로스를 함유하는 균질화 완충액 2밀리리터에 재현탁시킨다. 원심분리 후 상단 백색 고체층을 신선한 튜브로 옮기고 얼음 냉간 세척 완충액 한 밀리리터를 가용화하여 여러 번 위아래로 펫팅합니다.
펠릿은 또한 아밀로이드 피브릴로 풍부하기 때문에, 수성 중간층을 버리고 펠릿을 더 높은 수율을 위해 최상층과 결합시킨다. 합한 분획을 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000 x g에서 원심분리한다. 상청액을 폐기한 후, 펠렛을 얼음 냉 소화 완충액 한 밀리리터에 재현탁시키고, 볼텍스 상에서 세 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다.
샘플을 다시 원심분리하고, 펠렛을 얼음 차가운 트리스 완충액 한 밀리리터에서 두 번 세척한 다음, 다시 원심분리한다. 두 번째 세척 후, 펠렛을 상하로 피펫팅하여 가용화 완충액 한 밀리리터에 재현탁시키고, 섭씨 4도에서 60분 동안 200, 000 x g에서 튜브를 신속하게 원심분리한다. 펠렛을 저장하고, 이어서 상청액에 50 밀리몰 트리스 완충액을 첨가함으로써 수크로오스 농도를 1.3 몰에서 1몰로 감소시킨다.
상청액을 다시 원심분리한 다음, 0.5%SDS를 함유하는 펠릿 및 100 마이크로리터의 트리스 완충액을 모두 용해시킨다. 아밀로이드 정제를 위해, 20 사이클 동안 욕조 초음파 처리 장치에서 초음파를 사용하여 아밀로이드가 풍부한 펠릿을 가용화 한 다음 즉시 섭씨 4도에서 30 분 동안 20, 000 x g에서 물질을 원심분리합니다. 펠렛을 0.5%SDS Tris 완충액의 500 마이크로리터에 재현탁시키고 네 번 더 세척을 반복하고, 최종 원심분리 단계 후, 펠렛을 200 마이크로리터의 초순수로 세척하고 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리 20, 000 x g로 세척하여 남아있는 세제를 제거하였다.
정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 최종 펠렛을 100 마이크로리터의 초순수에 용해시킨다. 정제된 100 마이크로리터의 아밀로이드 피브릴을 400 마이크로리터의 메탄올에 녹이고 잘 와류시킨다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 클로로포름과 와류를 다시 섞으십시오.
다음으로 300 마이크로 리터의 초순수와 와류를 철저히 첨가하십시오. 실온에서 2분 동안 12, 000 x g에서 원심분리한 후, 단백질 플레이크를 함유하는 계면층을 방해하지 않고 상부 수성층을 조심스럽게 제거하고 동일한 부피의 메탄올을 다시 첨가한다. 원심분리를 반복하고, 상층액을 버리고 펠렛을 공기 건조시킨다.
소화를 위해 펠렛을 50 마이크로 리터의 구아니딘 염산염 완충액에 녹이고 얼음 차가운 물 욕조에서 초음파 처리하십시오. 그런 다음 실온에서 45 분에서 한 시간 동안 완전히 와류하고 0.2 % 계면 활성제 용액 50 마이크로 리터를 넣고 다시 60 분 동안 와류하십시오. 다음으로, 500 밀리몰 TCEP의 한 마이크로리터를 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 500 밀리몰의 요오도아세트아미드 2 마이크로리터를 첨가하고 어둠 속에서 20분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 요오도아세트아미드를 5마이크로리터의 TCEP 용액으로 15분 동안 켄칭한다. 다음으로, 필요한 부피의 50 밀리몰 암모늄 중탄산염 용액을 튜브에 첨가하여 구아니딘 농도를 1.5 몰로 줄입니다.
또한 튜브에 1 % 계면 활성제 용액을 첨가하십시오. 그런 다음 트립신을 넣고 튜브를 섭씨 37도에서 밤새 혼합하십시오. 다음날, 소화된 펩티드 용액에 포름산을 첨가하여 pH를 2.0으로 낮춘 다음, 200 마이크로리터의 50%메탄올 용액을 첨가하고, 실온에서 2분 동안 1500 x g에서 방사함으로써 C18 스핀 컬럼을 활성화시킨다.
다음에, 200 마이크로리터의 평형화 완충액을 첨가하고, 2분 동안 다시 방사함으로써 C18 컬럼 수지 베드를 평형화시킨다. 평형화 후, 산성화된 펩티드 용액을 C18 컬럼에 로딩하고, 실온에서 2분 동안 1500 x g에서 원심분리한다. 흐름을 다시 로드하고, 열을 회전하고, 두 번째 흐름을 버립니다.
그런 다음 C18 수지에 결합된 펩티드를 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 40 마이크로리터의 용출 완충액을 첨가하고 컬럼을 원심분리하여 펩티드를 세 번 에루팅한다. 펩티드를 수성 용액을 증발시킴으로써 진공 농축기에서 빠르게 건조시킨다.
건조 펠릿은 MS 분석 전에 몇 주 동안 섭씨 20도에서 저장할 수 있습니다. 정제된 아밀로이드의 콩고 레드 염색은 SDS 가용성 분획과 비교하여 아밀로이드 피브릴의 농축을 문서화한다. SDS 가용성 분획은 아밀로이드의 존재를 나타내지 않았다.
정제된 피브릴의 구조는 거의 순수한 아밀로이드 피브릴의 존재를 확인하였다. 또한, 면역금 표지는 아밀로이드 베타-42 펩티드의 존재를 확인하였다. 항-아밀로이드 베타-42 및 항-피브릴 항체를 사용한 염색은 피브릴에서 아밀로이드 베타-42 펩티드의 상대적 풍부함을 보여주었다.
정제된 아밀로이드 분획은 대략 250개의 단백질의 존재를 보인 반면, 초음파 처리 및 SDS 세척 전에 수집된 분획은 2, 500개 이상의 단백질을 함유하였다. 피브릴 코어는 비막 결합 소기관 및 초분자 복합체와 관련된 단백질의 풍부함을 나타냈다. 아밀로이드는 낮은 풍부 종이며, 아마도 뇌 조직의 밀리그램 당 몇 피코그램에서 몇 마이크로 그램까지입니다.
따라서 레이어, 팔레트를 집어 들거나 상청액을 버리는 동안 매우 조심해야합니다. 이 기술의 개발로 이제 초기 아밀로이드 종자와 관련된 단백질을 더 자신있게 식별하고 구조를 특성화하며 치료 개입을 목표로 삼을 수 있습니다. 따라서이 치명적인 질병의 발병을 예방하십시오.
