장내 박테리아는 곤충 숙주의 여러 생리적 과정에 영향을 줄 수 있습니다. 도끼 유충을 준비하고 유지하는 것은 장내 박테리아 기능을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 식물 조직 배양이 곤충 유래 표면 살균 된 달걀을 먹는 도끼 잎을 먹는 뒤쪽에 세균이없는 잎을 얻기 위해 사용되며,이 방법은 인공 식단에 의해 제한되지 않는다는 것입니다.
이 방법은 편리하며 미래의 장내 박테리아 연구, 특히 잘 발달 된 인공 식단이없는 비 모델 곤충의 경우 축 곤충을 유지하는 가시성을 높입니다. P.versicolora 인구를 섭씨 27도 및 70 % 상대 습도의 성장 챔버에 유지하며 16 시간의 빛과 8 시간의 어두운 광주기로 유지하십시오. 곤충을 기울어 진 젖은 흡수 종이가있는 천공 된 플라스틱 상자에 넣고 신선한 포플러 가지를 먹이십시오.
흡수 종이에 깨끗한 물을 뿌려 수분을 유지하고 이틀마다 가지를 바꿉니다. 번식 후 산란을 위해 성인을 격리하고 더 많은 알을 얻기 위해 부드러운 잎을 먹이십시오. 24 시간 이내에 새로 낳은 알을 모으고 축축한 흡수 종이에 60 시간 동안 올려 놓고 도끼 유충을 준비하십시오.
MS 배지를 밀리리터 당 한 밀리그램의 알파 나프탈렌 아세트산 또는 NAA 원액으로 준비하십시오. 생물 안전 후드에서 50 밀리리터의 NAA 원액을 500 밀리리터의 MS 배지에 넣고 흔들어서 잘 섞으십시오. 그런 다음 조직 배양 용기 당 약 50 밀리리터를 부어 응고를 기다립니다.
생물 안전 후드의 알코올 램프 불꽃에서 메스와 포셉을 살균하십시오. 약 한 달 동안 포플러 묘목에서 정점 새싹이나 측면 새싹이있는 서너 센티미터 줄기 세그먼트를 자르고 용기 당 하나 또는 두 개의 줄기 세그먼트 인 배양 배지에 삽입하십시오. 이들 줄기 세그먼트를 약 30일 동안 성장 챔버에서 인큐베이션한다.
그리고이 세균이없는 잎을 사용하여 축 애벌레에게 먹이를주십시오. 오토클레이브 페트리 요리, 페인트 브러시, 여과지, LB 한천 배지가 들어있는 페트리 접시에 증류수. 페트리 접시에 부착 계란이있는 잎을 놓습니다.
그런 다음 포셉을 사용하여 잎에서 계란을 조심스럽게 제거하고 다른 페트리 접시로 옮깁니다. 이 달걀을 75 % 에탄올로 8 분 동안 씻으십시오. 그런 다음 멸균수로 네 번 세척을 반복하십시오.
부화를 위해 수분을 보존하기 위해 알을 LB 한천 배지로 옮깁니다. 페트리 접시를 성장 챔버에 놓고 24 시간 이내에 알이 부화 할 때까지 기다리십시오. 생물 안전 후드에서 젖은 여과지 세 개를 페트리 접시에 타일링하고 종이에 세균이없는 포플러 잎을 놓습니다.
애벌레를 모아서 나뭇잎에 놓습니다. 페트리 접시를 파라 필름으로 밀봉하고 성장 챔버에서 배양하십시오. 이틀마다 잎을 바꿉니다.
전통적으로 사육 된 그룹의 경우, 잎에서 젖은 여과지가 들어있는 페트리 접시로 알을 옮기고이 유충에게 세균이없는 포플러 잎을 먹이십시오. 무작위로 세 개의 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 인스타 유충을 세균이없고 전통적으로 사육 된 그룹에서 선택하십시오. 스테레오 현미경으로 멸균 된 가위와 포셉으로 세 번째 인스타 유충을 해부하고 마이크로 원심 분리기 튜브에 내장을 수집하십시오.
튜브에서 손상되지 않은 첫 번째와 두 번째 인스타 애벌레를 수집하십시오. 1.5 밀리리터 튜브에 PBS 100 마이크로리터와 강철 볼 3개를 첨가하고, 비드 박동 균질기를 사용하여 조직을 균질액으로 분쇄한다. 100 마이크로리터의 균질액을 LB 한천 배지 및 플레이트에 멸균 유리 확산 막대를 사용하여 첨가한다.
플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 박테리아 식민지를 관찰하십시오. DNA 추출 키트를 사용하여 이전에 수득된 조직의 총 DNA를 추출하고, 분광광도계로 DNA 농도를 측정한다.
PCR을 갖는 유니버셜 16S rRNA 프라이머를 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자를 증폭시키고, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 반응을 설정한다. 추가 분석이 이루어질 때까지 PCR 산물을 섭씨 네 도에 보관하십시오. PCR 산물을 핵산 염료와 혼합하고 1X TAE 완충액의 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 사용하여 분석한다.
10 마이크로리터의 DNA 마커를 참조로 사용하십시오. UV 트랜스 일루미네이터로 젤을 관찰하고 약 1, 500 염기 쌍의 표적 단편을 찾으십시오. 어떤 세균 군에서도 박테리아 콜로니가 관찰되지 않았지만, 그들은 전통적으로 사육 된 모든 그룹에서 관찰되었으며, 이는 조직 배양 포플러 잎을 먹인 멸균 된 알의 유충에 박테리아가 포함되어 있지 않다는 것을 나타냅니다.
1, 500개의 염기쌍 PCR 밴드가 모든 통상적으로 사육된 그룹에서 나타났다. 대조적으로, 세균이없는 그룹이나 음성 대조군에서는 밴드가 관찰되지 않았으며, 이는 도끼 유충에 장내 박테리아가 존재하지 않았 음을 암시합니다. 작은 알을 가진 곤충 종의 경우 소독제의 종류와 살균 기간을 최적화해야했습니다.
또한, 조직 배양 식물의 내피는 주목할 만하다. 이 프로토콜은 세균이없는 곤충을 유지하는 새로운 방법을 제공하며, 이는 곤충 - 장내 박테리아 상호 작용 연구, 특히 잘 발달 된 인공 식단이없는 비 모델 곤충의 경우 편리한 도구입니다.
