이 망막 내피 세포 분리 방법은 혈관 발달의 새로운 메커니즘을 밝히는 고급 시퀀싱 기술을 허용합니다. 설명된 프로토콜은 차세대 시퀀싱 애플리케이션에 필수적인 높은 수준의 생존력과 순도에 최적화되어 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 허쉬 연구소의 대학원생 인 셸비 케인 (Shelby Cain)이 될 것입니다.
해부 가위를 사용하여 눈꺼풀에 수직으로 절개하여 눈 위의 피부와 막을 절단하여 안락사 된 신생아 마우스에서 눈을 제거하기 시작합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 눈 위와 아래를 눌러 눈이 소켓에서 나오도록합니다. 집게로 눈 아래를 조심스럽게 꼬집고 눈을 붙인 시신경을 자릅니다.
그런 다음 수확이 끝날 때까지 새로 준비된 얼음처럼 차가운 PBS의 48 웰 플레이트의 웰에 마우스의 두 눈을 놓습니다. 마우스 망막 조직을 분리하려면 넓은 팁이 있는 전사 파이프 패드를 사용하여 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시에 해부 패드에 눈을 매달아 놓습니다. 해부 현미경으로 작업하면서 하나의 미세한 집게로 시신경을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 각막과 공막이 연결되는 눈의 전방을 통해 구멍을 뚫습니다.
그런 다음 각막 주위의 약 75 %를 원으로 구멍을 뚫습니다. 하나의 집게로 시신경을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 망막 조직에서 공막과 유리체를 부드럽게 찢습니다. 수정체와 히알로이드 신경총 혈관을 제거하려면 거의 닿을 때까지 열린 집게로 망막에 도달 한 다음 집게를 닫아 렌즈와 히알로이드 신경총 혈관을 망막에서 잡아 당깁니다.
모든 혈관이 제거되면 망막을 500 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 PBS 1 개로 채워진 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 넣습니다. 피펫으로 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에서 과도한 PBS를 제거하여 튜브에 약 100 마이크로 리터의 PBS를 남겨 망막 조직을 완전히 덮습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 새로 준비된 소화 용액을 튜브에 첨가하십시오.
P1000 피펫타와 피펫 팁을 사용하여 분해 용액의 망막 조직을 위아래로 5회 피펫팅합니다. 완료되면 소화 혼합물을 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양하고 앞서 설명한 대로 소화 혼합물을 5분마다 위아래로 피펫팅합니다. 배양 후 망막 조직은 단일 세포 현탁액으로 용해되어 소화 혼합물을 흐리게 만듭니다.
다음에, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 375g에서 원심분리하여 펠렛화한다. 원심분리 후, 세척된 세포 펠렛으로부터 PBS를 피펫팅으로 제거한 다음, 펠렛을 100 마이크로리터의 항체 염색 용액에 재현탁시켜 세포를 면역염색한 후 6번째 세포에 10회 당한다. 단일 세포 현탁액을 항체 염색 용액과 함께 10분마다 튜브를 두드리면서 어두운 얼음 위에서 30분 동안 배양하여 세포를 부드럽게 혼합합니다.
형광 활성화 세포 분류를 위해, 섭씨 4도에서 5분 동안 375g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 이전에 기재된 바와 같이 500 마이크로리터의 PBS로 세척하고 펠렛화한다. 이어서 세포를 300 마이크로리터의 형광-활성화 세포 분류 또는 FACS 완충액에 재현탁시킨 후 피펫타와 부드럽게 혼합한다.
다음으로, FACS 버퍼가 포함 된 샘플 튜브에 생존력 마커로 요오드화 프로피듐 또는 PI를 추가하여 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램의 최종 농도를 얻습니다. 피펫을 사용하여 35미크론 필터가 포함된 세포 여과기 스냅 캡을 통해 세포 현탁액을 5밀리리터 시험관으로 옮깁니다. 여과 후 FACS 튜브를 어두운 곳의 얼음 위에 보관한 다음 튜브를 세포 분류기로 옮깁니다.
FACS 기기와 컴퓨터를 켜고 FACS 소프트웨어를 열어 FACS 기기를 실행하고 작동합니다. 일상적인 품질 관리 테스트를 수행합니다. 제어 얼룩 샘플을 FACS 기기에 로드하여 축을 조정합니다.
IgG 항체 전용 세포로 시작하여 전방 산란 및 측면 산란을 생성하고 조정합니다. 이어서 CD31 항체만 생성하고 CD31을 조정한다. 이어서 CD45 항체만을 생성하고 CD45를 조정한다.
대조 샘플의 데이터를 기록합니다. 다음으로, 염색된 샘플 셀을 FACS 기기에 로드하고 샘플을 실행합니다. 전방 산란 또는 FSC 및 측면 산란 또는 SSC 매개 변수를 기반으로 세포를 보행시킵니다.
FSCA 및 FSCH에 의한 보행 세포는 세포 이중선을 식별하고 단일 세포만 수집합니다. 생존 가능한 세포를 확인하기 위해 PI 및 SSCA에 의한 보행 세포. 대조군으로 CD31+CD45 보행 만들기 대조군으로 CD31+CD45-보행을 만들고 CD31 및 CD45로 세포를 보행시킵니다.
기기에 250마이크로리터의 FACS 버퍼가 있는 수집 튜브를 삽입합니다. 다음으로, 설치된 수집 튜브에 CD31+CD45인 세포 분류를 시작합니다. 추가 분석을 위해 수집 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
샘플은 차세대 염기서열분석 어플리케이션을 위해 처리될 수 있습니다. 이 연구에서 소화 시간을 변화시키는 것은 세포 수율과 생존율에 영향을 미쳤습니다. 20분의 소화 시간은 생존할 수 없는 내피 세포의 낮은 비율로 최적의 수율을 가져왔습니다.
후속 프로피듐 요오드화물 염색은 단리된 내피 세포가 단리 후 60분 동안 생존 가능한 상태를 유지했음을 입증했습니다. 세포 집단 순도는 CD31+CD45-집단에서 내피 세포 유전자에 대해 강한 농축을 나타내는 내피 세포 유전자의 발현에 대한 정량적 PCR 또는 qPCRR 분석에 의해 평가되었습니다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 통해 cDNA를 변환 및 증폭하는 분리된 내피 세포로부터 RNA 정제 cDNA 라이브러리는 9개의 독립적인 샘플에서 16, 000개 이상의 유전자를 확인하였다.
백만 읽기 또는 TPM당 전사체의 감소가 이 임계값 미만의 유전자에서 관찰되었습니다. 10x Genomics 파이프 라인을 통해 분리 된 망막 내피 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱은 세포 당 1, 171 개의 유전자, 15, 247 개의 총 유전자가 검출되고 917 개의 세포에서 세포 당 2, 255 개의 고유 분자 식별자 또는 UMI 수의 중앙값을 산출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 망막 조직 분리 및 조직 소화이며, 세포 수율과 생존력을 최적화하기 위해 설명된 대로 정확하게 수행되어야 합니다.
분리된 내피 세포는 전체 전사체 RNA 시퀀싱, 단일 세포 RNA 시퀀싱, 염색질 면역침전 시퀀싱 및 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 분석과 같은 고급 시퀀싱 기술에 사용할 수 있습니다. 이 최적화된 분석법을 차세대 염기서열분석 방법 및 전산적 접근법과 함께 사용하면 혈관 발달을 조절하는 상호 연결된 신호 경로의 메커니즘을 더욱 해명할 수 있습니다.
