Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

상자성 이완 강화 기술은 분자간 거리를 특성화 및 측정하고 일시적 및/또는 인구가 적은 생체 분자 상호작용을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 단백질 응축 이전의 상호 작용을 포착하기 위해 이 기술을 적용했습니다. PRE의 감도는 다른 NMR 기술로는 보이지 않고 접근할 수 없는 동적 상태의 원자 분해능 식별, 검출 및 정량화를 가능하게 합니다.

이 프로토콜의 주요 단계에는 비접합 니트록사이드 스핀 라벨을 제거하고 스펙트럼을 주의 깊게 분석하여 피크 높이를 정확하게 측정하는 것이 포함됩니다. 또한 NMR 실험 설정 및 펄스 보정 중에 주의해야 합니다. 먼저, 관심 있는 15N 동위원소 표지 단백질의 20배 몰 초과량으로 원액에서 3-maleimido-PROXYL을 추가합니다.

실온 또는 섭씨 4도에서 빛과 산소로부터 보호하고 부드럽게 흔들거나 너트로 밤새 배양하십시오. 다음날, 단백질 샘플의 광범위한 투석 또는 겔 여과를 사용하여 비특이적 용매 PRE를 방지하기 위해 반응하지 않은 자유 스핀 표지를 제거합니다. 그런 다음 Ellman의 시약을 사용하여 용액의 유리 설프하이드릴기를 정량화합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하고 표준 곡선을 구성합니다. 분자내 PRE를 측정하기 위해, NMR에 적합한 완충액에서 15N 동위원소 농축 스핀 표지 단백질을 최소 100마이크로몰 이상 300마이크로몰 이하의 농도로 준비한다. 그런 다음 긴 줄기 유리 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하여 NMR 샘플을 하이 필드 자석에 사용하기에 적합한 5mm NMR 튜브로 옮깁니다.

샘플을 자석에 넣습니다. lock 명령을 사용하여 중수소 신호를 잠그고 시설 프로토콜에 따라 양성자 채널을 조정하고 일치시킵니다. 그런 다음 상단 shim 서브루틴을 사용하여 심을 조정하여 용매 신호 억제를 최적화합니다.

다음으로, P-OPT 프로그램을 사용하여 양성자 펄스를 보정한다. 그런 다음 표준 샘플에 대해 15N 펄스를 보정합니다. shape tool 서브루틴을 사용하여 형태화된 펄스에 대한 올바른 감쇠를 판별하십시오.

그런 다음 폴더 아이콘을 클릭하여 적절한 펄스 모양 파일을 엽니다. 형성된 펄스는 수집 파라미터의 펄스 파라미터 섹션에서 찾을 수 있습니다. 펄스 정의 파일을 로드한 후 파형 분석(Analyze Waveform)을 클릭한 다음 형상 통합(Integrate Shape)을 클릭합니다.

보정된 양성자 90도 하드 펄스, 원하는 모양 펄스 길이 및 회전을 입력합니다. 그런 다음 보정된 90도 펄스에 대한 감쇠에 전력 레벨 변화를 추가하여 성형된 펄스의 전력 레벨을 계산합니다. 표준 양성자 15N HSQC를 기록하여 스윕 폭, 캐리어 주파수를 최적화하고 물 억제를 확인합니다.

마지막으로 SW 및 TD 명령을 사용하거나 해당 대화상자에서 직접 스윕 폭과 간접 치수 증분 수를 조정합니다. 앞에서 설명한 대로 모양이 지정된 펄스를 보정합니다. 그런 다음 Acquisition Parameters 탭의 pulse parameters 섹션에 교정된 펄스 길이를 입력합니다.

2시간 지연 지점 접근법을 사용하여 아미드 양성자 T2를 측정하려면 VD 목록 파일을 편집하여 시간 지연을 설정합니다. 첫 번째 지연은 0.01밀리초로 설정됩니다. 예상 최대 PRE와의 관계를 사용하여 두 번째 지연을 선택합니다.

그런 다음 첫 번째 및 두 번째 지연 스펙트럼의 첫 번째 증분을 비교하고 신호가 초기 값의 40-50% 사이로 감쇠하도록 두 번째 지연을 조정하여 적절한 값을 결정합니다. 충분한 신호 평균화를 위해 기록할 복소점의 개수와 스캔 횟수를 결정합니다. 그런 다음 EXPT 명령을 사용하여 실험 시간을 계산하고 ZG 명령으로 실험을 시작합니다. 아스코르브산나트륨을 NMR 완충액에 용해시킨 후 pH를 원래 NMR 완충액과 일치하도록 조정합니다.

그런 다음 아스코르브산을 스핀 라벨의 농도에 비해 10배 몰 초과로 NMR 튜브에 첨가하여 튜브의 가장자리 아래에 물방울을 놓습니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 조심스럽게 뒤집어 섞습니다. 손으로 크랭크 된 원심 분리기에서 10-20 초 동안 200-400G에서 회전시켜 튜브 바닥에 샘플을 침전시킵니다.

튜브를 호일로 감싼 후 최소 3시간 동안 반응을 진행하십시오. 그런 다음 상자성 샘플에 사용된 것과 동일한 매개변수를 사용하여 반자성 샘플에 아미드 양성자 T2를 기록합니다. 분자내 아미드 양성자 감마 PRE는 RNA 결합 단백질 EWSR1의 낮은 복잡성 도메인에서 유래된 자가 회합 본질적으로 무질서한 단편에 기록되었습니다.

스핀 라벨 부착 지점에 근접한 순차적 근접의 잔류물은 상당히 넓어질 것으로 예상되며, 스펙트럼에서 검출가능하지 않다. 부착 지점으로부터 순차적으로 이격되었지만 향상된 감마를 보인 잔류물은 스핀 라벨에 공간적으로 가까웠다. 본질적으로 무질서한 단백질의 경우 퓌레를 기록하고 분석하면 분자 내 접촉 및 일시적인 상호 작용 표면에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.

PRE 측정을 동적 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피, 분석 초원심분리 및 계산 방법과 같은 다른 생물물리학적 방법과 결합하면 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다. PRE 측정은 인구 밀도가 낮은 일시적인 상태를 특성화하는 데 도움이 됩니다. 이 접근법은 분자 인식, 알로스테릭 구조적 선택, 상 분리를 통한 막이 없는 세포 소기관 조립을 포함한 조립 과정과 같은 무수한 생물학적 과정에 중요한 상호 작용을 특성화하기 위해 확장될 수 있습니다.