이 프로토콜은 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 전체 장기 규모의 구조 병리학 적 질병에 대한 마이크로 구조적 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 구조 질환의 선택적 대비 향상과 함께 인간의 번역 대형 포유류 모델에서 전심 샘플의 고해상도 이미징을 최적화하기 위해 특수 조직 준비 방법이 구현됩니다. 섬유증의 분포와 흥분성 심근의 조직과 같은 심장 미세 구조는 광범위한 심장 질환의 기초가되며 생명을 위협하는 부정맥의 현장을 설정합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 닥터 및 박사 과정 졸업생 인 Nestor Pallares-Lupon이 될 것입니다. 시작하려면 헤파린 나트륨을 함유 한 심막 용액을 준비하고 용액을 섭씨 네 도에 보관하십시오. 다음으로, 먼저 EDTA를 증류수 1리터에 첨가하여 PBS/EDTA를 10밀리몰 최종 농도로 준비한다.
그 후 EDTA를 용해시키기 위해 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 12로 증가시키고 유지한다. EDTA가 완전히 용해되면 염산을 사용하여 pH를 7.4로 낮춥니다. 그 후 PBS의 호일 파우치 1개를 첨가하여 pH 7.4의 0.01 몰 용액을 얻었다.
준비된 용액을 실온에서 보관하십시오. 마지막으로, 1 리터의 절대 에탄올에 10 그램의 PMA를 첨가하여 1 % 에탄올 PMA 조영제 용액을 준비하십시오. 준비된 용액을 실온에서 보관하십시오.
해부 접시 위에 80cm지지되는 한 리터 저수지를 준비하고 열가소성 튜브를 저수지의 배수 포트에 결합하십시오. 배수 튜브에 세 방향 탭을 고정하고 추가 열가소성 튜브를 세 방향 탭의 각 자유 포트에 결합합니다. 튜브의 자유 끝으로 양방향 탭을 고정합니다.
다음으로, 헤파린으로 보충 된 심막 용액으로 저수지를 채 웁니다. 수도꼭지를 열어 심흉막 용액이 배출되어 모든 기포를 제거 할 수 있도록하십시오. 그런 다음 양방향 탭을 닫습니다.
안락사 된 동물로부터 심장을 추출 한 후, 해부 준비가 될 때까지 얼음에 저장된 차가운 심흉막 용액에 넣으십시오. 그런 다음 PTFE 튜브를 다섯 센티미터 절단하고 알몸 화염 옆에 팁을 배치하여 한쪽 끝을 가열하여 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥 골에 대한 캐뉼라를 준비하십시오. 팁의 한 밀리미터가 녹기 시작하고 반투명 해지면 팁을 단단한 내열성 표면에 대고 눌러 캐뉼라가 용기 밖으로 미끄러지지 않도록 캐뉼라 팁에서 능선을 형성 한 다음 각 캐뉼라의 가열되지 않은 끝의 한 센티미터를 드레인 저장소 배수 튜브의 두 끝으로 삽입하십시오.
다음으로, 대동맥 캐뉼러를 제거하고 차가운 심흉막 용액 아래에서 관상 동맥의 왼쪽 및 오른쪽 골을 국소화하십시오. 뾰족한 가위를 사용하여 관상 동맥 골 위와 아래의 주변 조직에서 대동맥 뿌리를 조심스럽게 분리하여 관상 동맥 혈관 아래에 제로 게이지 실크 봉합사를 나사로 꿰매십시오. 그런 다음 양방향 탭을 열고 캐뉼라 팁을 관상 동맥 골에 삽입하십시오.
캐뉼라 팁이 골로 하나 ~ 두 센티미터 확장되고 봉합사 배치를 넘어 캐뉼라를 묶습니다. 다음으로, 심장이 혈액이 제거 될 때까지 15 분 동안 심실을 부드럽게 마사지하면서 심장을 헹구십시오. 헹굼 후 양방향 탭을 닫고 세 방향 탭에서 분리한 다음 심장을 PBS / EDTA 용액 500 밀리리터가 들어있는 한 리터의 플라스틱 내화학성 용기로 옮깁니다.
두 개의 채널이 있는 연동 펌프를 사용하여 흄 후드 아래의 열가소성 튜브의 PBS/EDTA 용액을 재순환시킵니다. 튜브에 기포가 없을 때까지 펌프 튜빙을 프라임합니다. 그런 다음 분당 80 밀리리터로 두 시간 동안 실온에서 재순환하여 각 관상 동맥 캐뉼라를 정독하십시오.
흄 후드가 작동하는지 확인한 후 펌프를 멈추고 용기에서 용액을 배출 한 다음 분당 80 밀리리터로 1 시간 동안 고정하기 위해 10 % 포르말린으로 교체하십시오. 최소 세 시간 동안 20 % 에탄올로 시작하여 일련의 증가 에탄올 농도를 사용하여 심장을 정독하십시오. 그런 다음 20 % 에탄올을 30 % 에탄올로 교체하고 2 시간 동안 퍼퓨즈하십시오.
각 농도에서 한 시간의 최소 관류로 각 반복에서 에탄올 농도를 증가시켜 관류를 계속한다. 공기 건조 전에 심장 조직을 강화하려면 에탄올과 HMDS를 10분 동안 균등하게 혼합한 후 추가로 두 시간 동안 100%HMDS를 재순환시킨다. 관류 펌프를 멈춘 다음 튜브에서 캐뉼라를 분리하고 흄 후드 내부의 대동맥 봉합사에서 심장을 일시 중단하십시오.
지퍼 잠금 가방을 심장 위로 조심스럽게 밀고 봉합사 위에 가방 씰을 닫아 심장이 순환하는 공기에 노출되는 것을 줄입니다. 일주일 동안 증발을 통해 심장이 건조하도록하십시오. 확산 적재 조영제를 사용하려면 가방을 제거하십시오.
진공 상태에서 48 시간 동안 1 % PMA가 보충 된 100 % 에탄올에 담그기 전에 교반으로 100 % 에탄올로 15 분 동안 심장을 씻은 다음 앞에서 설명한 것처럼 지퍼 잠금 백으로 심장을 덮고 건조시킵니다. 공기 건조된 심장을 적절한 샘플 홀더에 장착합니다. x-ray 마이크로 CT 측정 중 움직임을 방지하려면 샘플 홀더에 고정된 클램프를 사용하고 건조하고 단단한 대동맥을 통해 심장을 고정하십시오.
샘플 홀더를 마이크로 CT 스캐너에 장착합니다. 그런 다음 소프트웨어를 열고 x-ray 마이크로 CT 시스템을 시작하십시오. 그런 다음 X 선 필터 알루미늄을 한 밀리미터로 설정하십시오.
X선 소스 전압은 60킬로볼트, 전류는 120마이크로암페어입니다. 또한 이미지 크기를 2, 016 x 1, 344 픽셀로 설정하고 픽셀 크기를 20 마이크로 미터로 설정합니다. 지지대의 길이를 따라 스카우트 엑스레이 전송 영상을 전송하여 심장의 종방향 접근에서 전체 영상 필드를 결정한다.
스캔의 경우 360도 획득을 위한 옵션을 선택 해제하여 0.18도의 회전 단계, 평균 다섯 개의 프레임 및 180도의 샘플 회전을 사용합니다. 오프셋 스캔 모드를 선택하여 샘플 지원의 전체 너비를 이미지화합니다. 스캔 후, 등방성 입체 이미지 볼륨의 단층 촬영 재구성을 위해 소프트웨어를 사용합니다.
결국 정찰 소프트웨어에서는 10 %의 빔 경화 효과와 여덟 개의 링 아티팩트 감소를 포함한 획득 관련 아티팩트 보정을 사용하십시오. 그런 다음 Data Viewer 소프트웨어를 사용하여 재구성된 데이터 스택을 시각화합니다. 이미지 경계 내에서 샘플을 디지털 방향으로 조정하여 샘플을 긴 축과 짧은 축을 이미지 볼륨의 세 가지 원리로 다시 정렬합니다.
마지막으로 세 축 모두에서 이미지 볼륨을 잘라내어 이미지의 외부 배경 레이어를 제거하고 전체 이미지 크기를 최대한 줄입니다. 공기 건조 돼지 심장의 X 선 투과 영상은 심실 충치와 근육 벽을 포함한 주요 해부학 적 랜드 마크를 보여줍니다. 삼차원 이미지 볼륨의 단층 구조 재구성은 심외막 및 심내막 경계에서 조직과 배경 사이의 뚜렷한 분리를 보였다.
메이슨의 삼색 염색은 서브 심막 조직에서 상피 및 내피층에서 파라혈관적으로 콜라겐 양성 염색을 나타냈다. 밝은 장 조명은 PMA 염색 후 콜라겐 구조에서 더 어두운 착색을 보여 PMA의 우선적 인 축적을 지원했습니다. 심실 조직 절편의 PMA 염색된 형광 이미지는 PMA가 콜라겐 부위에서 형광의 손실을 유도하였다.
공기 건조 전에 관류를 통해 조영제로 염색된 심장 샘플이 있는 경우, 이미지 재구성은 심근 구획 내에서 매우 패치가 많은 염색을 나타냈다. 더욱이, 낮은 콘트라스트 조직은 배경 강도로부터 불량한 분리를 보였다. 만성 심근 경색으로 고통받는 양 부분의 마이크로 CT 이미징은 느슨하고 이질적인 경계 구역으로 둘러싸인 중앙 조밀 한 섬유성 병변을 밝혀 냈습니다.
조직 경계와 흉터 영역에서 재구성된 이미지 볼륨의 가장 큰 신호 강도가 여기에 표시됩니다. 조영제는 건강한 심근을 제대로 염색하지 못했지만 미세한 구조적 대비는 유지되었습니다. 국경 지대에서, 흉터 조직은 살아남은 심근으로 산재했다.
조밀한 섬유증은 경막이지만 질감이 나타나 조성의 차이를 나타낸다. PMA 염색된 조직 제제의 경막 좌심실 영역은 콜라겐에 대한 선택적 염색을 나타내었고 생존한 심근의 영역에서는 염색이 없었다. 심장의 수분 함량을 에탄올과 완전히 교환하기 위해 에탄올을 사용하는 더 긴 관류 시간을 권장합니다.
HMDS와 물 사이의 상호 작용은 열을 발생시켜 샘플을 손상시킬 수 있습니다. 이 절차의 강력한 장점은 조직학을 사용하여 마이크로 CT 이미징을 검증 할 수 있다는 것입니다. 공기 건조된 샘플은 절편화 염색 및 마이크로스코핑 이미징을 위해 파라핀에 직접 포매될 수 있다.
