이 프로토콜은 세포 편광, 분화 및 마이그레이션을 위한 기계적 게이지로 만드는 세포 핵의 개별 기계적 특성을 해부합니다. 이 기술의 주요 장점은 기계적 특성을 측정하고 멤브레인 또는 피질 순환 골격의 외부 교란없이 세포 전구에 힘을 적용할 수 있다는 것입니다. 프로토콜은 다른 세포주 또는 동물 모델에서 핵 역학을 연구하기 위해 다른 유기체의 다른 세포 내부의 구슬을 조작하기 위해 쉽게 적응할 수 있다.
직접 힘 센서의 정렬은 광학 트랩을 생성하고 떠나는 모든 빛을 포착하는 데 중요합니다. 이렇게 하면 셀의 점탄성 배지에서 정확한 광 운동량 측정을 보장합니다. 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 E3 매체를 함유한 유리 접시에 구 단계 배아를 4시간 후 수정하여 단일 세포 준비를 시작합니다.
그런 다음 구슬에 양성배들을 선택하고 mRNA 주입시 형광 단백질을 발현한다. 집게를 사용하여 배아를 수동으로 데큐게하고 유리 파스퇴 르 피펫의 도움으로 약 10 에서 15 개의 감산 배아를 1.5 밀리리터 반응 용기로 옮기. 튜브에서 E3 미디어를 제거하고 사전 온난화 된 이산화탄소 독립적 인 조직 배양 배지의 500 마이크로 리터를 추가합니다.
거품 형성을 피하는 튜브를 부드럽게 흔들고 세포가 눈에 보이는 큰 덩어리없이 해리됨에 따라 튜브의 내용이 탁상되도록합니다. 그런 다음 튜브를 200배 G로 3분간 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거하고 펠릿을 수집하여 세포 염색을 진행한다.
핵을 표지하려면 새로 준비된 DNA Hoechst 염색 용액의 500 마이크로리터를 튜브에 추가하여 세포를 다시 중단합니다. 얼룩진 세포를 어둠 속에서 7분간 배양합니다. 다음으로, 앞에서 설명한 바와 같이 세포를 원심분리하고 현탁액시 시료에 대한 DMEM의 50 마이크로리터 또는 감금된 세포를 위한 DMEM의 20 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다.
서스펜션에서 세포를 실험하기 위한 광학 트랩 또는 OT 챔버의 제조를 위해, 중앙에 약 10밀리미터 x 10밀리미터 평방 홀로 양면 스카치 테이프 조각을 잘라냅니다. 테이프의 보호 층 중 하나를 벗겨 번호 1.5 H 유리 바닥 접시의 중앙에 테이프의 발견 된 측면을 배치합니다. 테이프를 부드럽게 눌러 테이프의 모든 표면이 유리에 부착되고 기포를 피하고 테이프의 나머지 보호 층을 벗겨냅니다.
30 분 동안 밀리리터 당 0.5 밀리그램에서 Concanavalin A의 100 마이크로 리터로 표면을 배양하십시오. 그런 다음 Concanavalin A의 방울을 제거하고 DMEM으로 표면을 헹군다. 세포를 포함하는 용액의 마이크로리터 30대를 캐비티 표면에 추가합니다.
그런 다음 22 by 22 mm 커버 유리로 챔버를 매우 부드럽게 닫습니다. 필요한 경우 메스 나 집게를 사용합니다. 다음으로, 실험 전에 최소 30분 동안 레이저를 상당히 높은 전력으로 켜서 광학 핀셋 스타트업을 시작하여 출력 전력 안정성을 최적화합니다.
완료되면 광학 마이크로 조작 및 힘 측정 장치의 전자 모듈을 켭니다. 광학 력 센서를 정렬하기 전에 60X 1.2 수분 침수 목표에 물방울을 넣고 세포가 함유된 챔버를 무대에 놓습니다. 셀 샘플이 배치될 챔버의 하부 표면에 초점을 맞춥니다.
시료를 덮는 커버 글래스 슬라이드 위에 침지 오일의 액적을 추가 한 후, 오일 액적에 닿을 때까지 힘 센서 장치의 수집 렌즈를 낮춥춥다. 광학 력 센서 정렬에 대한 표준 절차에 따라, OT를 배치하는 데 사용되는 보조 카메라의 샘플 평면 이미지를 본 다음 현장 정지가 샘플 평면에 공표 될 때까지 광학 힘 센서를 낮춥니다. 버트 랜드 렌즈로 기포를 확인하려면 보조 카메라를 통해 이미징 경로를 관찰하십시오.
먼지나 기포가 보이면 설명된 대로 시술을 반복하기 전에 먼지가 없는 렌즈 조직으로 렌즈와 챔버를 청소하여 더 많은 침지 오일을 추가합니다. 광학 력 센서의 홀더에 배치된 측면 나사를 사용하여 필드 스톱을 시야로 중앙에 배치합니다. 정확도를 위해 보조 카메라에 보이는 시야를 차지하기 위해 필드 정지를 거의 엽니다.
현미경에 샘플을 배치하고 광학 힘 센서를 정렬 한 후, 핵 또는 세포 간 구조의 강성이 알려지지 않은 경우 초기 트랩 전력을 200 밀리와트로 설정하기 위해 회전 반파 판을 사용합니다. 일단 완료되면, 현미경 단계 소프트웨어 컨트롤러를 사용하여 전송 된 브라이트 필드 현미경 검사를 통해 하나 또는 두 개의 구슬이있는 세포를 찾습니다. 숫자 시트에 각 후속 궤적 단계의 변위와 시간을 적는다.
또는 보조 재료로부터 테이블 S1을 로드합니다. 스트레스/이완 실험을 위해 사다리꼴 하중을 적용하도록 프로그래밍합니다. OT 소프트웨어에서 광학 트랩을 활성화합니다.
마이크로스피어를 트래핑하려면 현미경 스테이지 소프트웨어 컨트롤러로 이미지 평면을 비드 위에 약간 설정합니다. 보정된 보조 카메라 이미징 창에서 폴리스티렌 마이크로비드를 클릭합니다. 광학 트랩에 의한 비드의 성공적인 감금은 비드의 움직임을 강력하게 감소시다.
비드를 클릭하고 세포질을 가로질러 드래그하여 핵 봉투에서 약 2미크론의 거리에 놓습니다. 구드 들여쓰기가 핵멤브레인에 수직이 되도록 궤도가 설정되어 있는지 확인합니다. 설정이 준비되면 이미징 소프트웨어로 이동하여 수집 버튼을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다.
실시간 힘 읽기 창을 열고 데이터를 클릭하고 저장하려면 실시간 힘 읽기 창에 저장합니다. 트랩 위치 및 강제 측정 데이터를 시작합니다. 구드를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 시작 궤적을 선택하여 이전에 로드된 궤적을 시작합니다.
궤적이 완성되고 시스템이 안정될 때까지 기다렸다가 트랩 력 측정 데이터의 기록을 완료합니다. 이미지 수집을 중지하고 후처리 소프트웨어에서 결과를 플롯합니다. 대표적인 분석에서, 핵에 가까운 단일 마이크로피어를 가진 단단제피 전구 줄기세포가 전시된다.
태아 내부의 5시간 후 주입 후 폴리스티렌 마이크로스피어의 분포를 모니터링했다. 브라이트필드와 형광 이미지는 구슬이 배아 조직 전체에 분산되어 있음을 보여줍니다. 공초점 형광 Z 스택의 최대 투영 및 동일한 영역에서 서브 스택의 최대 투영은 깊은 세포의 큰 분수가 1 ~ 2 개의 구슬을 포함한다는 것을 확인합니다.
수정 후 24시간, 비드는 배아의 전신에 분포되었다. 하나 또는 두 개의 주입 된 비드와 제한된 세포에 서스펜션 세포의 브라이트 필드 현미경 그래프를 얻어졌다. 더욱이, 다중 형광 라벨은 핵막, 혈장막, DNA 및 형질대사와 같은 세포의 상이한 양상에 대한 조사를 용이하게 하였다.
대표적인 스냅샷은 관상에 갇힌 마이크로스피어를 들여쓰기 5초 전/도중 5초 전에 Hoechst 표지된 핵을 기술했습니다. 일시 중단 및 제한된 세포의 들여쓰기 실험 동안 핵의 해실 및 근근 경계의 세 가지 상이한 프레임 및 궤적을 위한 들여쓰기 세그먼트를 따라 강도 프로파일을 연구하였다. 반복핵 들여쓰기 실험 중에 광학적으로 갇힌 마이크로피어에 의해 경험된 갇힌 궤적과 힘을 측정하였다.
현탁액 및 감금 하에 있는 세포의 핵 역학은 감금이 예상 된 영역의 확장과 핵 강성의 사소한 변화를 초래했다는 것을 확인했습니다. 구슬이 1세포 단계 배아에 주입되는 경우, 그들은 대부분 나중에 균등하게 분배할 것입니다. 비드는 안정적으로 갇혀 있어야 한다는 것을 기억하십시오.
비드가 광학 트랩을 탈출하면 궤적을 재정의하거나 레이저 전력을 증가시면 됩니다. 이러한 실험은 한 세포 내부의 여러 마이크로비드에서 쉽게 수행되고 활성 미세 화학 측정으로 확장 될 수 있습니다.
