이러한 절차의 전반적인 목표는 재현성을 높이기 위해 최적의 방법으로 바이오필름을 수확하고 분해하는 것입니다. 이 비디오에서는 세 가지 기술이 시연되며, 각 기술은 서로 다른 표면 유형에서 수확 및 분해에 중점을 둡니다. 이 비디오는 CDC 생물막 반응기로부터의 폴리카보네이트 쿠폰과 같은 경질 비다공성 표면으로부터 바이오필름을 볼텍싱 및 초음파 처리하기 위한 적절한 기술을 시연할 것이다.
두 가지는, 생물막의 긁기 및 균질화는 점적 유동 반응기에서 흔히 발견되는 경질 비다공성 보로실리케이트 유리 표면으로부터 떨어져 나간다. 및 세 번째로, 카테터 모델에서 흔히 발견되는 다공성 실리콘 튜빙 표면으로부터 생물막의 스크래핑, 볼텍싱 및 초음파 처리이다. 안녕하세요, 제 이름은 Kelly Buckingham-Meyer입니다 여기 표준화 된 Biofilm Methods Lab에서.
우리 실험실에서는 생물막 방법을 성장, 치료, 샘플링 및 분석의 네 가지 구성 요소로 나눕니다. 동료 검토 문헌에서, 생물막이 어떻게 샘플링되거나 수확되고 표면으로부터 분해되는지에 대한 세부 사항은 전형적으로 드물다. 이것이 이 비디오의 이유입니다.
우리 실험실은 표준화 된 생물막 방법을 개발하고 테스트하기 때문에 세 가지 가장 일반적인 생물막 수확 및 분해 방법이 확인 된 광범위한 문헌 검토를 수행했습니다. 이러한 방법은 폴리카보네이트 쿠폰으로부터 생물막을 볼텍싱 및 초음파 처리하고, 붕규산염 유리 쿠폰으로부터 생물막을 긁어 내고 균질화하며, 실리콘 튜빙으로부터 생물막을 긁어내고, 볼텍싱하고, 초음파 처리하는 것이다. 종이에 쓰여진 방법은 강력하지만 동료 린지 밀러 (Lindsey Miller)와 내가 제시 한 기술적 세부 사항이 담긴 비디오가 도움이되기를 바랍니다.
시작하기 위해, 성숙한 슈도모나스 aeruginosa 15442 생물막을 ASTM 표준 E2562, CDC 생물막 반응기를 사용하여 높은 전단 및 연속 흐름으로 성장시킨 슈도모나스 aeruginosa 생물막의 정량화를 위한 표준 시험 방법에 따라 성장시킨다. 48 시간의 성장 기간이 끝나면 단일 튜브 방법을 사용하여 CDC 생물막 반응기에서 성장한 생물막에 대한 소독제 효능을 결정하기위한 표준 시험 방법 인 ASTM 표준 E2871에 따라 쿠폰을 치료하고 샘플링 할 준비를하십시오. 그런 다음 화염 멸균 포셉을 사용하여 오토클레이브 된 스플래시 가드를 멸균 된 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 무균으로 삽입하십시오.
치료를받을 모든 튜브에 대해 반복하십시오. 제어 쿠폰 용 튜브에는 스플래시 가드가 필요하지 않습니다. CDC 생물막 반응기에서 막대를 무균적으로 제거하고 30 밀리리터의 멸균 희석수로 헹구십시오.
이것은 생물막으로부터 느슨하게 부착된 세포를 제거할 것이다. 스플래시 가드를 사용하여 벤치 상단과 평행하게 막대를 샘플 튜브 위로 잡으십시오. 화염 살균 Allen 렌치를 사용하여 세트 나사를 풀어 바이오필름 코팅 쿠폰을 튜브에 떨어뜨립니다.
원하는 쿠폰 수에 대해 반복하십시오. 스플래시 가드를 제거하고 스플래시 가드를 별도의 용기에 넣어 살균하십시오. 다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 네 밀리리터의 처리 또는 제어를 튜브에 천천히 피펫하여 액체가 튜브 벽 내부로 흐르도록합니다.
튜브 바닥을 부드럽게 소용돌이 치며 쿠폰 아래의 기포가 옮겨집니다. 각 추가 사이에 30-60초 동안 기다립니다. 지정된 접촉 시간이 끝날 때, 36 밀리리터의 중화제를 처리 또는 제어가 적용된 것과 동일한 순서로 튜브에 피펫합니다.
각 튜브를 30 플러스 또는 마이너스 다섯 초 동안 가장 높은 설정에서 소용돌이치고 완전한 소용돌이가 달성되도록하십시오. 욕조의 수위가 튜브의 수위와 같도록 탈기 된 초음파 처리기에 매달려있는 튜브 랙에 튜브를 놓습니다. 샘플을 45킬로헤르츠, 100% 전력 및 정상 함수에서 30 플러스 또는 마이너스 5초 동안 초음파 처리하십시오.
소용돌이 및 초음파 처리 사이클을 반복하고 총 다섯 사이클 동안 최종 소용돌이로 끝납니다. 마지막으로, 샘플을 연속적으로 희석하고, 희석된 R2A 한천 상에 플레이트하고, 플레이트를 섭씨 36도에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 도금 방법에 따라 콜로니를 계산하고 데이터를 기록하십시오.
이 다음 생물막 수확 및 분해 기술은 점적 유동 반응기에서 표준이 되는 경질 비다공성 쿠폰에 유용하다. 성숙한 슈도모나스 aeruginosa 15442 생물막을 낮은 전단 및 연속 유동을 갖는 드립 플로우 바이오필름 반응기를 사용하여 성장시킨 슈도모나스 aeruginosa 생물막의 정량화를 위한 표준 시험 방법 ASTM 표준 E2647에 따라 성장시킨다. 샘플링 보드, 비이커의 95 % 에탄올, 알코올 버너, 지혈제, 쿠폰 제거 도구, 멸균 희석수가 함유 된 비커 및 쿠폰을 헹구기위한 희석 튜브를 포함하도록 샘플링 스테이션을 설정하십시오.
펌프를 끄고 채널 커버를 제거하고 멸균 쿠폰 제거 도구 및 지혈제를 사용하여 쿠폰을 제거하고 생물막을 방해하지 않도록주의하십시오. 50 밀리리터 원심분리 튜브에 들어있는 45 밀리리터의 멸균 희석수에 유체 운동으로 부드럽게 담가 쿠폰을 헹구십시오. 쿠폰을 제거하기 위해 즉시 움직임을 반전시킵니다.
쿠폰을 멸균 희석수 45 밀리리터가 들어있는 비커에 넣으십시오. 생물막으로 덮인 쿠폰 표면을 멸균 주걱 또는 스크레이퍼를 사용하여 약 15초 동안 아래쪽 방향으로 긁어냅니다. 주걱이나 스크레이퍼를 비이커에서 저어서 헹구십시오.
긁어 모으고 헹굼하는 과정을 서너 번 반복하여 쿠폰 표면을 완전히 덮을 수 있습니다. 쿠폰을 멸균 비커 위에 60도 각도로 잡고 쿠폰 표면에 멸균 희석수 한 밀리리터를 피펫팅하여 쿠폰을 헹구십시오. 총 다섯 번의 헹굼을 반복하십시오.
비커의 최종 부피는 이제 50 밀리리터입니다. 생물 안전 캐비닛에서 작업하면서 스크랩 된 생물막 샘플을 균질화하십시오. 멸균 호모게나이저 프로브를 호모게나이저에 부착한다.
프로브 팁을 액체에 놓고 균질기를 켜고 20, 500 RPM까지 램프하십시오. 샘플을 30초 동안 균질화한다. RPM을 끄고 균질기를 끕니다.
상기 기재된 바와 같이 30초 동안 20, 500 RPM에서 9밀리리터 멸균 희석 블랭크에서 균질화함으로써 생물막 샘플 사이의 프로브를 살균한다. 70% 에탄올로 된 9밀리리터 튜브를 30초 동안 균질화하고 프로브를 분리하고 에탄올 튜브에 1분 동안 방치한다. 두 개의 추가 희석 블랭크를 균질화한다.
또한, 멸균 일회용 호모게나이저 프로브가 각 샘플에 대해 사용될 수 있다. 균질화된 샘플을 연속적으로 희석하고, 희석물을 적절한 도금 방법을 사용하여 R2A 상에 플레이트하고, 플레이트를 섭씨 36도에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 콜로니를 계산하고 데이터를 기록하십시오.
이러한 최종 생물막 수확 및 분해 기술은 카테터 모델에 사용되는 실리콘 튜빙과 같은 다공성 튜브에서 성장한 생물막에 유용하다. 이 절차를 시작하기 위해, 실리콘 카테터 튜빙에서 성숙한 E.coli 53498 생물막을 성장시킨다. 샘플링 재료를 준비하십시오 : 헹굼 된 튜브, 멸균 원심 분리 튜브, 빈 멸균 페트리 접시, 화염 살균 스테인레스 스틸 지혈제, 가위, 타이머 및 눈금자.
펌프를 일시 중지 한 상태에서 70 % 에탄올을 사용하여 튜브 외부를 청소하십시오. 끝에서 두 센티미터를 측정하여 커넥터에 부착된 영역을 피하고 튜브를 표시하여 절단 위치를 결정합니다. 화염 살균 가위로 두 센티미터 마크의 튜브를 자릅니다.
튜브 세그먼트를 헹구어 플랑크톤 세포를 제거하십시오. 화염 살균 포셉으로 튜브 세그먼트를 20 밀리리터의 멸균 희석수에 부드럽게 담근 다음 즉시 제거하십시오. 세그먼트를 10 밀리리터의 중화제에 넣으십시오.
화염 살균 포셉으로 튜브 세그먼트를 잡고 튜브의 모든 내부 영역이 긁힐 때까지 멸균 된 나무 어플리케이터 스틱으로 긁어 내십시오. 때때로 중화제 10 밀리리터에 스틱을 헹구고 세그먼트를 샘플 튜브에 다시 넣으십시오. 스크레이핑된 튜빙 세그먼트는 이제 10 내지 0 또는 제로 희석이다.
각 튜브를 30 플러스 또는 마이너스 다섯 초 동안 가장 높은 설정에서 소용돌이치십시오. 초음파 처리기 욕조에 매달려있는 튜브 랙에 튜브를 놓으면 욕조의 수위가 튜브의 액체 수준과 같을 수 있습니다. 45킬로헤르츠, 100% 전력, 30 플러스 또는 마이너스 5초 동안 정상 기능에서 초음파 처리.
이 소용돌이와 초음파 처리주기를 반복 한 다음 최종 소용돌이로 끝납니다. 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 트립틱 대두 한천 상에 플레이트한 다음, 튜브를 섭씨 36도 또는 영하 2도에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
사용된 도금 방법에 따라 콜로니를 계산하고 산술 평균을 계산하기 위해 데이터를 기록합니다. Danielle Or와 Blaine Fritz가 찍은 이 네 가지 이미지는 모두 이 수확 및 분해 절차의 중요성을 설명하는 데 도움이 됩니다. 이 네 개의 쿠폰 모두 소용돌이 및 초음파 처리 과정 전후에 쿠폰에 존재하는 슈도모나스 aeruginosa 생물막의 양을 시각화하는 데 도움이되도록 크리스탈 바이올렛으로 염색되었습니다.
쿠폰 A는 생물막으로 완전히 덮여 있는 반면, 쿠폰 B, C, D는 모두 표면에 생물막이 거의 없습니다. 쿠폰 B, C 및 D는 모두 이전에 설명된 와류 및 초음파 처리 과정을 거쳤다. 린지 밀러(Lindsey Miller)가 공초점 현미경으로 12.5X 배율로 촬영한 이 두 이미지는 백라이트 라이브/데드 얼룩으로 처리된 슈도모나스 aeruginosa 생물막을 묘사합니다.
왼쪽 이미지는 45킬로헤르츠와 10%전력으로 초음파 처리되었고, 오른쪽 이미지는 45킬로헤르츠와 100%전력으로 초음파 처리되었습니다. 분명히, 왼쪽의 쿠폰은 오른쪽의 쿠폰에 비해 표면에 훨씬 더 많은 생물막이 남아 있습니다. 이 최종 그림은 다른 초음파 처리 매개 변수의 조작이 쿠폰 표면에서 제거 된 Pseudomonas aeruginosa 생물막의 양에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.
이 쿠폰은 모두 45킬로헤르츠, 100% 전력, 30 플러스 또는 마이너스 5초 동안 정상 설정에서 초음파 처리되었습니다. 이 이미지는 Lindsey Miller에 의해 12.5X 배율로 촬영되었습니다. 한 줄의 쿠폰은 희석수에서 초음파 처리되었고, 두 줄의 쿠폰은 DE 중화 국물에서 초음파 처리되었습니다.
희석수에 비해 계면활성제를 함유하는 DE 브로스에서 초음파 처리된 쿠폰에 생물막이 더 적게 남아있는 것으로 보인다. 쿠폰 A, B, E 및 F는 모두 10 밀리리터 볼륨으로 초음파 처리되었으며 쿠폰 C, D, G 및 H는 40 밀리리터의 용액으로 초음파 처리되었습니다. 더 작은 볼륨으로 초음파 처리 된 쿠폰에는 분명히 생물막이 적습니다.
쿠폰 A, C, E 및 G는 한 번에 세 개의 튜브로 욕조에서 초음파 처리되었으며, 쿠폰 B, D, F 및 H는 한 번에 12 개의 튜브가있는 욕조에서 초음파 처리되었습니다. 더 적은 수의 튜브로 초음파 처리 된 샘플은 우수한 생물막 수확을 나타 냈습니다. 궁극적으로, 튜브 내의 부피를 최소화하고, 한 번에 초음파 처리된 튜브의 수를 줄이며, DE 중화 브로스의 사용은 모두 향상된 생물막 수확에 기여하는 것으로 보인다.
생물막을 수확하고 분해하는 완벽한 방법은 없지만 일부 접근법은 다른 표면 및 / 또는 응용 분야에 더 좋습니다. 이 비디오에서 입증 된 기술은 문헌 검토에 따라 가장 일반적인 세 가지 방법입니다. 이 세 가지 기술은 연구자를위한 출발점을 제공 할 수 있습니다.
선택한 수확 및 분해 방법을 검증하는 데 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 모든 장비는 약간 다르므로 방법이 표준화 되더라도 사용 된 장비의 프로세스를 확인하는 것이 현명합니다. 연구에 따르면 부적절한 선택은 편향된 테스트 결과로 이어질 수 있습니다.
이 비디오를 시청 한 후,이 정보는 연구자가 어떤 방법을 사용해야하는지에 대한보다 정보에 입각 한 결정을 내리고 세 가지 표면 유형 및 무료 수확 및 분해 기술에 대한 재현성 향상에 대한 지침을 제공하는 데 도움이되기를 바랍니다.
