많은 알레르겐은 소수성 분자를 결합합니다. 이 프로토콜은 이러한 리간드의 완전한 제거 및 교체를 가능하게 하여 체계적인 방식으로 구조 및 면역원성에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 역상 HPLC를 열 어닐링과 결합한 사용은 두 가지 장점이 있습니다.
그것은 내인성 리간드를 제거하고, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 바인딩 사이트를 열기 위해 리간드를 용해하는 데 도움이됩니다. 우리가 알레르기성에 기여하는 요인을 결정할 수 있는 경우에, 우리는 이 요인을 피하는 치료를 디자인할 수 있을지도 모릅니다. 많은 단백질은 강하게 유지되고 구조와 기능 둘 다에 영향을 미칠 수 있는 지질 리간드를 결합합니다.
우리의 방법은 이러한 상호 작용의 체계적인 연구를 할 수 있습니다. 많은 지질화물의 제한된 용해도 및 접근성은 로딩 공정을 저해할 수 있다. 이러한 리간드를 준비할 때주의하고 시스템별 적응의 필요성을 고려해야 합니다.
소수성 및 용해성 리간드와 함께 일하는 것은 일부 알레르기 학자 및 생화학자에 대한 조정이므로 샘플이 다른 단계에서 어떻게 생겼는지 보는 것이 유용 할 수 있습니다. 복제 식 및 정화 후, 총 부피가 2 밀리리터 미만으로 감소 될 때까지 스윙 버킷 로터에서 여러 원심 분리에 대한 10 킬로달톤 분자 량 차단이있는 원심 필터 장치에 12 밀리리터를 적용합니다. 결과 농축액을 250 x 10mm HPLC 시스템에 로드하여 C18 역상 크로마토그래피 컬럼을 장착하여 97%의 완충A와 3%버퍼 B.Elute Bla g 1을 분당 1.5 내지 4 밀리리터의 유량으로 평가하여, 표에 표시된 바와 같이, 280 나노미터에서 형광 흡수흡수를 이용하여 280 나노미터의 형광 흡수를 이용하여.
약 34~40분에서 시작하여 74% 이상의 완충B 농도는 각 Bla g 1 분획의 4밀리리터를 더 이상 수집하지 않습니다. 유리 테스트 튜브에 풀라 g 1 분획을 알리 쿼트. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고 두 개의 구멍으로 필름을 천공합니다.
그런 다음 샘플을 영하 80도에서 1시간 동안 동결하고 리오필라이저를 사용하여 그 결과로 생성된 탈립 단백질 샘플을 건조시로 건조시합니다. 예상 블라 g 1 수율을 결정하려면, 재접이식 버퍼의 5 밀리리터에서 lyophilized 제거 된 테스트 알리쿼트다시 일시 중단. 혼합물을 500밀리리터 비커에 넣고 250밀리리터의 물을 넣고 교반하고 간헐적인 소용돌이가 있는 뜨거운 접시에 섭씨 95도까지 가열합니다.
용액을 30~60분간 95도 유지한 후 수조가 실온과 서서히 평형화될 수 있도록 합니다. 용액이 냉각되면, 미립자를 제거하기 위해 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 아닐블라 g 1 지질 혼합물을 전달하고, 10킬로달톤 컷오프가 있는 새로운 원심 필터를 사용하여 여과된 단백질을 PBS로 3번 교환하여 잔류 지방산과 유기용매를 제거한다. 이어서, 표준 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도를 평가하여 남은 블라 g 1 알리쿼트에 대한 예상 수율을 결정한다.
Apo-Bla g 1을 재구성하려면 알리쿼트당 5밀리리터의 다시 접이식 버퍼로 블라 g 1 알리쿼트를 다시 중단하고, 시연된 대로 샘플을 음결한다. 인지질을 사용하여 Bla g 1을 적재하려면 원하는 화물 10밀리그램을 유리 테스트 튜브에 추가하고 클로로폼에 용해하고 클로로폼을 증발하여 지질 필름을 생성합니다. 그런 다음 튜브에 PBS를 추가하여 20 밀리머의 최종 인지질 농도를 생성합니다.
지질화물의 위상 전이 온도 위에 인지질을 가열하여 지질 필름을 재수화하고 용액이 흐리게 될 때까지 소용돌이를 가열합니다. 이어서, 예상 수율에 기초하여 블라g 1에 비해 20배 의 굴리 초과를 생성하기 위해 인지질화물을 첨가한다. 침전제가 형성될 수 있습니다.
소용돌이는 입증 된 바와 같이 단백질을 어닐링하기 전에 혼합합니다. 인-31 NMR에 의한 화물 제거 또는 적재를 확인하려면 원심 필터를 사용하여 시료를 100 마이크로몰라 이상으로 농축한다. 표시된 바와 같이 PBS 버퍼에서 알려진 농도의 기준 인지질 샘플을 준비하고, 약 600 마이크로리터의 총 부피에 초레이트 버퍼를 가진 1:1 비율로 블라 g 1 엔드 참조를 희석한다.
광대역 프로브를 사용하여 콜레이트 용해 블라 g 1 샘플 및 참조 인지질 표준의 1차원, 31-인 NMR 스펙트럼을 획득하고, 블라g 1 31인NMR 스펙트럼을 인지질 기준 시료에 대해 수득된 것과 비교하여 가시 피크의 화학적 변화에 기초하여 원하는 리간드의 내인성 바운드 리간드 및/또는 결합의 제거를 확인한 다음, 블라g 1 스펙트럼의 피크 강도를 포인지질 기준의 고유 강도를 완전한 확인을 허용한다. 친화성 크로마토그래피를 사용하여 재조합 GST Bla g 1은 높은 수준의 순도로 쉽게 분리되어 세포 배양 리터당 2 ~4 밀리그램의 수율을 생성할 수 있습니다. TEV 프로테아제와 함께 하룻밤 잠복은 GST 태그를 제거하기에 충분하여 약 24 킬로달톤의 최종 제품을 산출합니다.
블라 g 1을 역상 C18 컬럼에 적용하면 독특한 용출 프로파일을 생성하며, 50% 버퍼 B에서 두 개의 큰 피크가 있고, 아포-블라 g 1의 75% 버퍼 B.Phosphorus-31 NMR 스펙트럼에서 두 번째로 큰 피크는 감지 가능한 인지질을 나타내지 않습니다. 표준 곡선은 알려진 DSPC 농도의 참조 샘플을 사용하여 NMR에서 생성될 수 있다. DSPC Bla g 1로부터 얻은 인 31 신호 강도를 이 표준 곡선과 비교하여 단백질당 지질의 결합 스토이치오메트리를 산출하는 데 사용할 수 있다.
아포 및 지질로드 블라 g 1에 대한 원형 이색 스펙트럼은 주로 알파 -헬리칼 구조를 나타내는 220 및 210 나노미터의 미니마를 보여줍니다. 원형 이크로이즘 기반열 성소 해석은 또한 접힌 구형 도메인을 나타내는 알파-헬릭 이차 구조의 협동 손실을 나타낸다. 또한, 그 결과 용융 온도의 분석은 천연 알레르겐 소스에서 얻은 Bla g 1과 일치하는 nMix 리간드 결합시 상당한 증가를 나타낸다.
이 프로토콜의 성공은 소수성 리간드의 제한된 용해도와 Bla g 1 결합 공동의 접근 불가능한 특성을 모두 극복하는 능력에 의존합니다. 이 절차는 T 세포 증식 분석과 같은 면역 학적 연구를위한 기초를 놓고, 이 발생을 통해 감수화및 분자 메커니즘에 지질 리간드의 효과를 평가하기 위해. 추가 생물 물리학 적 assays와이 절차를 결합, 우리는 소수성 리간드의 결합은 에피토프 생성 및 알레르기성에 대한 잠재적 다운스트림 의미와 함께, 블라 g 1 안정성을 향상 것으로 나타났습니다.
